李雅心,郭 濤,胡瑞瑞,王小奎,米桃桃,倪 偉,胡圣偉
(石河子大學生命科學學院,新疆石河子 832000)
豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原體,PED以仔豬發(fā)熱、消化道黏膜發(fā)炎、劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水等為特征,易引起空腸和回腸內絨毛破壞及萎縮[1],是目前嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的傳染性疾病之一。PEDV侵襲世界各地豬群,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失[2]。與經典株及疫苗株的基因序列相比,全球PEDV流行株發(fā)生了很大程度的變異,其S基因序列與2010年前的毒株及經典疫苗株的同源性僅為93.3%~95.7%和93.8%~93.9%[3]。由此可見,用經典毒株制備的PED弱毒疫苗可能對新的PEDV變異毒株感染無完全保護力[4]。選擇當前流行株制備PED疫苗成為防控PED發(fā)生的關鍵。本研究通過分析2010年后國內PEDV流行毒株COE區(qū)氨基酸序列,得到COE區(qū)相對保守序列,用pET-32a原核表達系統(tǒng)表達COE融合蛋白,并進行目的蛋白的免疫原性分析,為后續(xù)PED亞單位疫苗的研制及抗體檢測方法的研究奠定基礎。
1.1.1 菌種、載體和試驗用動物 感受態(tài)細胞E.coliDH5α、TransB(DE3),原核表達載體pET-32a(+)均為石河子大學動物基因工程實驗室保存;3月齡外三元豬購自新疆石河子市某規(guī)模化養(yǎng)殖場。
1.1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoR、XhoⅠ和SolutionⅠ,TaKaRa公司產品;Protein Marker,北京全式金生物技術有限公司產品;質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,北京天根生化科技有限公司產品;酵母提取物和胰蛋白胨,OXOID公司產品;His標簽蛋白純化預裝柱HisTrapTMFF Crude,美國GE公司產品;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和羊抗豬IgG-HRP抗體,北京Solarbio科技有限公司產品;基因合成由上海生工生物工程有限公司完成。
1.1.3 主要儀器 微量移液器和PCR儀,德國Eppendorf公司產品;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司產品;高速臺式離心機,上海安亭科學儀器廠生產;凝膠成像系統(tǒng),美國伯樂公司產品;電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;普通細菌搖床,廣州艾卡儀器設備有限公司產品;酶標儀,美國Thermo Fisher Scientific公司產品。
1.2.1 PEDV S蛋白COE基因設計與合成 用生物學軟件DNAman 7.0對自2010年以后國內PEDV流行株COE(499aa-638aa)氨基酸序列進行同源性分析,選取相對保守毒株(GenBank登錄號:KU237224),根據大腸埃希氏菌對密碼子的偏好性優(yōu)化稀有密碼子,交由上海生工生物工程有限公司合成編碼CEO區(qū)的基因片段,并插入到pET-28a(+)質粒中,5′末端引入EcoRⅠ酶切位點和起始密碼子ATG,3′末端引入XhoⅠ酶切位點,該質粒命名為pET-28a-COE。
1.2.2 COE區(qū)生物信息學分析 COE蛋白的理化性質及蛋白結構由ProtParam、ProtScale等生物信息分析工具進行預測分析(表1)。
表1 生物信息分析工具
1.2.3 重組表達載體的構建 提取pET-28a-COE質粒與pET-32a(+)質粒,用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ在37℃條件下酶切2 h,酶切體系(總體積為20 μL):2 μL 10×Q buffer,1 μLEcoRⅠ,1 μLXhoⅠ,6 μL pET-28a-COE(pET-32a(+)),用ddH2O補足至20 μL。酶切產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。將回收的COE基因片段和pET-32a(+)載體在16℃連接4 h,連接體系(總體積為10 μL):5 μL Solution Ⅰ,2.5 μLCOE,2.5 μL pET-32a(+)。連接產物轉化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板,37℃培養(yǎng)過夜。次日,挑取單菌落,接種于10 mL LB培養(yǎng)基中,擴大培養(yǎng)后小提質粒,進行雙酶切鑒定,將初步鑒定正確的質粒所對應的克隆菌株交由北京睿博興科生物技術有限公司測序。測序鑒定正確的重組質粒命名為pET-32a-COE。
