鮑秀艷， 姚雪春， 史美君， 胡江春， 潘華奇*

(1.中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

巴弗洛霉素是一類核心骨架經(jīng)I型聚酮合成酶裝配合成的十六元大環(huán)內(nèi)酯，該家族化合物結(jié)構(gòu)多樣，是液泡型H+-ATPase的高效特異性抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于該酶的研究[1]。液泡型H+-ATPase參與了真核細胞的多種生理過程，因此巴弗洛霉素具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等[2-5]，是一類研發(fā)農(nóng)藥和醫(yī)藥的良好先導(dǎo)化合物。中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)微生物組(本課題組)前期從來源于我國南海1 464 m深海沉積物的卡伍爾氏鏈霉菌NA4(StreptomycescavourensisNA4)發(fā)酵液中，分離鑒定了兩個巴弗洛霉素單體化合物 bafilomycins B1和C1(圖1)，特別是bafilomycin B1 對許多鐮刀菌的抑制活性強于陽性對照藥物兩性霉素B[2]。在體內(nèi)盆栽實驗顯示巴弗洛霉素活性提取物對黃瓜霜霉病等防效顯著，其防效和對照藥劑稀酰嗎啉相當，有進一步研制成生物殺菌劑的潛力。然而較低的發(fā)酵單位是限制其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。目前，巴弗洛霉素類抗生素的生物合成基因簇已經(jīng)被鑒定[6-7]，其骨架由5個不同ORF含有的12個PKS模塊組成，以丁酰CoA等為起始單元，依次縮合丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA和甲氧基丙二酰ACP形成線性聚酮鏈(圖1)，然后在末端硫酯酶TE結(jié)構(gòu)域催化下，該聚酮鏈從PKS上解離下來，環(huán)化形成十六元環(huán)骨架——中間體bafilomycin A1，并最終經(jīng)氧化和環(huán)化等修飾機制形成復(fù)雜多樣的衍生物[8]。本課題組前期對野生株NA4進行了全基因組測定，通過生物信息學(xué)分析定位了巴弗洛霉素的生物合成基因簇(圖2)，并且利用SuperCos I構(gòu)建了野生株NA4的基因組文庫和建立了基因改造的遺傳操作體系[9]。

圖1 巴弗洛霉素B1和C1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of bafilomycins B1 and C1紅色標記為甲氧基丙二酰ACP前體來源的巴弗洛霉素延伸單元Red: bafilomycin extender unit from methoxymalonyl-ACP precursor

圖2 巴弗洛霉素生物合成基因簇中甲氧基丙二酰ACP生物合成位點及側(cè)翼區(qū)域Fig.2 Genetic organization of the methoxymalonyl-ACP biosynthesis locus and the flanking regions in bafilomycin biosynthetic gene cluste

聚酮類化合物的產(chǎn)量往往受到前體供應(yīng)的限制，通過強化前體供應(yīng)提高聚酮類化合物的產(chǎn)量是常用策略。因此，明確重要前體的供應(yīng)途徑是高產(chǎn)菌株構(gòu)建的基礎(chǔ)。巴弗洛霉素骨架結(jié)構(gòu)的生物合成前體3個?；鵆oA單元和1個甲氧基丙二酰ACP。其中3個?；鵆oA前體單元都可以通過微生物中心代謝產(chǎn)物乙酰CoA途徑合成，而通過許多研究表明前體甲氧基丙二酰ACP由FkbG、FkbH、FkbI、FkbJ和FkbK同源蛋白催化合成[10-11]。值得注意的是一些甲氧基丙二酰ACP的合成途徑并不在聚酮類化合物的合成基因簇內(nèi)[12]，野生株NA4的巴弗洛霉素合成基因簇外是否存在其他甲氧基丙二酰ACP合成途徑。同時羥基丙二酰CoA或甲氧基丙二酰CoA是否可以替代甲氧基丙二酰ACP參入到聚酮鏈的延伸中仍需要更多的證據(jù)。為此，構(gòu)建了ΔbafB-E突變株以研究野生株NA4合成巴弗洛霉素時關(guān)鍵前體甲氧基丙二酰ACP的來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 從中國南海(E 111°36.160′，N 17°59.928′)水深1 464 m的海底沉積物中分離得到卡伍爾氏鏈霉菌 NA4(StreptomycescavourensisNA4)[2]。遺傳操作過程中所使用的大腸埃希菌菌株(Escherichiacoli)和相關(guān)質(zhì)粒均由中國科學(xué)院南海海洋研究所鞠建華研究員贈予，保存于中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)微生物組，見表1。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB固體培養(yǎng)基；②SFM固體培養(yǎng)基：黃豆餅粉20 g，甘露醇20 g，自來水1 L，瓊脂2%；③NM2培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，乳糖10 g，甘油20 mL，大豆蛋白胨5 g，硝酸銨1.5 g，酵母粉3 g，1倍微量元素液(FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 L)0.2 mL，蒸餾水1 L，pH 6.0；④TSB培養(yǎng)基：大豆蛋白胨5 g，胰蛋白胨15 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO42.5 g，NaCl 5 g，自來水1 L，pH 7.0。

