馬亞文，Bingling Xu，劉麗華

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 南寧 530021；2.Royal Brompton Hospital，England London SW3 6LY）

肺癌（lung cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率，是全球死亡率最高的癌癥之一，肺癌的5年生存率僅為19%[1]。手術(shù)、放療、化療和靶向治療是目前非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治療方式，然而晚期NSCLC的生存率仍較低，患者中位生存期僅為10～12 個(gè)月[2，3]。肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物顯著的耐藥性是晚期癌癥進(jìn)展的主要原因，目前急需探索新的治療方案，提高肺癌患者的生存期。AQP1 是存在于細(xì)胞膜上的水通道蛋白（aquaporins，AQPs）家族中成員，主要促進(jìn)水的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，并在細(xì)胞生命活動(dòng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-8]，AQP1 在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等都過度表達(dá)，并且已被證明是結(jié)腸癌患者預(yù)后較差的標(biāo)志物，但其在肺癌中的作用尚未完全明確?；诖?，本研究旨在探討AQP1 在NSCLC 患者胸膜中的表達(dá)情況及對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞凋亡、增殖功能的影響，以期為NSCLC的治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020年5月-2021年10月60 例內(nèi)科胸腔鏡下手術(shù)患者的胸膜組織進(jìn)行石蠟包埋切片，其中非小細(xì)胞肺癌胸膜組織標(biāo)本40 例，良性胸腔胸膜組織標(biāo)本20 例，患者年齡19～80 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心腦肝腎疾病者。

1.2 主要試劑及儀器 A549 細(xì)胞及專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司CM-0016）、AQP1 慢病毒及陰性對(duì)照病毒（上海吉?jiǎng)P基因公司）、CCK-8 試劑盒（meilunbio，大連美侖生物公司）、AQP1 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公司，MA5-25401）、AQP1 抑制劑BacopasideⅡ（上海MCE 公司，HYN6016）、胰蛋白酶消化液（0.25%）不含EDTA（索萊寶科技公司）、凋亡試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、多功能酶標(biāo)儀（美國雷杜Rayto RT-6100）、流式細(xì)胞儀（中國達(dá)科為生物公司）、DAB 顯色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，G1211）。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 采用S-P 法對(duì)患者標(biāo)本AQP1表達(dá)情況進(jìn)行測定，用4%的甲醛將收集的標(biāo)本進(jìn)行固定，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，并放入恒溫烤箱烤片，采用常規(guī)的操作對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化后，用PBS 溶液清洗，并用pH6.0的檸檬酸鈉鹽緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行高壓修復(fù)。然后將以下試劑依次進(jìn)行滴加，具體操作如下：內(nèi)源性過氧化物酶溶液、封閉用非免疫動(dòng)物血清、一抗孵育過夜、二抗孵育20 min、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白工作液孵育10 min、滴加DAB 顯色試劑（新鮮配置）顯色2 min、并在顯微鏡下進(jìn)行染色觀察、自來水沖洗、蘇木素進(jìn)行復(fù)染、1%鹽酸酒精分化2 s、自來水沖洗、脫水和透明處理、中性樹膠封片。

1.4 培養(yǎng)細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)的A549 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染AQP1（NM_198098）慢病毒和陰性對(duì)照病毒，轉(zhuǎn)染成功后，分別用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選穩(wěn)定株，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)效果。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)照組（正常細(xì)胞）、轉(zhuǎn)染過表達(dá)AQP1 及陰性對(duì)照病毒的穩(wěn)定株進(jìn)行培養(yǎng)，待匯合度達(dá)80%時(shí)，胰酶消化后利用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取相同數(shù)量的細(xì)胞接種到96 孔板中，每孔加100 μl 細(xì)胞懸液，各設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)基，加入100 μl含有10% CCK-8 增強(qiáng)型溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0.5 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度。

