仇薪鑫，賈燕青，張振倉(cāng)，楊增岐

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程學(xué)院/動(dòng)物疫病防控陜西省高校工程研究中心，陜西楊凌 712100； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種急性、接觸性、傳染性疾病，呈現(xiàn)高病死率，在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重威脅，我國(guó)將新城疫列為一類動(dòng)物疫病[1-2]。NDV感染宿主范圍較廣，病毒基因型及毒力差異較大，給防控造成了巨大困擾。建立一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)NDV強(qiáng)、弱毒株的方法對(duì)新城疫防控很重要。隨著ND發(fā)病情況和流行態(tài)勢(shì)復(fù)雜變化，血清學(xué)方法不能很好區(qū)分新城疫強(qiáng)、弱毒單一感染或混合感染，而其他毒力測(cè)定試驗(yàn)，如雞胚平均死亡時(shí)間、1日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)和6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)耗時(shí)費(fèi)力。RT-PCR檢測(cè)方法雖然能夠在臨床上快速檢測(cè)NDV，但一步法鑒別檢測(cè)NDV強(qiáng)弱毒株的報(bào)道較少[3-4]。

本試驗(yàn)基于前期對(duì)NDV各基因的研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株V蛋白在序列上存在差異，V蛋白拮抗干擾素(IFN)活性的能力可能存在病毒宿主來(lái)源差異，而且強(qiáng)毒株V蛋白的IFN拮抗能力強(qiáng)于弱毒株，不同病毒分離株的V蛋白編碼基因?qū)Σ《局虏⌒缘挠绊懘嬖诓町怺5]。為了滿足生產(chǎn)上對(duì)NDV快速高效鑒別檢測(cè)的需要，本研究基于V蛋白編碼基因建立了一種快速鑒別NDV強(qiáng)弱毒株的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9、弱毒株La Sota(疫苗)、中強(qiáng)毒毒株Blackbird/China/08、弱毒毒株Spotted-necked dove/China/08，傳染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus,IBDV)、傳染性支氣管炎病毒 (Infectious bronchitis virus,IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV) 均由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室保存并提供。

1.1.2 試劑 500 mL/L甘油PBS、青霉素、鏈霉素；Trizol、氯仿、異丙醇、750 mL/L乙醇；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 微量移液槍，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)RTC-100公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖 所有新城疫病毒均無(wú)菌接種至9日齡SPF雞胚尿囊腔，置37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)死亡的胚體，無(wú)菌收集24 h后死亡雞胚的尿囊液，置于-80℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)新城疫病毒的V蛋白編碼基因氨基酸序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物(表1)，序列中Y為C或T。實(shí)現(xiàn)一步法快速檢測(cè)NDV，并可區(qū)分強(qiáng)、弱毒株。

1.2.3 RNA提取 將樣品拭子渦旋振蕩1 min，充分?jǐn)D出液體，棄去拭子；吸取300 μL加700 μL Trizol，劇烈振蕩2 min，靜止10 min。加入250 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上層液體400 μL轉(zhuǎn)入新的無(wú)RNA酶滅菌離心管；加入等體積異丙醇，置-20℃沉淀30 min以上，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入1 ml DEPC處理的750 mL/L乙醇，輕輕晃動(dòng)，4℃、8 000 r/min離心5 min。棄去液體，自然晾干沉淀，用30 μL RNase-free water溶解，用于反轉(zhuǎn)錄或保存于-80℃。

表1 檢測(cè)引物

1.2.4 RT-PCR方法的建立 經(jīng)對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定RT-PCR反應(yīng)體系為：2×One-Step Reaction Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNA 1 μL，TransScript?One-Step Enzyme Mix 0.5 μL，RNase-free water 7.5 μL；擴(kuò)增條件：45℃ 20 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.5 特異性與敏感性試驗(yàn) 用建立的RT-PCR方法分別對(duì)IBDV、IBV、ILTV等核酸提取物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)引物的特異性。對(duì)NDV強(qiáng)、弱毒株RNA，將其含量統(tǒng)一稀釋至10 ng/μL后，進(jìn)行6倍倍比稀釋(100～10-6)，每個(gè)稀釋度分別取1 μL稀釋液作為模板，進(jìn)行敏感性測(cè)試。

1.2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn) 用建立的檢測(cè)方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期從臨床分離的2株新城疫病毒(中強(qiáng)毒毒株Blackbird/China/08和弱毒毒株Spotted-necked dove/China/08)進(jìn)行檢測(cè)。分別取新城疫F48E9毒株、LaSota毒株、臨床樣本毒株，重復(fù)檢驗(yàn)3次，檢測(cè)該方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 建立可區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒的RT-PCR鑒別檢測(cè)方法

