佟 童， 王 璇， 邵新宇， 李雨欣， 牛曉輝， 田思琪， 李祖明*， 張 弓， 劉 佳， 白志輝， 夏 然， 武志超

(1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.中加健康工程研究院(合肥)有限公司，安徽 合肥 230088；3.國貿(mào)食品科技(北京)有限公司，北京 102209; 4.中國科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085)

糖尿病是一種代謝疾病，分為1型糖尿病和2型糖尿病(T2DM)，隨著發(fā)病率的增加和發(fā)病人數(shù)的不斷上升，其已成為世界范圍內(nèi)主要公共問題之一[1-2]。在所有糖尿病患者中，T2DM患者約占90%[3]。T2DM是一種以高血糖、高血脂為特征的代謝疾病，主要由胰島素抵抗或胰島素分泌不足引起[4-5]。T2DM患者通常表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，并伴隨著高血壓、甘油三脂增加、高密度脂蛋白降低、高胰島素血癥及胰島素抵抗、胰島細(xì)胞功能減退、炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象，可導(dǎo)致代謝紊亂，如脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等代謝紊亂，還可引起心腦血管、腎臟功能衰竭和心臟病變等多種并發(fā)癥[3-4]。T2DM是復(fù)雜的基因環(huán)境相互作用的結(jié)果，不僅與人體基因有關(guān)，還與腸道微生物組有關(guān)[6]。人體的腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，是胃腸道穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，是影響人體健康的重要因素之一[6-7]。腸道菌群的紊亂會(huì)導(dǎo)致宿主系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡使致病菌得到生長的機(jī)會(huì)[8]。已有研究表明，可以通過改變腸道微生物來控制糖尿病等代謝疾病[9]。腸道菌群既能直接作用腸道中的上皮細(xì)胞，也能通過內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)影響宿主，從而達(dá)到改善T2DM患者空腹血糖、減少胰島素抵抗，還可降低膽固醇合成、預(yù)防和治療心血管疾病[10-12]。乳酸菌屬于益生菌，且在商業(yè)菌株中較為常見[13]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)人體機(jī)能、延緩衰老和預(yù)防疾病的作用，在抵抗糖尿病方面也越來越受到研究人員的重視[14]。由于外源益生菌和人體益生菌生長環(huán)境的不同，許多學(xué)者認(rèn)為益生菌最好來源于人體的胃腸道[15]。本研究利用北京聯(lián)合大學(xué)食品科學(xué)與工程一級(jí)學(xué)科食品安全團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的4株人源乳酸菌，包括2株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和2株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)制作的菌粉進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)2型糖尿病小鼠糖脂代謝的緩解效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 人源乳酸菌菌粉是由北京聯(lián)合大學(xué)食品科學(xué)與工程一級(jí)學(xué)科食品安全團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室從健康成年人體內(nèi)分離得到的菌株制成，其中含有2株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum11、Lactobacillusfermentum305)和2株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum22、Lactobacillusplantarum25)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 C57BLKS/J小鼠、db/db小鼠，6周齡，雄性，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 葡萄糖(北京化工廠)；胰島素(諾和諾德(中國)制藥有限公司)?？焖傺莾x(Accu-Chek Active，羅氏集團(tuán))；一次性無菌注射器(1 mL，江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(5804R，德國Eppendorf公司)；全自動(dòng)生化分析儀(7180，日本日立高新技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，12只C57BLKS/J小鼠作為空白對(duì)照組(NC)，24只db/db小鼠分為模型組(MC)、乳酸菌灌胃組(L)，每組12只。灌胃劑量：每種菌濃度為109cfu/mL，每只鼠每天10 mL/kg。NC組和MC組每天灌胃等劑量無菌生理鹽水，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行12周。

1.2.2 小鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量 每周稱量1次小鼠體質(zhì)量和飼料質(zhì)量，計(jì)算每周進(jìn)食量。

1.2.3 空腹血糖(FBG) 每周測(cè)量1次小鼠血糖。小鼠禁食6 h，用75%酒精對(duì)小鼠尾尖和采血針消毒，擠壓小鼠尾尖血滴于血糖試紙上，使用快速血糖儀讀取血糖讀數(shù)。