1.2.4 重組COE蛋白的原核表達與純化 將測序正確的重組質粒pET-32a-COE轉化至大腸埃希氏菌TransB(DE3)感受態(tài)細胞,涂布于含有Amp的LB平板過夜培養(yǎng),挑取單菌落,擴大培養(yǎng)后小提質粒,進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的重組菌株命名為pET-32a-COE-TransB(DE3)。取鑒定正確的陽性菌株于37℃振蕩過夜培養(yǎng)進行活化,次日按1∶100的比例轉接至50 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),37℃、180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm值為0.4~0.6時,添加誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,37℃誘導8 h后,8 000 r/min離心5 min收集菌體。加入裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 7.4),重懸菌體并于4℃過夜裂解,次日反復凍融3次后,冰水狀態(tài)下超聲破碎,超聲5 s,間隔5 s,破碎至液體澄清。12 000 r/min離心30 min,分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE(12%)分析重組COE蛋白的表達形式。采用GE公司His標簽蛋白純化預裝柱HisTrapTMFF Crude純化蛋白,經過透析和濃縮處理后,利用BCA蛋白定量試劑盒測定純化的COE蛋白濃度,置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 動物分組及免疫 挑選體重相近的3月齡外三元豬4頭,隨機分為2組,COE蛋白免疫組(P1、P2)和PBS免疫對照組(D1、D2)。蛋白經BCA法測定蛋白濃度后,與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后于豬頸部皮下多點注射免疫,免疫劑量為1 mg/頭,PBS免疫對照組以同樣方式注射等體積PBS溶液。免疫前及免疫后第14、21、28、35、42天于前腔靜脈采血3 mL,分離血清置-20℃保存。
1.2.6 ELISA檢測血清IgG抗體水平 以純化的重組COE蛋白為抗原,每孔加入100 μL(0.5 μg/L)包被ELISA板,4℃孵育過夜,次日棄去孔內液體,PBS′T洗滌3次,每孔加入200 μL封閉液(含50 g/L BSA的PBS′T),37℃孵育2 h后洗滌3次,每孔加入100 μL經8 000倍稀釋的血清,37℃孵育1 h后洗滌5次,每孔加入100 μL經2 000倍稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG,37℃孵育1 h后洗滌5次。每孔加入100 μL TMB底物緩沖液,37℃避光孵育15 min,每孔再加入50 μL終止液。在酶標儀450 nm波長處測定各孔OD值。評價COE蛋白免疫原性標準為免疫后血清樣品OD450(P)/免疫前血清樣品OD450 nm值(N)≥2且免疫前血清樣品OD450 nm值<1[5]。
參考GenBank中的PEDV S蛋白氨基酸序列,選擇499-638aa片段序列,優(yōu)化稀有密碼子后進行全基因合成(圖1) 。
COE基因編碼的蛋白含有140個氨基酸,分子式為C686H1022N164O215S4,分子質量約15 ku,等電點理論值為4.78。運用ExPASy protparam計算得出平均疏水指數(shù)為0.111,預測該蛋白是疏水性蛋白。利用SignalP-3.0中的神經網絡法(Neural Network,NN)進行信號肽分析,結果表明COE蛋白無信號肽序列。經SOPMA預測COE蛋白二級結構,結果顯示COE蛋白含有5% α螺旋,2.86% β轉角,45%延伸鏈和47.14%無規(guī)則卷曲。TMHMM工具分析提示COE蛋白無跨膜卷曲,屬于非跨膜蛋白。使用Abcpred軟件對該蛋白的B細胞抗原表位進行預測,將閾值設置為0.85,氨基酸長度為16個,結果顯示COE蛋白的B細胞抗原表位不小于0.85的共有5個(表2)。