根據(jù)已知NDV V蛋白編碼基因序列設(shè)計(jì)F0、R0、F1、R1 4條引物，其中F0、R0為通用檢測(cè)引物，F(xiàn)1、R1用于擴(kuò)增NDV強(qiáng)毒株特異性片段，2對(duì)引物同時(shí)用于鑒別NDV強(qiáng)、弱毒株。結(jié)果表明，F(xiàn)0和R0 2條引物可以擴(kuò)增出703 bp的目的條帶，F(xiàn)1和R1 2條引物可擴(kuò)增出456 bp的目的片段。用設(shè)計(jì)的2對(duì)引物可用于鑒定和區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株(圖1)，強(qiáng)毒株出現(xiàn) 2個(gè)目的條帶，分別是703 bp和456 bp，弱毒株只出現(xiàn) 1個(gè)703 bp的目的條帶。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；-.陰性對(duì)照；1.F48E9；2.LaSota

2.2 特異性試驗(yàn)

以NDV毒株F48E9、La Sota、Blackbird/China/08、Spotted-necked dove/China/08為模板，均可擴(kuò)增出特異性的目的片段(圖2、圖3)，而以IBDV、IBV、ILTV等為模板，均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，陰性對(duì)照也未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，表明建立的RT-PCR方法特異性較好。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；-.陰性對(duì)照；1.LaSota；2.F48E9；3.Blackbird/China/08；4.Spotted-necked dove/China/08；5.IBDV；6.IBV；7.ILTV

2.3 敏感性試驗(yàn)

提取的NDV F48E9株、La Sota株的RNA濃度依次為152.6 ng/μL、196.1 ng/μL，將其含量統(tǒng)一稀釋至10 ng后，分別按照6倍倍比稀釋后(100～10-6)，作為模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，以F48E9毒株為模板，6倍倍比稀釋后，與國(guó)標(biāo)通用引物(535 bp)對(duì)比，設(shè)計(jì)的引物(F0、R0)對(duì)NDV最小檢出量為0.01 ng/μL，國(guó)標(biāo)通用引物最小檢出量為0.1 ng/μL；本方法區(qū)分NDV強(qiáng)毒株、弱毒株RNA最小檢出量均為0.01 ng/μL(圖4、圖5)。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

經(jīng)加入2個(gè)臨床樣本毒株驗(yàn)證，本方法可準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株，對(duì)每份樣品重復(fù)3次檢測(cè)，結(jié)果一致，說(shuō)明建立的檢測(cè)方法具有可重復(fù)性(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；-.陰性對(duì)照；1.F48E9；2.LaSota；3.Spotted-necked dove/China/08；4.Blackbird/China/08；5.IBDV；6.IBV；7.ILTV

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000 ；-.陰性對(duì)照；1～7.F48E9，100～10-6 M.DNA Maker DL 5 000 ；-.Negative control；1-7.F48E9，100-10-6

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；-.陰性對(duì)照；L.LaSota；F.F48E9；1～7.10-0～10-6 M.DNA Maker DL 2 000；-.Negative control；L.LaSota；F.F48E9；1-7.10-0-10-6

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；-.陰性對(duì)照；1.LaSota；2.F48E9；3.Blackbird/China/08；4.Spotted-necked dove/China/08

3 討論

本研究用P基因編輯產(chǎn)生的V蛋白設(shè)計(jì)一步法快速檢測(cè)和區(qū)分強(qiáng)、弱毒株的方法[5]。設(shè)計(jì)的第1對(duì)引物(F0、R0)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出新城疫病毒，目的片段為703 bp，可作為通用引物用于NDV不同毒株的檢測(cè)，而第2對(duì)引物(F1、R1)只能在強(qiáng)毒中擴(kuò)增出456 bp大小的特異性條帶。因此，用2對(duì)引物可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)NDV的檢測(cè)及強(qiáng)、弱毒的區(qū)分，強(qiáng)毒株可擴(kuò)增出2個(gè)目的條帶(703 bp、456 bp)，而弱毒株只顯示1個(gè)目的條帶(456 bp)。用所建立的方法同時(shí)檢測(cè)F48E9、La Sota、IBDV、IBV和ILTV，發(fā)現(xiàn)IBDV、IBV和ILTV均為陰性，證明本方法可用于NDV和臨床常見(jiàn)家禽呼吸性病毒病的鑒別診斷。對(duì)不同稀釋倍數(shù)的RNA模板進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，引物(F0、R0)對(duì)NDV最小檢出量0.01 ng/μL，明顯高于國(guó)標(biāo)通用引物最小檢出量(0.1 ng/μL)，引物(F1、R1)區(qū)分NDV強(qiáng)毒株、弱毒株RNA最小檢出量均為0.01 ng/μL，表明本檢測(cè)方法具有較高的敏感性。用實(shí)驗(yàn)室前期分離的2株臨床毒株做驗(yàn)證性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本方法可準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株，并具有可重復(fù)性。

NDV逃避宿主免疫，突破宿主機(jī)體的天然免疫屏障，主要利用P基因編輯產(chǎn)生的V和W蛋白進(jìn)行調(diào)控，V 蛋白在干擾素拮抗、致病性和宿主嗜性等方面具有重要作用[6-10]。本研究基于V蛋白編碼基因建立的一步法RT-PCR檢測(cè)方法可用于新城疫強(qiáng)、弱毒株的快速鑒別檢測(cè)，對(duì)新城疫不同毒株致病性差異研究和臨床診斷均有應(yīng)用價(jià)值。