趙瑞華， 賀曉龍

(1. 延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2. 延安大學(xué) 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

羊肚菌(Morchella)又常稱為羊雀菌、羊肚菜或草笠竹等，菌蓋表面凹凸形成蜂窩狀似羊肚。其子實(shí)體富含優(yōu)質(zhì)蛋白、礦物質(zhì)和維生素等，風(fēng)味獨(dú)特、口感脆嫩，從古至今都是餐桌上的珍饈佳肴，同時(shí)具備抗氧化、抗病毒、提高免疫力和抑制腫瘤細(xì)胞等多種生理功能，是國(guó)內(nèi)外極珍貴的食藥用真菌，應(yīng)用前景廣闊[1-2]。研究表明，羊肚菌多變化的子實(shí)體外觀導(dǎo)致確定種類(lèi)比較困難，屬中種間關(guān)系也比較混亂。此外，羊肚菌作為一種珍稀食藥用真菌，明確其生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制和提高抗逆性等都是為提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值亟需解決的重要課題。因此，近年來(lái)在羊肚菌的分子鑒定、系統(tǒng)學(xué)研究、發(fā)育機(jī)制及功能基因等方面進(jìn)行了大量研究，并取得了一定成果，為羊肚菌的分子鑒定提供了新技術(shù)，較全面地揭示了其種群的遺傳多樣性，同時(shí)為該類(lèi)真菌的活性成分合成代謝調(diào)控、抗逆響應(yīng)、菌核發(fā)育和子實(shí)體發(fā)育等分子機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。本文分析總結(jié)了近年來(lái)羊肚菌屬的分子鑒定、系統(tǒng)學(xué)研究、活性成分及功能基因等分子生物學(xué)領(lǐng)域的文獻(xiàn)資料，為將來(lái)對(duì)羊肚菌的分子探索和栽培產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展提供新的認(rèn)識(shí)和參考。

1 羊肚菌分子系統(tǒng)學(xué)研究

1.1 羊肚菌屬分類(lèi)地位

羊肚菌屬隸屬子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)盤(pán)菌綱(Discomycetes)盤(pán)菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellacea)[3-4]。目前普遍認(rèn)為羊肚菌科分為三個(gè)屬：羊肚菌屬、皺盤(pán)菌屬(Disciotis)及鐘菌屬(Verpa)[5]。其中羊肚菌屬準(zhǔn)確名稱依據(jù)《國(guó)際藻類(lèi)、真菌、植物命名法規(guī)》和系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)中的規(guī)定應(yīng)為MorchellaDill. ex Pers.。在羊肚菌科的三個(gè)屬中，以羊肚菌屬的營(yíng)養(yǎng)方式、生活史因受生活環(huán)境及地理變化等諸多要素影響變得最為復(fù)雜，具有非常豐富的物種多樣性。

1.2 羊肚菌屬種類(lèi)劃分和遺傳多樣性

人們對(duì)羊肚菌屬的種類(lèi)鑒定及其類(lèi)群劃分一直存在著爭(zhēng)議。早期傾向于先根據(jù)子實(shí)體形態(tài)進(jìn)行初步區(qū)分，并在此基礎(chǔ)上再劃分為4個(gè)主要類(lèi)群，包括黑色羊肚菌群(Black Morels)、紅褐色羊肚菌群(Red Morels)、黃色羊肚菌群(Yellow Morels)及半開(kāi)羊肚菌群(Semi-free Morels)[6-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬的聚類(lèi)結(jié)果與地理間距有著顯著的相關(guān)性，由此把我國(guó)現(xiàn)有記載的羊肚菌種類(lèi)合為兩個(gè)復(fù)合種群[9]。而對(duì)羊肚菌屬種的鑒定一直在探究新的手段。近年來(lái)，分子標(biāo)記基因測(cè)序?yàn)檠蚨蔷鷮俚姆诸?lèi)鑒定提供了更為有效的技術(shù)手段，目前研究者己經(jīng)完全傾向于利用多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析(如ITS、ef1-α、rpb1、rpb2、LUS等)將該屬劃分成三個(gè)支系，分別為黑色羊肚菌支系(Elata Clade)、黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)以及變紅羊肚菌支系(Rufubrunnea Clade)[10-13]。

