郝紅俠，任海燕，胡龍飛，劉旭東，趙紅瓊，郝智慧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，中獸醫(yī)藥研究中心，北京 100193； 3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)用生物制藥實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是引起臨床感染性疾病的重要的人獸共患病原菌，由于它多重耐藥、傳染性強(qiáng)且難以控制，臨床感染可引起膿毒癥、肺炎或奶牛乳房炎[1]等。動(dòng)物出現(xiàn)免疫功能減弱、反復(fù)感染、發(fā)病率和死亡率上升，給畜牧行業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前獸醫(yī)臨床對其感染的疾病治療可用的抗生素有限,尋找有效的耐藥抑制劑協(xié)同增效抗生素防控MRSA非常必要。本文從多種黃酮類中藥單體和海洋生物材料中篩選出可以增強(qiáng)頭孢噻呋鈉對MRSA敏感性的活性成分，為獸醫(yī)臨床針對MRSA感染治療提供輔助藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 MRSA菌株ATCC 33591購自上?？戮S化學(xué)技術(shù)有限公司，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213(Staphylococcusaureus)和臨床耐藥金葡菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 藥品與試劑 78種黃酮類中藥單體標(biāo)準(zhǔn)品購自成都瑞芬思生物科技有限公司，規(guī)格均為5 mg，具體名稱和批號(hào)為：原花青素(4852-22-6)，二氫楊梅素(27200-12-0)，巴西蘇木素(474-07-7)，血竭素高氯酸鹽(125536-25-6)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(7084-24-4)，西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮 (B20633-67-4)，山奈酚3-O-桑布雙糖苷(27661-51-4)，亥茅酚苷(80681-44-3)，丹皮酚(552-41-0)，葒草苷(28608-75-5)，蒿甲醚(71963-77-4)，水仙苷(604-80-8)，毛蕊異黃酮(241125-81-5)，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷(22688-79-5)，楊梅苷(17912-87-7)，千層紙素A-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷(36948-76-2)，5,7-二羥基色原酮(31721-94-5)，3′-羥基葛根素(117060-54-5)，三葉豆紫檀苷(6807-83-6)，斯皮諾素(72063-39-9)，甜橙黃酮(2306-27-6)，朝藿定A1(140147-77-9)，水飛薊亭(33889-69-9)，7-O-甲基芒果苷(31002-12-7)，朝藿定C(110642-44-9)，柯因二甲醚(21392-57-4)，百蕊草素I(40437-72-7)，遠(yuǎn)志山酮Ⅲ(162857-78-5)，5-O-甲基維斯阿米醇苷(84272-85-5)，曲克蘆丁(7085-55-4)，異葒草素(4261-42-1)，黃芪總黃酮，野鳶尾苷(491-74-7)，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(861691-37-4)，葛根素芹菜糖苷(103654-50-8)，異槲皮苷(482-35-9)，3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮(855-97-0)，新甘草苷(5088-75-5)，升麻素(80681-45-4)，白麻苷(18609-17-1)，扁蓄苷(572-30-5)，異橙黃酮(17290-70-9)，山奈苷(482-38-2)，芹糖異甘草苷(120926-46-7)，淫羊藿苷(110623-73-9)，黃杞苷(572-31-6)，芒果苷(4773-96-0)，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(29741-09-1)，王不留行黃酮苷(53452-16-7)，柚皮苷二氫查爾酮(18916-17-1)，6′′′-阿魏酰斯皮諾素(77690-92-7)，新橙皮苷(13241-33-3)，新芒果苷(64809-67-2)，漆黃素(528-48-3)，圣草次苷(13463-28-0)，新橙皮苷二氫查爾酮(20702-77-6)，異牡荊素(38953-85-4)，異鼠李素-3-O-新橙皮苷(55033-90-4)，大豆苷(552-66-9)，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(578-74-5)，香蒲新苷(104472-68-6)，落新婦苷(29838-67-3)，淫羊藿次苷(I56725-99-6)，橙皮苷520-26-3)，蘆薈苷B(28371-16-6)，銀椴苷(20316-62-5)，朝藿定A(110623-72-8)，桑皮苷C(102841-43-0)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷(60778-02-1)，異甘草苷(120926-46-7)，虎杖苷27208-80-6)，朝藿定B(110623-73-9)，羥基紅花黃色素A(146087-19-6)，甘草苷元-7-O-D-芹糖-4′-O-D-葡萄糖苷(74639-14-8)，香蜂草苷(14259-47-3)，黃豆黃苷(40246-10-4)，升麻素苷(17086-76-9)，杯莧甾酮(80681-45-4)。80種海洋生物材料LXQ-N由山東大學(xué)提供。頭孢噻呋鈉(89.4%，HBW180901-15)購自湖北威德利化學(xué)科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 雙人單面垂直超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱和生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；便攜式細(xì)菌濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 中藥單體用DMSO溶解配制成5 mg/mL的儲(chǔ)備母液，4℃冰箱儲(chǔ)存；海洋生物材料LXQ-N用DMSO溶解配制成5 mg/mL的儲(chǔ)備母液，4℃冰箱儲(chǔ)存；頭孢噻呋鈉配制成5 120 μg/mL作為儲(chǔ)備母液，在-20℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)測定 以MRSA菌株ATCC 33591作為試驗(yàn)菌株，用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法[2]進(jìn)行各中藥單體、海洋生物材料、頭孢噻呋鈉的MIC的測定。

