蒙 永 龍奕霄 蔣 霞

(1 廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧市 530021，電子郵箱：mengyong54321@163.com；2 廣西梧州紅十字會醫(yī)院藥學部，梧州市 543002；3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧市 530021)

瑤藥苦賴咪為蓼科植物羊蹄的根、葉，別名土大黃、水大黃、牛舌菜，盛產(chǎn)于廣西的龍勝、賀州、玉林、博白、金秀等市縣?，幩幙噘囘湮犊唷⑿院?，具有清熱解毒、涼血止血、通便、殺蟲止癢的功效，既往多用于治療咽喉腫痛、黃疸型肝炎、內(nèi)臟出血、衄血、便血、淋濁、子宮出血、癰腫疥瘡等病癥[1]。研究表明，該藥材中含有萘醌、蒽醌等成分并具有一定的抗腫瘤活性[2-3]。在參考其他研究有關中藥羊蹄醌類提取方法[4]的基礎上，本研究采用醇提再酸堿處理及有機溶劑萃取的方法獲得瑤藥苦賴咪的醌類提取物。此外，在抗腫瘤活性篩選的預實驗中，我們發(fā)現(xiàn)瑤藥苦賴咪的醌類提取物對人肝癌HepG2細胞敏感性最強，因此，本研究以人肝癌HepG2細胞為研究對象，分析瑤藥苦賴咪的醌類提取物對肝癌細胞的抗腫瘤活性，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 立式鼓風干燥箱(無錫瑪瑞特科技有限公司，型號：DHG-9070A) ；干燥箱(吳江市永聯(lián)機械設備廠，型號：DHG-9055A)；紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司， 型號：UV-8000型)； 生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司，型號：AC2-4S1)；CO2細胞培養(yǎng)箱(日本松下公司，型號：MCO-18AIC)；全波長全自動多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：Multiskan GO)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，型號：CKX53)；超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：NanoDrop One)；實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司，型號：LightCycler 480Ⅱ)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DB)。

1.2 藥材與試劑 苦賴咪藥材采自廣西來賓市金秀縣，經(jīng)梧州紅十字會醫(yī)院梁海雄副主任中藥師鑒定確認為茜草科巴戟屬植物蓼科植物羊蹄(RumexjaponicusHoutt.)后使用。大黃素購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110756-201913)。醋酸鎂、乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批號：8119431)、0.25%胰蛋白酶(批號：2120734)均購自美國Gibco公司；細胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學研究所(批號：KN658)；TRIzol試劑購自美國Life Technologies(批號：262312)；實時熒光定量PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(批號：7E402G0)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號：7E362L9)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 細胞系 人肝癌HepG2細胞株購自廣州速研生物科技有限公司，細胞系通過細胞遺傳質(zhì)量鑒定STR基因型檢測。

1.4 苦賴咪中總醌類成分的提取制備與質(zhì)量控制

1.4.1 提取制備：取苦賴咪藥材8.0 kg粉碎成粗粉，加8倍體積量95%乙醇回流提取3次，2 h/次，濾過，合并濾液得95%乙醇提取液；藥渣再加8倍體積的50%乙醇回流提取3次，2h/次，濾過，合并濾液得50%乙醇提取液；合并上述兩種提取液，濃縮至無醇味，濃縮液加2%氫氧化鈉水溶液調(diào)至pH 8～10，得堿水液。堿水液加氯仿萃取至最后的氯仿萃取液近無色，得氯仿萃取液，棄去氯仿液，取剩余的堿水液加2%鹽酸調(diào)至pH 4～6，加乙酸乙酯萃取至最后的乙酸乙酯萃取液近無色，得乙酸乙酯萃取液，濃縮、干燥，得藥材總醌提取物。

1.4.2 質(zhì)量控制：參考相關文獻[5]，以大黃素為對照，采用分光光度法對分離得到的總醌提取物中的醌類成分含量進行測定。(1)配制對照品溶液。 取大黃素對照品10.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得到0.42 mg/mL大黃素對照品溶液。 (2)繪制大黃素標準曲線。分別精密量取大黃素對照品溶液0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL移至10 mL容量瓶內(nèi)，加1%醋酸鎂-甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，于512 nm波長處測定吸光度。以大黃素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線圖，計算得到線性方程。(3)測定樣品中總醌含量。精密稱取“1.4.1”制備的藥材總醌提取物0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲提取30 min，放冷，加甲醇補至刻度，搖勻后過濾，取續(xù)濾液，精密量取續(xù)濾液1.00 mL移至10 mL容量瓶中，加1%醋酸鎂-甲醇溶液至刻度，搖勻，同時以1%醋酸鎂-甲醇溶液為空白對照，于512 nm波長處測定其吸光度，計算樣品中總醌的含量。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將人肝癌HepG2細胞置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(含100單位/mL青-鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于60%～80%濕度、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后，制備成5×105個/mL的細胞懸液，接種至96孔板(100 μL/孔)，置于細胞培養(yǎng)箱，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用DMEM培養(yǎng)基將苦賴咪總醌提取物稀釋為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的濃度(終濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，按100 μL/孔加入相應的細胞孔中，并設立對照組(僅加入DMEM培養(yǎng)基)，同一給藥濃度設置4個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，于450 nm波長下測每孔吸光度，計算細胞增殖抑制率，抑制率=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值)×100%。換算藥物半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC50)。實驗共重復3次。