目前進(jìn)行的羊肚菌遺傳多樣性的研究多基于簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子標(biāo)記。應(yīng)用此法，劉文叢等[9]對(duì)云南西北地區(qū)的50多株野生羊肚菌進(jìn)行了遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該屬種群內(nèi)的遺傳分化程度要低于種群間。He等[14]和Du等[15]首次對(duì)同一地理區(qū)間內(nèi)兩種羊肚菌種群間的遺傳多樣性進(jìn)行了探究，證明兩個(gè)種群存在顯著差異，也說(shuō)明二者作為同源物種卻有著不一樣的潛在進(jìn)化史。還有研究基于ISSR分子標(biāo)記對(duì)來(lái)源于不同單孢及萌發(fā)孔菌絲的166株羊肚菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同物種間的單孢菌株和單絲菌株的遺傳差異顯著，同一單孢不同萌發(fā)孔菌絲的菌株間有著較大的遺傳分化現(xiàn)象[16]。利用ISSR分子標(biāo)記的研究結(jié)果顯示了羊肚菌屬具有極其豐富的遺傳多樣性，即使同類(lèi)群也存在較大差異，在黑色類(lèi)群中梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)比六妹羊肚菌(Morchellasextelate)具有更廣泛的遺傳背景。

2 羊肚菌的分子鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)免疫分析、同工酶分析及核酸分析等技術(shù)手段普遍運(yùn)用于羊肚菌分子鑒定、分子系統(tǒng)學(xué)的探究。其中核酸分析技術(shù)運(yùn)用較多，核酸序列同源性為傳統(tǒng)的羊肚菌系統(tǒng)學(xué)分析提供了最顯著的證據(jù)。核酸分析初期主要以rDNA 基因間隔序列(ITS)為主，大量分析結(jié)果也證實(shí)ITS序列適用于區(qū)分種間差異[17-21]。但有研究發(fā)現(xiàn) ITS序列無(wú)法用在黑色羊肚菌類(lèi)群相關(guān)種類(lèi)的區(qū)分中[22]。而桂明英[23]基于自測(cè)ITS序列并結(jié)合基因庫(kù)數(shù)據(jù)研究了云南省西北地區(qū)21個(gè)羊肚菌樣品的系統(tǒng)發(fā)育，結(jié)果證明ITS序列能夠?qū)⒏鱾€(gè)樣品很好地區(qū)分開(kāi)，但不能將目前由形態(tài)學(xué)建立的各個(gè)種群更好地分開(kāi)；劉文叢等[24]基于ITS序列分析也認(rèn)為該區(qū)域的野生羊肚菌屬分子鑒定結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)的分類(lèi)結(jié)果存在差異。2000年，國(guó)外有學(xué)者提出了多基因聯(lián)合分析法進(jìn)行物種界定，該方法的出現(xiàn)也為羊肚菌屬的分類(lèi)研究提供了新思路[25]。在O′ Donnell 首先利用LSU+ef1-α+rpb1+rpb2四基因片段聯(lián)合起來(lái)對(duì)羊肚菌屬系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究后，這種方法被廣泛應(yīng)用[26-29]。在此基礎(chǔ)上，杜習(xí)慧等[30-31]在研究中則采用了五基因聯(lián)合分析，認(rèn)為該屬由包括33個(gè)黑色羊肚菌、27個(gè)黃色羊肚菌和1個(gè)變紅羊肚菌的支系構(gòu)成，在這61個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種中我國(guó)共分布有30個(gè)。熊川等[32]應(yīng)用此法對(duì)采自四川南充的一株羊肚菌進(jìn)行分子鑒定后，歸入黃色羊肚菌支系。

核酸分子標(biāo)記為羊肚菌種質(zhì)資源鑒定提供了一類(lèi)既科學(xué)合理又快速簡(jiǎn)便的方法。此類(lèi)方法中使用最多的一種是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子標(biāo)記法，如Shen等[33]篩選出一對(duì)用于擴(kuò)增羊肚菌190 bp ITS片段的引物MS1F/MS1R，能夠便捷地進(jìn)行羊肚菌的鑒定。孟清等[34]則通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自青海大通縣的小海綿羊肚菌的菌絲體進(jìn)行了分析，闡明了菌絲體轉(zhuǎn)錄組SSR的總體特征，挑選出適合開(kāi)展種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析的幾對(duì)高頻率、高多態(tài)性的SSR引物分子標(biāo)記。多基因聯(lián)合矩陣序列分析及核酸分子標(biāo)記技術(shù)的探索，可以對(duì)羊肚菌進(jìn)行較為準(zhǔn)確快速地分子鑒定，這給羊肚菌種質(zhì)資源的科學(xué)利用提供了更可靠的參考依據(jù)。