1.1.3 試劑與儀器 RNAiso Plus，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRaTaq、SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自Takara；抗生素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，工作濃度分別為阿泊拉霉素(Apramycin, Apr)50 mg/L、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)50 mg/L、氯霉素(Chloramphenicol, Chl)50 mg/L、卡那霉素(Kanamycin, Kan)50 mg/L、三甲氧芐胺嘧啶(Trimethoprim, TMP)100 mg/L。PCR儀(Eppendorf, Mastercycler gradient)；恒溫搖床(DHZ-C，太倉市實驗儀器有限公司)；低溫高速離心機(3K-15，Sigma)；核酸/蛋白質(zhì)檢測儀(NanoDrop 2000，ThermoFisher)；熒光定量PCR儀(LightCycler 96，Roche)；高效液相色譜儀(Ultimate-3000，Dionex)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)巴弗洛霉素生物合成基因簇的BafB-E的序列設(shè)計敲除引物，引物長58/59 bp，其中引物5′端39 bp與目的序列同源，3′端20 bp或19 bp序列與pIJ773 Apr抗性基因兩側(cè)序列同源；設(shè)計靶向BafB-E側(cè)翼序列的基因敲除檢測引物，野生株NA4與突變株P(guān)CR產(chǎn)物長度分別為3 798 bp及1 812 bp；設(shè)計靶向基因BafB的mRNA檢測引物，采用Primer 5.0軟件在線設(shè)計引物(引物序列見表2)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表2 引物

1.2.2 利用PCR-targeting 技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒 PCR-targeting技術(shù)操作方法見參考文獻[13]。本課題組前期篩選出覆蓋bafB-E基因的pC28-15D1為用于PCR-targeting的阻斷粘粒[9]。以質(zhì)粒pIJ773為模板，C28-baf_bafB-E_delF/R為引物，采用rTaqDNA聚合酶進行PCR擴增得到aac(3)Ⅳ+oriT片段(含Apr抗性基因序列)，膠回收擴增DNA片段備用；同時將覆蓋bafB-E基因的pC28-15D1轉(zhuǎn)化入E.coliBW25113/pIJ790中；接下來將aac(3)Ⅳ+oriT片段轉(zhuǎn)化入BW25113/pIJ790/pC28-15D1感受態(tài)細胞；在含Amp、Apr、Kan的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，重組為含Apr抗性片段的載體，命名為pC28-15D1-bafB-E，其中bafB-E基因被Apr抗性基因所取代；將pC28-15D1-bafB-E轉(zhuǎn)化入E.coliET12567/pUZ8002感受態(tài)細胞中，獲得ET12567/pUZ8002/pC28-15D1-bafB-E目標供體菌。