1.6 細胞克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后，按500個/孔接種于6孔板中，于細胞培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。設立空白對照組和不同濃度苦賴咪總醌提取物組，苦賴咪總醌提取物組加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋后的苦賴咪總醌提取物(終濃度50 μg/mL、100 μg/mL)，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，按1 mL/孔加入相應細胞孔中，作用24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察克隆形成數(shù)及大小，直至出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)。磷酸緩沖鹽溶液清洗，多聚甲醛固定15 min后吉姆薩染色30 min，流水沖洗、晾干，顯微鏡下記錄大于50個細胞數(shù)的克隆數(shù)。實驗共重復3次。

1.7 細胞劃痕實驗 分為不同濃度苦賴咪總醌提取物組和空白對照組進行實驗。取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)，將密度為1×106個/mL的細胞懸液加入6孔板(2 mL/孔)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。當細胞匯合度達95%時，在細胞表面劃出直線劃痕，磷酸緩沖鹽溶液洗滌除去漂浮細胞，加入DMEM培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照并記錄位置?？噘囘淇傰崛∥锝M加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋后的苦賴咪總醌提取物(50 μg/mL、100 μg/mL)，按1 mL/孔加入相應細胞孔中，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在相同位置拍照。用Image J軟件量取劃痕中間的距離，細胞遷移率=(細胞遷移前的距離-細胞遷移后的距離)/細胞遷移前的距離×100%。實驗共重復3次。

1.8 實時熒光定量PCR實驗 預實驗中，使用50 μg/mL、100 μg/mL的苦賴咪總醌提取物進行干預，檢測結果顯示50 μg/mL的苦賴咪總醌提取物干預后目的基因表達無明顯差異，故本實驗中只選擇100 μg/mL濃度。取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)，將密度為1×106個/mL的細胞懸液按2 mL/孔加入6孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋為終濃度100 μg/mL的苦賴咪總醌提取物(2 mL/孔)，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，使用TRIzol法提取細胞總RNA，超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA純度及濃度，按照試劑盒說明書的步驟常規(guī)進行反轉錄獲得cDNA，加入腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α；NM_000594)和白細胞介素8(interleukin 8,IL-8；NM_000584)基因引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；NM_001256799)為內(nèi)參，通過SYBR qPCR 進行擴增PCR反應。反應體系共10 μL，包括cDNA樣本1μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、2×mix 5 μL、無酶水3.2 μL。PCR反應步驟：95℃ 5 min(變性)；95℃ 10 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s(擴增)，共40～45個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。實驗共重復3次。

表1 PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 標準曲線的繪制及總醌的測定結果 以大黃素濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，計算得線性方程A=9.9804C+0.0174(R2=0.9991)，可見大黃素濃度在0.016 8～0.025 2 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關系，見表2、圖1。 經(jīng)測定，藥材提取物中總醌的含量為52.31%，見表3。

表2 大黃素標準曲線表

圖1 大黃素測定標準曲線

表3 總醌含量測定結果

2.2 苦賴咪總醌提取物對HepG2細胞增殖作用的影響 隨著干預濃度的增加，苦賴咪總醌提取物對人肝癌HepG2細胞抑制作用總體呈增強的趨勢，25～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)苦賴咪總醌提取物的抑制作用呈濃度依賴性(見表4)，IC50為78.59～85.73(82.16±3.57)μg/mL。 選擇了增殖抑制率與30%、50%相近的藥物終濃度進行后續(xù)實驗，即50 μg/mL和100 μg/mL。

表4 不同濃度苦賴咪總醌提取物對HepG2細胞的增殖抑制率比較(x±s，%)

2.3 苦賴咪總醌提取物對HepG2細胞克隆形成能力和遷移能力的影響 作用HepG2細胞24 h后，與空白對照組相比，50 μg/mL、100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組細胞的克隆形成數(shù)減少，細胞遷移率降低，且藥物濃度越高，克隆形成數(shù)越少，細胞遷移率越低(均P<0.05)，見表5、圖2、圖3。

表5 3組HepG2細胞克隆形成數(shù)和遷移率的比較(x±s)

圖2 不同濃度苦賴咪總醌提取物對人肝癌HepG2細胞克隆的抑制作用(吉姆薩染色，×5)

圖3 不同濃度苦賴咪總醌提取物對人肝癌HepG2細胞遷移能力的影響(×10)

2.5 苦賴咪總醌提取物對HepG2細胞中TNF-α和IL-1基因表達的影響 與空白對照組相比，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組HepG2細胞中TNF-α mRNA相對表達水平升高，而IL-8 mRNA相對表達水平下降(均P<0.05)。見表6。

