張召興，張艷英，賈青輝*，史秋梅*，劉 雪

(1.河北旅游職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系，河北承德 067000； 2.河北科技師范學院/河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北秦皇島 066604)

肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia屬于克雷伯菌屬，共有3個亞種，分別為肺炎克雷伯菌鼻硬結(jié)亞種、肺炎克雷伯菌肺炎亞種、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種[1-2]。肺炎克雷伯菌不僅能夠引起多種動物患病，而且也能導致人類患病，是一種人獸共患病病原。近年來肺炎克雷伯菌的感染率逐漸升高，已成為繼大腸埃希氏菌外又一個條件性致病菌[3-5]，由于抗菌藥物的使用不當，導致其產(chǎn)生廣泛的耐藥性。

氨基糖苷類藥物主要是由兩部分組成，其是一種苷類抗生素，包括氨基糖與氨基環(huán)醇，二者通過氧橋連接，有慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素等。氨基糖苷類藥物其具有抗菌譜廣，活性較強的特點，然而隨著氨基糖苷類抗生素的濫用，細菌對其逐漸產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，細菌對氨基糖苷類藥物的耐藥機制有很多種，但是臨床上細菌對氨基糖苷類藥物耐藥最重要的原因是產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶，其中最常見的是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因[6]。

近幾年,關(guān)于貉感染肺炎克雷伯菌的報道逐漸增多,但是關(guān)于耐藥性及耐藥基因報的較少。本試驗以臨床中分離的貉源致病性肺炎克雷伯菌為研究對象，進一步探討氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制，并對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性與耐藥基因檢測，并分析相關(guān)性，研究結(jié)果為貉肺炎克雷伯菌病的防控提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 57株貉源致病性肺炎克雷伯菌臨床分離菌株，由河北省預防獸醫(yī)重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂基礎(MIAC)均購于北京陸橋生化試劑有限公司；慶大霉素(CN)、阿米卡星(AMK)、鏈霉素(STR)、新霉素(NEO)、卡那霉素等氨基糖苷類藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DNA Marker DL 2 000,北京中科瑞泰生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix、ddH2O,北京康為世紀生物科技有限公司；梯度PCR儀,德國Eppendorf公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海恒科學儀器有限公司；常規(guī)的試劑及儀器由河北省預防獸醫(yī)重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種復蘇 將保存于-80℃的致病性肺炎克雷伯菌在麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂基礎(MIAC)培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落于有5 mL營養(yǎng)肉湯的10 mL管中，37℃進行擴大培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.2.2 藥敏試驗 取對數(shù)期的菌株，調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL，參照美國臨床實驗室標準化研究所推薦的KB藥敏紙片法對57株致病性肺炎克雷伯菌進行藥物敏感性試驗，抑菌圈直徑結(jié)果判斷以細菌敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)表示。

1.2.3 細菌基因組DNA的提取 利用水煮法提取，取菌液1 000 μL離心，水洗2遍，加200 μL無菌水放入水浴鍋100℃，10 min，取出后離心12 000 r/min，10 min留上清液，備用。

1.2.4 引物的設計 參照文獻[7-9]，設計氨基糖類藥物的耐藥基因aadA1、aadA2、StrA、StrB、aac2、aac4、aadB、aadD、npmA、ant-Ia、aac(3)-Ia、aac(6)-Ib引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.5 耐藥基因的PCR檢測 以提取的57株貉

源致病性肺炎克雷伯菌臨床分離菌株基因組DNA為模板對12種氨基糖苷類耐藥基因用降落PCR進行檢測。用10 g/L的瓊脂糖電泳檢測目的條帶，將檢測陽性的菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 將57株貉源致病性肺炎克雷伯菌臨床分離菌株對氨基糖苷類藥物耐藥性與攜帶耐藥基因進行統(tǒng)計，分析其相關(guān)性，計算其符合率。

2 結(jié)果

2.1 氨基糖苷類抗生素耐藥性檢測結(jié)果

57株致病性肺炎克雷伯菌對5種氨基糖苷類藥物產(chǎn)生一定的耐藥性。其中慶大霉素的耐藥率為54.4%，鏈霉素的耐藥率為49.1%，卡那霉素的耐藥率為22.8%，阿米卡星的耐藥率為8.8%，新霉素的耐藥率為12.3%(表1)。

表1 57株致病性肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類藥物的藥敏結(jié)果

2.2 氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測結(jié)果

臨床分離的57株致病性肺炎克雷伯菌的菌株攜帶多種耐藥基因，12種氨基糖苷類抗生素耐藥基因11種被檢測到(圖1)。57株致病性肺炎克雷伯菌的菌株耐藥基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌參考株的同源性為97.9%～99.9%。通過統(tǒng)計，耐藥基因aac(6)-Ib、aac4、aac2、aadB、StrB、aadA2、aadA1、StrA、ant-Ia、aac(3)-Ia、aadD的檢出率分別為78.9%、77.2%、71.9%、70.2%、63.2%、59.6%、54.4%、28.1%、24.6%、21.1%和12.3%。耐藥基因npmA未檢出(表3)。57株致病性肺炎克雷伯菌的分離菌株均含有多重耐藥基因，其中含有12，11，10，1種耐藥基因的致病性肺炎克雷伯菌的分離菌株均為0株，含有9、8、7、6、5、4、3、2、0種耐藥基因的菌株分別為5、3、10、16、6、10、3、3、1株，所占比例為8.8%、5.3%、17.5%、28.1%、10.5%、17.5%、5.3%、5.3%和1.8%。