1.2.3 接合轉(zhuǎn)移 接合轉(zhuǎn)移操作方法參見文獻[14]，并做少量改良。E.coliET12567/pUZ8002/pC28-15D1-bafB-E在7 mL含Kan、Chl、Apr的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃生長過夜，按2%(體積分數(shù))接種量接種于50 mL 含Kan、Chl、Apr 的LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃生長至OD600為0.6時，離心收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基清洗2遍，重懸于1 mL LB培養(yǎng)基中，作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌；取甘油凍存的野生株NA4孢子，5 000 r/min離心8 min，棄上清，用TSB培養(yǎng)基洗滌2次除去甘油，重懸于TSB培養(yǎng)基，50 ℃熱激10 min，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 h進行預(yù)萌發(fā)，作為受體菌；取供體菌和受體菌各500 μL混合，涂布于SFM平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h后，用1 mL含2.5 mg Apr和1 mg的TMP的無菌水覆蓋，吹干，28 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.4 重組菌株的PCR鑒定 需鑒定的大腸埃希菌蘸取少量單克隆菌體，野生株NA4及ΔbafB-E突變株用牙簽直接刮取少量孢子，以上樣品置于含20 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的PCR管中，用PCR儀對樣品進行裂解，作為模板，裂解程序為80 ℃ 15 min，98 ℃ 15 min，4 ℃保存；然后利用PCR擴增進行鑒定。PCR體系：上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；模板1 μL；dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL；rTaq酶0.15 μL；10×buffer 1.5 μL；DMSO 1 μL；ddH2O補齊至15 μL。PCR反應(yīng)條件：第一階段(1個循環(huán))，95 ℃ 5 min；第二階段(30個循環(huán))，95 ℃ 40 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 2 min；第三階段(1個循環(huán))，72 ℃ 10 min。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 收集培養(yǎng)16～72 h后野生株NA4及ΔbafB-E突變株的菌體，按照說明書，采用Trizol法提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，以此為模板進行Real-Time PCR檢測。PCR體系：上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板1 μL,TB GreenPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,RNase Free H2O補齊至20 μL。PCR反應(yīng)條件：第一階段(1個循環(huán))，95 ℃ 30 s；第二階段PCR反應(yīng)(40個循環(huán))，95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min；第三階段熔解曲線(1個循環(huán))，95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s。

1.2.6 野生株NA4和ΔbafB-E突變株的發(fā)酵及HPLC分析 將野生株NA4孢子和ΔbafB-E突變株孢子接種于50 mL NM2培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min發(fā)酵7 d，發(fā)酵液加入等體積丁酮超聲萃取40 min，揮干，溶于100 μL甲醇中，進行HPLC-UV檢測。分析條件：YMC-Pack ODS 色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相A相：100%色譜甲醇；流動相B相：超純水(含0.05%的三氟乙酸)；梯度分析程序：0～30 min，A相/B相(體積比)為10∶90～98∶2；30～35 min，A相/B相(體積比)為98∶2～98∶2；35～40 min，A相/B相(體積比)為10∶90～10∶90。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔbafB-E突變株的構(gòu)建與鑒定

ΔbafB-E突變株的構(gòu)建示意圖如圖3，當使用檢測引物C28-baf_bafB-E_testF/R進行PCR擴增時，野生株NA4有一條3 798 bp的條帶，而目標重組載體和ΔbafB-E突變株條帶為1 812 bp。首先以質(zhì)粒pIJ773為模板，C28-baf_bafB-E_delF/R為引物，擴增Apr抗性基因片段，采用PCR-targeting技術(shù)獲得bafB-E基因被Apr抗性基因替換的E.coliBW25113/pIJ790/pC28-15D1-bafB-E工程菌株，菌落PCR鑒定結(jié)果顯示獲得目標陽性重組載體(圖4A)。然后提取pC28-15D1-bafB-E陽性重組子，成功轉(zhuǎn)化至E.coliET12567/pUZ8002中，得到ET12567/pUZ8002/pC28-15D1-bafB-E供體菌(圖4B)。最后將該供體菌與受體菌卡伍爾氏鏈霉菌 NA4接合轉(zhuǎn)移后涂布于含抗生素的SFM平板上，以Apr抗性基因篩選標記在培養(yǎng)4 d后生長出陽性接合子，以野生株NA4為對照，挑取4個ΔbafB-E突變株進行PCR鑒定，結(jié)果顯示ΔbafB-E突變株構(gòu)建成功(圖4C)。