3 羊肚菌功能基因研究

自發(fā)現(xiàn)羊肚菌以來(lái)，雖然人們對(duì)其探究的歷史已達(dá)上百年，但有關(guān)羊肚菌完整生活周期及遺傳機(jī)制等問(wèn)題至今沒(méi)有明確。在分子水平上探索羊肚菌的發(fā)育機(jī)制，分析羊肚菌染色體組型與遺傳圖譜，克隆與重組相關(guān)功能基因，進(jìn)行功能研究顯得尤為重要。

3.1 生活史

羊肚菌是具有復(fù)雜生活史的子囊菌，雖然早于1990年Volk等[35]就認(rèn)為該類(lèi)真菌具有較完整的生活史，但至今很多問(wèn)題未明，對(duì)該領(lǐng)域的探索一直在進(jìn)行中。曾有研究基于羊肚菌交配位點(diǎn)處的基因序列設(shè)計(jì)引物，用以研究亞歐地區(qū)14個(gè)羊肚菌種群的二百多個(gè)子囊孢子的交配型，在分子水平上顯示該類(lèi)真菌繁殖方式為異宗結(jié)合，且在其生活周期的大部分階段存在方式為單倍同核體[36]。另有研究運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)同一梯棱羊肚菌不同極性單孢測(cè)序，并對(duì)基因功能進(jìn)行注解，明確了該羊肚菌中不同交配型單孢間的基因區(qū)別[37]。賀新生等[38]通過(guò)對(duì)9個(gè)羊肚菌物種的研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌單孢培養(yǎng)物菌絲間不發(fā)生有性融合，單個(gè)孢子自身可孕進(jìn)而單孢出菇。這些研究對(duì)該類(lèi)真菌的生活周期產(chǎn)生了新的認(rèn)知，對(duì)其生活史的認(rèn)真探究有助于羊肚菌栽培產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展。

3.2 凝集素合成相關(guān)基因

動(dòng)植物和微生物體內(nèi)普遍存在凝集素，該物質(zhì)是一類(lèi)具有抗菌、抑制腫瘤及提高免疫力等功效的糖蛋白，含有糖基特異性識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域[39]。在大型食藥用真菌中凝集素的種類(lèi)非常豐富，對(duì)其研究已成為近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)，通過(guò)凝集素編碼基因MIL的克隆外源表達(dá)是獲得該類(lèi)物質(zhì)的一種方式。舒芳等[40]通過(guò)克隆獲取了梯棱羊肚菌凝集素MIL基因片段后，就其生長(zhǎng)發(fā)育不同階段中此基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其可能在菌核形成和幼菇階段起到關(guān)鍵的調(diào)控功能；就該基因可溶性重組蛋白MIL-His的凝血和免疫活性研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白既對(duì)兔紅細(xì)胞有著非常顯著的凝集活性，也增強(qiáng)了小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖率的活性。上述研究為開(kāi)發(fā)羊肚菌凝集素的藥用價(jià)值提供了一定的基礎(chǔ)，但目前關(guān)于羊肚菌凝集素的研究報(bào)道較少，其分子調(diào)控機(jī)理尚不明確，需進(jìn)行深入研究。

3.3 漆酶合成相關(guān)基因

漆酶屬于銅藍(lán)氧化酶類(lèi)，可參與木質(zhì)素的氧化分解，對(duì)真菌分解利用木質(zhì)纖維素起著重要作用[41]。典型的漆酶通常屬于輔助活性酶第一家族第一亞族(AA11家族)，部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。早期Kellner等[42]曾從羊肚菌科中克隆到多銅氧化酶基因并進(jìn)行了測(cè)序，但并未對(duì)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。近期對(duì)梯棱羊肚菌“川羊肚菌1號(hào)”(SCYDJ1-A1)全基因組的研究發(fā)現(xiàn)其缺乏AA11家族的漆酶基因，只有兩個(gè)AA13家族和一個(gè)AA12家族的多銅氧化酶基因[43]。在人工栽培中AA13家族的MiLacA基因表達(dá)水平遠(yuǎn)高于同家族的MiLacB，純化酶的生化特性表明該酶同時(shí)具有漆酶和多酚氧化酶活性，能被Fe2+強(qiáng)烈抑制，熱穩(wěn)定性在目前已知的漆酶中處于前列，在梯棱羊肚菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段可能起著分解利用木質(zhì)纖維素的作用[44]。而對(duì)AA12家族酶基因的表達(dá)活躍階段、酶活性、生化特性等的初步研究發(fā)現(xiàn)，該基因在外源營(yíng)養(yǎng)袋和土壤中的營(yíng)養(yǎng)菌絲中低表達(dá)，而在子實(shí)體原基及子實(shí)體中表達(dá)較活躍，異源表達(dá)表現(xiàn)出亞鐵氧化酶與漆酶雙重活性，系在大型子囊真菌中首次發(fā)現(xiàn)[45]。為進(jìn)一步研究鐵元素代謝與漆酶活性在羊肚菌子實(shí)體形成與發(fā)育過(guò)程中的作用提供了啟示。