2.3 耐藥性與耐藥基因相關(guān)性分析

通過對臨床分離的57株致病性肺炎克雷伯菌株進行耐藥表型及耐藥基因進行相關(guān)性分析。慶大霉素、卡那霉素均與aac2耐藥基因的符合率最高，分別為93.5%和84.6%，鏈霉素與StrB耐藥基因的符合率最高為85.7%，阿米卡星與aadA1、StrB、aac2、aac4耐藥基因的符合率最高，均為80.0%，新霉素與aadA1耐藥基因的符合率最高為85.7%，與其他耐藥基因無相關(guān)性(表4)。

M.DNA Maker DL 2 000 ; 1-12.Resistance genes aadA1,aadA2,StrA,StrB,aac2,aac4,aadB,aadD,npmA,ant-Ia,aac(3) -Ia,aac(6) -Ib,13.Blank control

表2 57株致病性肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結(jié)果Table 2 Detection results of drug resistance genes of 57 strains of pathogenic Klebsiella pneumoniae

表3 57株致病性肺炎克雷伯菌的多重耐藥基因檢測結(jié)果

表4 氨基糖苷類藥物的耐藥表型與耐藥基因符合率結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌主要引起毛皮動物的肺炎、子宮炎及其它化膿性炎癥等，其發(fā)病率也呈上升趨勢，僅次于大腸桿菌感染，是危害毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)主要的病原菌之一[10]。在毛皮動物的養(yǎng)殖過程中，伴隨著抗生素的廣泛應用，越來越多的克雷伯菌對各類抗生素產(chǎn)生了較為嚴重的耐藥性[11]，氨基糖苷類抗菌藥物具有高效、廣譜、作用廣泛等優(yōu)點，其抑菌機理主要通過破壞細菌細胞膜的完整性和抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，在人醫(yī)和動物臨床中被廣泛應用，主要用于革蘭氏陰性菌感染的治療[12]。在臨床中由于氨基糖苷類抗生素的不合理使用，對肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等產(chǎn)生很強的耐藥性。本試驗表明，臨床中分離的57株克雷伯菌對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素的耐藥率分別為54.4%、49.1%、22.8%、8.8%、12.3%，說明分離的57株貉源致病性肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生很強的耐藥性。山東地區(qū)分離的貂源肺炎克雷伯菌對阿米卡星、慶大等氨基糖苷類抗生素耐藥率均在70%，對其他藥物耐藥率較低[10]?？赡苡捎趯Π被擒疹愃幬锸褂们闆r有關(guān)。

氨基糖苷類的耐藥機制主要有兩種，一是細菌可產(chǎn)生鈍化酶使藥物失活；二是細菌產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素的修飾酶，主要包括磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶[10-12]。由于臨床中氨基糖苷類藥物的不合理的使用，致使細菌本身產(chǎn)生的氨基糖苷類鈍化酶，導致其病原菌對氨基糖苷類藥物 吸收量的減少，并引起 氨基糖苷類抗生素耐藥[13]。進一步探討肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥機制，并對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性與耐藥基因檢測并分析相關(guān)性。結(jié)果顯示，57株貉源致病性肺炎克雷伯菌耐藥基因aadA1，aadA2，StrB，aac2，aac4，aadB，aac(6)-Ib的檢出率在54.4%以上，其他耐藥基因檢出率為12.3%～28.1%，同時攜帶6種耐藥基因分離菌株有16株，占總菌株的28.1%，說明臨床分離的57株貉源致病性肺炎克雷伯菌攜帶耐藥復雜，呈現(xiàn)多種基因型。其分離菌株的慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素耐藥表型與耐藥基因aac2、StrB、aadA1、aac4的符合率均在80%以上，說明了57株致病性肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性與攜帶的耐藥基因aac2、StrB、aadA1、aac4有關(guān)，其產(chǎn)生的耐藥機制有待進一步研究。有報道人源肺炎克雷伯菌的耐藥基因aac(6)-Ib檢出率為 54.3%，氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥主要受aac(6)-Ib基因的影響[14]。從標本中分離出肺炎克雷伯菌40株對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因是攜帶aac(6)-Ⅰb基因有關(guān)[8]。本研究結(jié)果與以往的報道存在一定差異性，可能由于感染的宿主不同，攜帶耐藥基因不同，產(chǎn)生的耐藥性也有差異性。肺炎克雷伯菌攜帶耐藥基因是否調(diào)控其耐藥性有待一步研究。