圖3 ΔbafB-E突變株構(gòu)建策略Fig.3 Construction of ΔbafB-E mutant

圖4 重組載體及ΔbafB-E突變株電泳檢測圖Fig.4 Gel electrophoresis analyses of the recombinant cosmid and ΔbafB-E mutantA：PCR-targeting 獲得重組載體驗證結(jié)果；B：重組載體轉(zhuǎn)化E.coli ET12567/pUZ8002驗證結(jié)果；C：ΔbafB-E突變株驗證結(jié)果；ΔbafB-E：重組載體/突變株；WT：野生株NA4；M：DNA Marker(DL 2000)A: Recombinant plasmids were obtained by PCR-targeting; B:Recombinant plasmids were transformed into E. coli ET/pUZ8002; C：ΔbafB-E mutant; ΔbafB-E: recombinant plasmids/mutant; WT: wild stain NA4; M: DNA Marker (DL 2000)

2.2 轉(zhuǎn)錄水平驗證ΔbafB-E突變株

以野生株NA4為對照，挑取3個ΔbafB-E突變株在SFM平板上培養(yǎng)4 d，接種于NM2液體培養(yǎng)基，發(fā)酵16～72 h，取菌體提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以C28-baf_bafB-E_mRNAF/R為引物，以cDNA為模板進行Real-Time PCR檢測。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生株NA4中bafB基因在24 h時開始大量表達，特別在發(fā)酵48 h后巴弗洛霉素生物合成關(guān)鍵時期表達持續(xù)增強；而在ΔbafB-E突變株中，幾乎檢測不到bafB基因的表達(圖5)。以上結(jié)果說明重組載體pC28-15D1-bafB-E通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入野生株NA4中，發(fā)生了預(yù)期的同源重組，成功地獲得了bafB-E基因缺失的雙交換株。

2.3 bafB-E基因缺失對巴弗洛霉素生物合成的影響

進一步研究甲氧基丙二酰ACP生物合成基因缺失對卡伍爾氏鏈霉菌NA4中巴弗洛霉素生成的影響。以野生株NA4為對照，挑取3個ΔbafB-E突變株在SFM平板上培養(yǎng)4 d，接種于NM2液體培養(yǎng)基，發(fā)酵7 d后，HPLC分析bafB-E基因缺失對巴弗洛霉素產(chǎn)量的影響。如圖6所示，在相同的發(fā)酵條件、萃取方法和分析條件下，ΔbafB-E突變株發(fā)酵產(chǎn)物中巴弗洛霉素幾乎不產(chǎn)生，說明卡伍爾氏鏈霉菌NA4中bafB-E基因不僅參與了巴弗洛霉素生物合成，而且是野生株NA4生物合成巴弗洛霉素過程中甲氧基丙二酰ACP前體的唯一來源。

圖5 bafB基因mRNA表達水平Fig.5 The mRNA expression of bafB gene in strains***： 與對照組相比，P<0.001***： Compared with the control group P<0.001

圖6 野生型菌株及bafB-E基因缺失突變株發(fā)酵產(chǎn)物中巴弗洛霉素的HPLC分析圖譜Fig.6 HPLC analysis of bafilomycins from the wild strain and bafB-E mutant

3 討 論

巴弗洛霉素家族的化合物結(jié)構(gòu)多樣，生物活性廣泛，因此吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注。然而較低的發(fā)酵產(chǎn)量是限制巴弗洛霉素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸，因此越來越多的學(xué)者通過對巴弗洛霉素生物合成相關(guān)調(diào)控基因的改造，以期影響其發(fā)酵產(chǎn)量。γ-丁內(nèi)酯在大多數(shù)鏈霉菌中誘導(dǎo)次級代謝和產(chǎn)孢，AfsA家族蛋白是合成γ-丁內(nèi)酯的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)afsA同源基因stcA基因缺失菌株中，不僅影響了氣生菌絲形成和產(chǎn)孢能力，而且?guī)缀跬耆税透ヂ迕顾氐漠a(chǎn)生[15]。在海洋來源鏈霉菌ATCC BAA-1276中發(fā)現(xiàn)了一個luxR家族調(diào)控基因orf1和一個afsR家族調(diào)控基因bafG，通過基因失活和過表達，揭示了orf1和bafG對巴弗洛霉素生物合成的正向調(diào)控作用[16]。強化前體供應(yīng)是理性構(gòu)建高產(chǎn)菌株的重要策略，當前尚無報道在構(gòu)建巴弗洛霉素的高產(chǎn)菌株時使用該策略。