1.6 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集對(duì)照組和抑制劑組（加入AQP1 抑制劑BacopasideⅡ）的細(xì)胞，用0.25%EDTA-Free 溶液消化細(xì)胞，并收集至1.5 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，吸棄上清液，保留少量液體覆蓋細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 次，加入Annexin V-AF488 染料2.5 μl，避光染色15 min，加入400 μl Bindingbuffer，混勻后置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 結(jié)果判定 AQP1 陽性結(jié)果判斷：AQP1 蛋白在腫瘤組織中主要表達(dá)在細(xì)胞膜及細(xì)胞胞漿中。根據(jù)陽性細(xì)胞密度和著色深度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)陽性細(xì)胞密度評(píng)定：無陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)為0分，陽性細(xì)胞所占比例≤10%為1 分，11%～50%為2分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分；②根據(jù)染色程度進(jìn)行評(píng)分：強(qiáng)棕褐色評(píng)為3 分，棕黃色評(píng)為2 分，淡黃色評(píng)為1 分，無色評(píng)為0 分；兩項(xiàng)評(píng)分的乘積＜1 分為陰性，≥1 分為陽性表達(dá)，＜4 分為蛋白低表達(dá)，≥4 分為蛋白高表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析及作圖軟件均使用GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用方差分析（one-way ANOVA）；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用x2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1 在胸膜組織的表達(dá)比較 免疫組化分析顯示，良性胸膜組織標(biāo)本中AQP1 表達(dá)較少，非小細(xì)胞肺癌胸膜組織標(biāo)本中AQP1 表達(dá)呈強(qiáng)陽性，見圖1。且在非小細(xì)胞肺癌胸膜組中AQP1 陽性率為80%，良性胸膜組織中AQP1 陽性率為25%。

2.2 獲得病毒表達(dá)穩(wěn)定株 通過含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選，可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，熒光顯微鏡下能檢測到綠色熒光，見圖2。

2.3 過表達(dá)AQP1 促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖 相同的培養(yǎng)條件下過表達(dá)AQP1，結(jié)果可見過表達(dá)AQP1 能夠促進(jìn)A549 增殖，見圖3。

圖3 AQP1 對(duì)A549 細(xì)胞增殖的作用

2.4 抑制AQP1 表達(dá)促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，抑制劑組在抑制AQP1 表達(dá)后促進(jìn)了A549細(xì)胞早期和晚期的凋亡，對(duì)照組和抑制組早期凋亡率分別為0.96%、1.76%，晚期凋亡率分別為0.41%、0.52%，見圖4。

圖4 AQP1 抑制劑對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

肺癌是癌癥死亡的首要原因，NSCLC 約占肺癌總發(fā)病率的85%，其發(fā)病原因與吸煙、環(huán)境污染、呼吸道疾病等密切相關(guān)[9，10]。NSCLC 發(fā)病較為隱匿，患者確診時(shí)大多已處于中晚期狀態(tài)，只能通過化療、放療等方式延緩其生存期，其預(yù)后較差且病死率較高[11]。因此，探索NSCLC的進(jìn)展機(jī)制對(duì)改善肺癌患者的預(yù)后有重要作用。

AQPS 廣泛存在于人體組織中，是水快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在細(xì)胞新陳代謝、增殖和各種器官生理功能中發(fā)揮重要作用[7，12]。AQP1 是存在于細(xì)胞膜上水通道蛋白家族中的一員，主要促進(jìn)水的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛分布于內(nèi)皮、上皮和特殊細(xì)胞中，如紅細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等，參與多種病理和生理過程[13，14]。AQP1 已在多種腫瘤中被證實(shí)可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-17]。另外，AQP1 對(duì)腫瘤患者的預(yù)后具有一定影響，如研究發(fā)現(xiàn)AQP1 與胰腺導(dǎo)管癌的不良預(yù)后相關(guān)，在動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)中敲低AQP1可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18，19]。已有研究發(fā)現(xiàn)[4，20]，AQP1 是肺腺癌獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志，并可能通過細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性。

本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)AQP1 可以增強(qiáng)A549細(xì)胞的增殖能力，抑制AQP1的表達(dá)則促進(jìn)了A549細(xì)胞早期和晚期的凋亡，且與良性胸膜組織相比，NSCLC 患者胸膜組織中AQP1 呈高表達(dá)。據(jù)此，推測在NSCLC 中AQP1 可能通過抑制細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖能力。因此，AQP1 可做為癌癥治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，可通過降低其在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平來干預(yù)腫瘤的進(jìn)展。此外，已有研究表明AQP1 參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程[21]。而本研究收集的NSCLC組織標(biāo)本均已發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移，因此猜測AQP1 可能與NSCLC的胸膜轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，但AQP1 與胸膜轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未完全闡明，未來還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者的胸膜組織中AQP1 表達(dá)水平高于良性胸膜組織，且在外源性AQP1 刺激作用下能夠促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖，抑制AQP1的表達(dá)可促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡。但AQP1 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡影響NSCLC 進(jìn)展的具體信號(hào)通路及分子機(jī)制仍不清楚，其中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是抑制癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。