圖1 合成序列
pET-28a-COE與pET-32a(+)質粒經EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后,成功獲得420 bp的目的基因與載體片段(圖2)。回收酶切產物并連接,將連接后的重組質粒轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,提取質粒酶切驗證(圖3),在420 bp處可見與預期相符的目的基因條帶,經測序比對發(fā)現(xiàn)與合成序列完全一致,表明pET-32a-COE載體構建成功。
表2 B細胞抗原表位預測結果
重組表達菌株pET-32a-COE-TransB(DE3)經過IPTG誘導后,超聲破碎裂解菌體,離心所得上清和沉淀通過SDS-PAGE鑒定,結果顯示沉淀樣品在預期35 ku處有目的條帶,說明COE蛋白主要以包涵體形式表達。用HisTrapTMFF Crude純化后獲得了相應大小的一條COE蛋白條帶,且純化效果較好(圖4)。BCA法測得純化濃縮后COE蛋白的濃度為1.85 mg/mL。
M.DNA 標準DL 2 000;1.pET-28a-COE質粒;2.pET-28a-COE質粒酶切;3.pET-32a(+)質粒;4.pET-32a(+)質粒酶切
圖2 pET-28a-COE與pET-32a(+)酶切結果
用ELISA方法檢測COE蛋白免疫后血清COE特異性IgG抗體含量水平,結果顯示,免疫后14 d對照組OD450 nm值無明顯變化,而COE蛋白免疫組OD450 nm值均顯著升高(P<0.01),且P/N≥2(表3)。免疫后42 d內抗體監(jiān)測結果顯示(圖5),COE蛋白免疫組與對照組相比,抗體水平明顯增加,表明COE重組蛋白免疫豬能夠刺激豬產生COE特異性IgG抗體,具有良好的免疫原性。
M.DNA標準DL 2 000;1.Plasmid pET-32a-COE;2.EcoRⅠ/XhoⅠ
M.蛋白分子質量標準;1.重組菌誘導前;2.重組菌誘導后;3.重組菌誘導后沉淀;4.純化后的COE重組蛋白
圖5 不同時間COE蛋白免疫組(P1、P2)和 PBS對照組(D1、D2)血清IgG檢測結果
基于經典毒株CV777和DR13制備的疫苗不能很好地對仔豬起到免疫保護作用,用變異毒株YC2014制備的滅活疫苗保護效果較好[6]。說明PED的發(fā)生是PEDV進化和變異為不同的基因型引起的,所以對于多樣化的PEDV毒株,傳統(tǒng)疫苗無法保護仔豬免受感染。S蛋白是影響PEDV毒力的關鍵蛋白,其遺傳變異往往造成毒株毒力的改變,但其COE區(qū)在不同基因型的PEDV毒株間相對保守[7],因此,COE蛋白是較好的PED疫苗候選抗原。
大腸埃希氏菌原核表達系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、表達量高、成本低、表達周期短等優(yōu)點,是外源病毒蛋白表達的首選表達系統(tǒng)[8]。本研究選擇可誘導機體產生中和抗體的最小片段COE區(qū),采用原核表達載體pET-32a(+),成功在體外表達并純化得到了PEDV變異毒株的COE蛋白,一方面可以作為制備PEDV變異毒株亞單位疫苗的候選,另一方面可以利用表達的蛋白建立檢測PEDV抗體的方法,為預防和控制該病提供技術支撐。
用原核表達得到的PEDV相關蛋白免疫小鼠后,檢測到融合蛋白均顯示良好免疫原性[9-10]。將PEDV Brl/87株的COE基因在煙草中表達,并通過動物試驗證實其具有良好的抗原性[11]。表達PEDVCOE基因的重組枯草芽孢桿菌口服后可以刺激豬高水平的局部及全身免疫反應,有可能成為對抗豬PEDV感染的候選疫苗[12]。有研究成功構建了表達PEDV N基因和中和抗原表位COE基因的重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)[13],用兩組重組菌分別免疫小鼠,檢測抗體水平發(fā)現(xiàn),既可刺激小鼠產生高效的全身免疫反應,還能引起局部黏膜免疫應答,具備研發(fā)成新型口服疫苗的優(yōu)勢。
本研究用生物信息學分析工具對PEDV COE蛋白親水性、空間結構預測等綜合分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白序列中存在多個抗原表位,為后期篩選抗原表位區(qū)域提供了方向。通過基因工程技術,獲得純化COE蛋白,免疫豬后檢測到血清中IgG抗體效價顯著升高,說明表達出的蛋白可以進一步研究以開發(fā)亞單位疫苗,為生產實踐中PED預防奠定基礎。