1.2.4 口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT) 口服糖耐量試驗(yàn)在小鼠干預(yù)第10周末進(jìn)行。小鼠禁食12 h后灌胃40%葡萄糖溶液(1 g/kg)，在0、30、60和120 min時(shí)尾尖取血，使用快速血糖儀測(cè)量血糖。將血糖值繪制曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)表示葡萄糖耐量。AUCglucose=0.5×((G0+G30)/2+(G30+G60)/2+(G60+G90)/2+ (G90+G120)/2)。式中，G0:0 min時(shí)小鼠血糖值，G30:30 min時(shí)小鼠血糖值，G60:60 min時(shí)小鼠血糖值，G90:90 min時(shí)小鼠血糖值，G120:120 min時(shí)小鼠血糖值。

1.2.5 胰島素抵抗試驗(yàn)(ITT) 胰島素抵抗試驗(yàn)在小鼠干預(yù)第11周末進(jìn)行。小鼠禁食6 h后，腹腔注射胰島素(0.75 U/kg)。在0、30、60和120 min時(shí)尾尖取血，使用快速血糖儀測(cè)量血糖。將血糖值繪制曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)表示葡萄糖抵抗能力。計(jì)算公式同1.2.4。

1.2.6 血生化指標(biāo)測(cè)定 將小鼠摘眼球取血于1.5 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/min離心10 min后取上清。使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和總膽固醇(TC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

各組小鼠體質(zhì)量變化如圖1所示，與正常小鼠相比，2型糖尿病小鼠體質(zhì)量顯著增加。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)MC組和L組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，L組小鼠體質(zhì)量低于MC組，但無顯著性差異。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body weight of mice不同字母表示顯著性差異(P<0.05),下圖同Significant difference(P<0.05) are indicanted with different letters,the same below

2.2 小鼠進(jìn)食量變化

各組小鼠進(jìn)食量變化見圖2，糖尿病小鼠的進(jìn)食量顯著高于正常小鼠。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，MC組小鼠一直保持較高進(jìn)食量，L組進(jìn)食量減少；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),L組的進(jìn)食量顯著低于MC組。

2.3 空腹血糖變化

各組小鼠空腹血糖變化如圖3所示，實(shí)驗(yàn)開始前糖尿病小鼠血糖顯著高于正常小鼠，且MC組和L組之間無顯著性差異。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，NC組小鼠血糖一直穩(wěn)定在正常水平。MC組小鼠血糖逐漸升高后保持在較高水平。L組小鼠血糖在實(shí)驗(yàn)前期逐漸升高后趨于平穩(wěn)，但實(shí)驗(yàn)后期L組小鼠血糖顯著低于MC組。

圖2 小鼠進(jìn)食量變化Fig.2 Changes in food intake of mice

圖3 小鼠血糖變化Fig.3 Changes in blood glucose of mice

2.4 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)

灌胃葡萄糖后小鼠血糖變化如圖4A所示，小鼠灌胃葡萄糖后30 min時(shí)，血糖達(dá)到最大值。MC組小鼠血糖達(dá)到最高后下降緩慢，120 min時(shí)血糖依然保持較高水平。L組小鼠血糖在30 min后下降，在60、90和120 min時(shí)，血糖低于MC組。曲線下面積(圖4B)顯示，MC組對(duì)葡萄糖耐量嚴(yán)重受損，L組對(duì)糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力有所修復(fù)。

圖4 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖變化和曲線下面積Fig.4 Changes of blood glucose and area under the curve of oral glucose tolerance test

2.5 胰島素抵抗(ITT)實(shí)驗(yàn)

小鼠注射胰島素后血糖變化如圖5A所示，NC組和L組小鼠血糖在注射胰島素30 min后，血糖達(dá)到最小值，在120 min內(nèi)恢復(fù)到初始血糖濃度。MC組小鼠在注射胰島素后60 min時(shí)，血糖達(dá)到最小值，說明MC組小鼠對(duì)胰島素抵抗嚴(yán)重。由曲線下面積(圖5B)可知，MC組對(duì)胰島素抵抗顯著高于NC組，L組卻顯著低于MC組。