本研究通過構(gòu)建ΔbafB-E突變株，明確了野生株NA4生物合成巴弗洛霉素過程中bafB-F基因負責(zé)編碼催化甲氧基丙二酰ACP前體的唯一來源，沒有發(fā)現(xiàn)巴弗洛霉素生物合成基因簇外其他補償途徑的存在。這與已報道由1,3-二磷酸甘油酸生成甲氧基丙二酰ACP的生物合成途徑相同[11]。因此，推測在野生株NA4中，BafC作為一個離散的?；d體蛋白，裝載由BafE酶氧化甘油獲得的甘油酸脂。生成甲氧基丙二酸的后續(xù)步驟都被BafC的中間體進行催化。BafB將3-羥基氧化成醛，隨后醛轉(zhuǎn)化為羧酸，這種轉(zhuǎn)化是由酰基ACP脫氫酶BafD催化的。最后在BafF作用下甲基化生成甲氧基丙二酰ACP(圖7)。上述結(jié)果為巴弗洛霉素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供理論支持。

羥基丙二酰ACP作為稀有的聚酮鏈延伸單元前體也時有報道，在zwittermicin A的生物合成基因簇中以1,3-二磷酸甘油酸為底物，依次由?；d體蛋白ZmaD、去磷酸化酶ZmaN、NAD依賴的脫氫酶ZmaG和FAD依賴的脫氫酶ZmaE催化形成羥基丙二酰ACP單元[10]。在野生株NA4 巴弗洛霉素生物合成基因簇中，bafBCDEF編碼的途徑不僅可以生成最終的甲氧基丙二酰ACP，也可以形成羥基丙二酰ACP。本研究在實驗設(shè)計時將合成羥基丙二酰ACP的連鎖編碼基因bafB-E整體用Apr抗性替換，可以實現(xiàn)對巴弗洛霉素基因簇外其他來源的羥基丙二酰ACP和甲氧基丙二酰ACP做到同時驗證。本研究表明野生株NA4中不存在其他羥基丙二酰ACP生成的補償途徑，也沒有發(fā)現(xiàn)在甲氧基丙二酰ACP供應(yīng)中斷時，有羥基丙二酰CoA或甲氧基丙二酰CoA參與到巴弗洛霉素合成中的現(xiàn)象。

丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA、乙基丙二酰-CoA和甲氧基丙二酰ACP是PKS聚酮化合物生物合成過程中最常見的4種前體。甲氧基丙二酰ACP參與了多種聚酮類化合物的合成過程，包括apoptolidins、galbonolides、oxazolomycin等[12,17-18]。增加甲氧基丙二酰ACP的供應(yīng)可以顯著提高聚酮化合物的產(chǎn)量。如Rodriguez等[19]將吸水鏈霉菌中甲氧基丙二酰ACP生物合成通路特異性基因fkbG-K導(dǎo)入弗氏鏈霉菌染色體，使弗氏鏈霉菌中產(chǎn)生了1 g/L的聚酮化合物midecamycin類似物。FK506是一種有效的免疫抑制劑，具有廣泛的臨床應(yīng)用。甲氧基丙二酰ACP是FK506生物合成過程中模塊型PKS的擴展單元之一，研究發(fā)現(xiàn)增強甲氧基丙二酰ACP合成通路特異性基因的表達，能夠提高FK506的產(chǎn)量[20]。本研究發(fā)現(xiàn)在野生株NA4中，bafB基因表達水平在次級代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵時期持續(xù)增加，ΔbafB-E突變株中甲氧基丙二酰ACP途徑阻斷導(dǎo)致巴弗洛霉素不產(chǎn)生。提示增強甲氧基丙二酰ACP的供應(yīng)是顯著提高野生株NA4合成巴弗洛霉素產(chǎn)量的可行性方案。為理性構(gòu)建巴弗洛霉素高產(chǎn)菌株提供參考。

圖7 巴弗洛霉素基因簇中甲氧基丙二酰ACP的生物合成途徑Fig.7 Methoxymalonyl-ACP biosynthetic pathway of bafilomycin biosynthetic gene cluster