1.2.3 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 為了檢測兩種活性成分聯(lián)合應(yīng)用后對MRSA的抗菌效果采用微量棋盤稀釋法[3]進(jìn)行，即中藥單體、海洋生物材料與頭孢噻呋鈉聯(lián)用。以金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為質(zhì)控菌株，MRSA菌株ATCC 33591為試驗(yàn)菌株。

菌懸液的制備：將凍存管里的ATCC 29213、ATCC 33591三區(qū)劃線接種于BHI瓊脂上，36℃培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落于MH肉湯中，36℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。調(diào)整濁度到0.5麥?zhǔn)蠞岫?濃度約108CFU/mL)，然后將該菌液稀釋100倍，使菌液濃度為106CFU/mL，作為試驗(yàn)菌液。

以MIC結(jié)果為參考依據(jù)，微量稀釋棋盤法采用96孔無菌微孔板，設(shè)計(jì)兩藥1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍和1/32倍MIC進(jìn)行聯(lián)合。兩種藥物分別再進(jìn)行稀釋，橫列稀釋中藥單體或海洋生物材料，在96孔板中進(jìn)行梯度稀釋，每孔50 μL?？v列加的是抗生素藥物，提前在離心管中進(jìn)行梯度稀釋，每種孔50 μL。試驗(yàn)菌液混勻后用8孔道移液器加入至96孔板的各孔中，每孔100 μL。同時(shí)設(shè)置中藥單體、抗生素的單獨(dú)MIC、陰性和陽性孔做對照。并置于36℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果并記錄。

FICI計(jì)算及結(jié)果判斷[4]：

FIC指數(shù)判讀標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，為協(xié)同增效作用；當(dāng)0.52時(shí)，為拮抗作用。

1.2.4 最小殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)上述結(jié)果，對頭孢噻呋鈉、原花青素的MBC和兩者聯(lián)用時(shí)的MBC進(jìn)行測定。以MRSA菌株ATCC 33591為試驗(yàn)菌株。取最后一個(gè)可見菌生長的含藥孔和隨后每個(gè)透明孔的培養(yǎng)物100 μL，均勻涂于MH瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

以肉眼觀察到無細(xì)菌生長的最小濃度為該藥的MIC，頭孢噻呋鈉對金葡質(zhì)控菌ATCC 29213的MIC分別為0.25 μg/mL，符合質(zhì)控范圍(表1)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、原花青素、二氫楊梅素、巴西蘇木素、血竭素高氯酸鹽對金葡菌有較好的抑菌作用，對ATCC 33591的MIC分別為400、100、100、25、25 μg/mL，與頭孢噻呋鈉聯(lián)合時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同或相加作用。而其他中藥單體對ATCC 33591的作用效果均不明顯，MIC值>200 μg/mL，F(xiàn)IC值為1.5，與頭孢噻呋鈉聯(lián)合作用時(shí)均呈現(xiàn)無關(guān)作用。

海洋生物材料LXQ-2、LXQ-3、LXQ-4、LXQ-8、LXQ-10、LXQ-15、LXQ-16、LXQ-19、LXQ-32、LXQ-33、LXQ-37、LXQ-38、LXQ-39、LXQ-40、LXQ-46、LXQ-69、LXQ-71、LXQ-76、LXQ-80、LXQ-84、LXQ-85、LXQ-89、LXQ-90、LXQ-93、LXQ-100、LXQ-116、LXQ-123對ATCC 29213的MIC均為200 μg/mL，對ATCC 33591的抗菌效果不明顯，而其他海洋生物材料未檢測到對金葡菌的抗菌效果。

表1 頭孢噻呋鈉單用及與中藥單體聯(lián)合對ATCC 33591的MIC和FICI測定結(jié)果

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 100μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能增強(qiáng)頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(即采用1/4 MIC濃度)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至0.125 μg/mL，F(xiàn)ICI為0.2539。表明100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷逆轉(zhuǎn)了ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥(CLSI規(guī)定對頭孢類抗生素的耐藥折點(diǎn)為4 μg/mL)。

2.2.2 二氫楊梅素與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 12.5μg/mL的二氫楊梅素能增強(qiáng)頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；12.5 μg/mL的二氫楊梅素(即采用1/8MIC濃度)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至8 μg/mL，F(xiàn)ICI為0.375。表明12.5 μg/mL的二氫楊梅素可以降低ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥。