圖5 胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)血糖變化(A)和曲線下面積(B)Fig.5 Changes of blood glucose (A) and area under the curve (B) in insulin resistance test

2.6 血清中血脂指標(biāo)變化

各組小鼠血清中血脂指標(biāo)如圖6所示。與NC組相比，MC組的LDL、TG、TC均顯著升高。與MC組相比，L組這3項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降。與NC組相比，MC組HDL顯著降低；與MC組相比，L組HDL有所增加但無顯著差異。

圖6 血清中血脂指標(biāo)Fig.6 Blood lipid index in serum

3 討 論

人類益生菌和腸道微生物組之間存在特定的相互選擇關(guān)系，這種關(guān)系可以促進(jìn)人類腸道的微生態(tài)平衡[16]。理想的益生菌應(yīng)該是人源益生菌，由于乳酸菌屬在人體中被發(fā)現(xiàn)，因此乳酸菌經(jīng)常被分離出來檢測(cè)其益生活性且嘗試將其作為益生菌[17]。通過補(bǔ)充乳酸菌來調(diào)節(jié)腸道菌群從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的是目前和將來發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)[15]。目前已有一些關(guān)于乳酸菌對(duì)糖尿病干預(yù)的研究。Kinariwala等[18]在乳品中分離了10株乳酸菌(L.fermentum、L.rhamnosus、L.helveticus、L.casei)等，研究其培養(yǎng)物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰腺脂肪酶活性的抑制效果。高偉華等[19]研究了從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出來的乳酸菌對(duì)高糖高脂2型糖尿病小鼠血脂的影響。曾珠等[20]研究表明傳統(tǒng)乳制品來源的10株乳桿菌可作為潛在的輔助降血糖的益生菌株。也有研究人員開展了人源乳酸菌在治療糖尿病方面的應(yīng)用。Panwar等[21]在嬰兒糞便中分離出了植物乳桿菌(L.plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，研究其抗糖潛力。Chen等[22]在人體糞便中分離出了鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus) Z7，通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估其抗糖潛力和益生特性。關(guān)于人源乳酸菌對(duì)糖尿病影響的研究較少，多菌株聯(lián)合干預(yù)的研究更少。

T2DM的主要特征是胰島β細(xì)胞受損、胰島素分泌不足，患者處于高血糖狀態(tài)[23]。糖尿病常見的急性代謝病之一就是高血糖，高血糖可使患者出現(xiàn)昏迷、休克、意識(shí)喪失等，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[24-25]。所以控制血糖在治療和預(yù)防T2DM中尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，與MC組相比，L組小鼠的血糖顯著下降，葡萄糖耐量和胰島素抵抗能力顯著提高，表明這4株人源乳酸菌菌粉對(duì)T2DM小鼠具有緩解作用。T2DM患者大多會(huì)出現(xiàn)血脂指標(biāo)失衡的病狀[26]。血脂異常一般表現(xiàn)為總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的異常[27]。糖脂代謝之間關(guān)系密切，控制血糖和控制血脂同樣關(guān)鍵。本研究中，與MC組相比，L組小鼠的血脂指標(biāo)得到顯著改善；L組低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯顯著降低，顯示這4株人源乳酸菌對(duì)血脂具有調(diào)節(jié)作用。

本文主要研究了4株人源乳酸菌對(duì)2型糖尿病小鼠在糖脂代謝方面的緩解效果，結(jié)果表明經(jīng)過4株人源乳酸菌菌粉灌胃后，2型糖尿病小鼠的血糖、進(jìn)食量、低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯顯著降低(P<0.05),葡萄糖耐量和胰島素抵抗能力顯著提高(P<0.05)，體重?zé)o顯著性變化，高密度脂蛋白增加但不顯著?？梢娺@4株人源乳酸菌對(duì)2型糖尿病小鼠具有緩解效果，為人源益生菌制品在2型糖尿病上的應(yīng)用提供了參考。但是關(guān)于這4株人源乳酸菌對(duì)2型糖尿病的影響還需要深入研究，探索其作用機(jī)制。