表6 兩組HepG2細胞中TNF-α和IL-1 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

根據(jù)醌類化合物的化學性質(zhì)特點，本研究采用先醇提再酸堿處理及有機溶劑萃取的方法，獲得瑤藥苦賴咪的總醌提取物，依據(jù)是：(1)本藥材含多種蒽醌、萘醌等化合物，這些化合物分別溶于不同濃度的乙醇中。根據(jù)這一特點，本研究采用了不同濃度乙醇(95%+50%)梯度提取的方法，提取到含有蒽醌、萘醌成分的乙醇粗提取物。(2)萘醌、蒽醌等化合物均具有酚羥基結構，易與氫氧化鈉反應轉化成鈉鹽，水溶性增強而溶于水。根據(jù)這一特點，本研究將乙醇粗提取物經(jīng)堿化后采用有機溶劑進行萃取，這是因為有機溶劑可將水溶性低的非醌類成分萃取分離，醌類成分則保留在堿水溶液中，從而達到將醌類成分與水溶性低的非醌類成分分離的目的。(3)堿水溶液中的醌類成分遇酸后再轉化回原酚羥基結構，水溶性降低。根據(jù)這一性質(zhì)特點，本研究將堿化并經(jīng)有機溶劑萃取后余下的堿水溶液進行酸化，再采用有機溶劑萃取，這是因為有機溶劑可將醌類成分萃取分離，水溶性高的非醌類成分則保留在酸水溶液中，從而達到將醌類成分與水溶性高的非醌類成分分離的目的。采用醇提再酸堿處理及有機溶劑萃取的方法提取瑤藥苦賴咪的總醌提取物，大黃素對照品濃度在0.016 8～0.025 2 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關系，經(jīng)測定提取物的總醌含量為52.31%，提示該方法操作方便，所得總醌含量穩(wěn)定，可為后續(xù)藥理藥效實驗劑量設計提供參考。

既往研究表明，天然來源的萘醌類可影響腫瘤細胞分裂及增殖，是治療腫瘤惡化的有效途徑[6-7]。有學者發(fā)現(xiàn)，朱砂七總蒽醌具有抑制荷瘤小鼠H22肝癌細胞[8]、S180肉瘤細胞[9]和人白血病HL-60細胞[10]的增殖并誘導其凋亡的作用，還可降低S180肉瘤小鼠乳酸脫氫酶活性。天然藥物總醌提取物中的萘醌、總蒽醌成分大多具有抗腫瘤作用，萘醌、總蒽醌結構可分為3部分，包括總醌母核、六元不飽和側鏈及側鏈羥基部分。部分總醌化合物的母核結構有親電性，能夠與生物體內(nèi)的親核物質(zhì)結合，誘導活性氧簇的產(chǎn)生，起到抑制腫瘤細胞增殖的作用[6]。而細胞增殖、遷移、集落形成等一系列行為是惡性腫瘤發(fā)展的關鍵[11]，因此天然藥材總醌提取物大多具有抗腫瘤活性。本研究考察了苦賴咪總醌提取物對人肝癌HepG2細胞惡性生物學行為的影響，結果表明苦賴咪總醌可顯著抑制人肝癌HepG2細胞的增殖、克隆和遷移能力，且具有一定的濃度依賴性，說明苦賴咪總醌提取物具有較好的抗腫瘤活性，為下一步分離純化苦賴咪醌類提取物中抗腫瘤活性物質(zhì)做準備。

TNF-α是重要的促炎細胞因子，它可以直接殺死腫瘤細胞并且對正常細胞不產(chǎn)生明顯的毒害作用。IL-8又稱為炎性趨化性因子，其可特異性地趨化中性粒細胞進入炎癥組織。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-8并不局限作用于中性粒細胞，其在支氣管上皮細胞、巨噬細胞、單核細胞等細胞中均有表達，并與多種腫瘤疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。IL-8在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種癌癥細胞中均呈高表達，原因可能是IL-8具有促進腫瘤的血管生成、有絲分裂以及腫瘤細胞增殖等作用[12]。因此，本研究選擇TNF-α、IL-8這兩個指標進一步探討苦賴咪總醌提取物抗肝癌活性的作用機制。結果顯示，與空白對照組相比，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組HepG2細胞中TNF-α mRNA相對表達水平升高，而IL-8 mRNA相對表達水平下降(均P<0.05)，由此推測苦賴咪總醌提取物可能通過上調(diào)TNF-α表達、下調(diào)IL-8表達而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，瑤藥苦賴咪總醌提取物可抑制人肝癌HepG2細胞的增殖、克隆和遷移能力，其或通過上調(diào)TNF-α表達、下調(diào)IL-8表達來發(fā)揮抗腫瘤作用。關于苦賴咪提取物對其他腫瘤細胞增殖及炎癥因子表達抑制作用所涉及的具體信號通路，還有待深入研究以探索。