2.2.3 原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 25 μg/mL的原花青素能增強(qiáng)頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；25 μg/mL的原花青素(即采用1/4 MIC濃度的)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至4 μg/mL，F(xiàn)IC為0.375。表明25 μg/mL的原花青素逆轉(zhuǎn)了ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥。

2.2.4 原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA和PRSA臨床菌株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 原花青素和頭孢噻呋鈉對20株山東豬源的臨床耐藥菌株包括10株MRSA(mecA+，blaZ+)和10株P(guān)RSA(blaZ+)的聯(lián)合抗菌結(jié)果見表2和表3。

具有mecA基因的MRSA臨床菌株對頭孢噻呋鈉大部分表現(xiàn)出高度耐藥，MIC值≥4 μg/mL。原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用后，10株MRSA臨床菌株菌里有8株菌的聯(lián)合耐藥指數(shù)為0.3125～0.5000，說明兩者之間具有良好的協(xié)同增效作用。對于blaZ基因陽性而mecA基因陰性的PRSA產(chǎn)酶菌株(10株)，原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用后，PRSA臨床菌株的聯(lián)合耐藥指數(shù)為0.625～0.750，說明兩者之間具有相加作用。原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)合用藥后，對MRSA臨床菌株呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，對PRSA臨床菌株呈現(xiàn)相加抗菌作用。

2.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果 頭孢噻呋鈉、原青花素對ATCC 33591的MBC分別為64 μg/mL和300 μg/mL。不同濃度的原花青素都能夠明顯降低頭孢噻呋鈉的MBC，100 μg/mL原花青素可使頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的MBC由64 μg/mL降至4 μg/mL，下降16倍。而加入50、25、12.5、6.25 μg/mL原花青素時(shí)，頭孢噻呋鈉的MBC分別為8、16、16、32 μg/mL，分別下降8、4、4、2倍，驗(yàn)證了原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591協(xié)同增效作用。

3 討論

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅素、原花青素、巴西蘇木素、血竭素高氯酸鹽對ATCC 33591的MIC分別為400、100、100、25、25 μg/mL；原花青素、二氫楊梅素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷這3種中藥單體與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應(yīng)用對ATCC 33591均具有明顯的協(xié)同增效作用，F(xiàn)IC分別為0.375、0.375、0.2539。其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對MRSA的協(xié)同增效抗菌效果比原花青素、二氫楊梅素明顯。巴西蘇木素和血竭素高氯酸鹽對ATCC 33591的抗菌效果非常顯著，但與頭孢噻呋鈉聯(lián)用是相加抗菌作用，單體均呈現(xiàn)無關(guān)作用；27種海洋生物材料對ATCC 29213抗菌效果良好，其MIC均為200 μg/mL，而對ATCC 33591的抗菌效果不明顯?？紤]到原花青素的藥理活性多，如抗菌、抗氧化活性、抗癌、抗高血壓、抗菌抗病毒等，且無毒，因此選用原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA和PRSA臨床菌株進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明兩者聯(lián)用對MRSA臨床菌株呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，對PRSA臨床菌株呈現(xiàn)相加作用。最小殺菌濃度(MBC)測定表明12.5 μg/mL原花青素可使頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的MBC值由64 μg/mL降至16 μg/mL。

表2 原花青素(PC)與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應(yīng)用對MRSA臨床菌株的MIC和FICI的測定結(jié)果

表3 原花青素(PC)與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應(yīng)用對PRSA臨床菌株的MIC和FICI的測定結(jié)果

巴西蘇木素作為抗菌的有效成分，其抑菌作用與文獻(xiàn)[5]報(bào)道相符。血竭素高氯酸鹽作為血竭的合成化合物，文獻(xiàn)[6]已報(bào)道了其抗金黃色葡萄球菌。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是花青素家族中的一員，其抗菌活性研究較少。二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌抗菌作用較好。這3種中藥單體與頭孢噻呋鈉聯(lián)用，均能減少頭孢噻呋鈉的使用量，降低了ATCC 33591對頭孢菌素類藥物的耐藥程度，有潛力成為耐藥菌MRSA的抑制劑，協(xié)同增效用藥已成為近年來削減細(xì)菌耐藥研究的重要領(lǐng)域。

中藥有效成分具有低毒價(jià)廉、不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥、抗菌作用顯著等特點(diǎn)[7]，國內(nèi)外對其協(xié)同增效抗生素的研究已有許多，如高良姜素[8]、青蒿琥酯[9]、異土木香內(nèi)酯[10]、金絲桃素[11]、安石榴苷[12]、紫檀芪[13]均可顯著增加β -內(nèi)酰胺類抗生素對耐藥菌的抗菌活性。

MRSA耐藥抑制劑的開發(fā)和利用會(huì)成為治療獸醫(yī)臨床MRSA感染性疾病的有力武器，本文探究了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅素、原花青素作為耐藥抑制劑的應(yīng)用潛力，為研發(fā)協(xié)同增效抗菌、遏制細(xì)菌耐藥性的抑制劑提供參考。