3.4 交配型基因

子實(shí)體形成與發(fā)育是大型真菌重要的生理過(guò)程，除了需要適宜的溫度、濕度、光照和空氣等環(huán)境條件以及相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)條件外，還受其特有的遺傳因子控制，其中在調(diào)控真菌有性發(fā)育過(guò)程中交配型基因(Mat)就是關(guān)鍵位點(diǎn)。已有研究證明梯棱羊肚菌是一種以異宗結(jié)合交配方式繁殖的真菌，兩個(gè)交配型位點(diǎn)在不同的細(xì)胞核上可以用來(lái)鑒別不同的核型[46-48]。杜習(xí)慧等[49]關(guān)于黑色羊肚菌支系14個(gè)物種的有性生殖方式和交配型基因的研究結(jié)果顯示，Mat1-1-1和Mat1-2-1基因能很好地區(qū)分黑色羊肚菌支系類(lèi)群內(nèi)近緣物種，并且交配型基因在黑色羊肚菌支系子實(shí)體分布和自然群體分布中呈現(xiàn)差異分布現(xiàn)象等，對(duì)黑色羊肚菌有性繁殖方式的研究結(jié)論均支持黑色羊肚菌支系為異宗配合類(lèi)的真菌。研究還顯示，相比Mat1-2-1，Mat1-1-1在某些黑色羊肚菌物種中具有更大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，并且缺失交配型基因易對(duì)生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響[36]。而這種現(xiàn)象在另外一些研究中并不明顯，劉偉等[50]對(duì)采集自不同地區(qū)的羊肚菌子囊果中兩種交配型基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)43.96%只存在一種類(lèi)型，并且兩種類(lèi)型的基因缺失幾率相似，由于在組織分離后的培養(yǎng)物中兩種類(lèi)型的基因缺失的幾率雖不同，但純化后的菌落形態(tài)近似，所以組織分離物最初的菌落形態(tài)并不適合用作確定分離物交配型基因是否完整的篩選標(biāo)記。具有異宗結(jié)合這一類(lèi)型的生活史需要兩類(lèi)互補(bǔ)交配型彼此作用，單一交配型菌株并不具有出菇能力，所以實(shí)際栽培時(shí)，首先要利用分子標(biāo)記技術(shù)檢驗(yàn)組織分離物交配型基因的完整性，這是確保出菇的必需環(huán)節(jié)。

3.5 菌核發(fā)育相關(guān)基因

在羊肚菌完整的生活史中，菌核的形成占據(jù)著重要地位，我國(guó)已馴化栽培的羊肚菌在人工生產(chǎn)過(guò)程中可形成菌核[51]。提取尖頂羊肚菌(M.conica)產(chǎn)菌核與不產(chǎn)菌核菌株的菌絲樣品總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)顯示兩者在通透酶、周期蛋白依賴性激酶、脂蛋白等基因表達(dá)上存在一定的差異[52]。利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析梯棱羊肚菌菌核形成過(guò)程中菌絲、起始、成熟三個(gè)階段的樣品，結(jié)果表明，在梯棱羊肚菌菌核形成過(guò)程中，差異表達(dá)基因主要處在初級(jí)代謝階段，比如三大類(lèi)物質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的代謝以及能量代謝等[53]。但是目前對(duì)菌核形成機(jī)制及菌核數(shù)量與子實(shí)體產(chǎn)量之間的關(guān)系均不明確，因此現(xiàn)有工作仍缺乏對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)性。

3.6 抗逆相關(guān)基因

羊肚菌的生長(zhǎng)發(fā)育受逆境脅迫的影響，在其栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大的今天，土壤重金屬鎘超標(biāo)等問(wèn)題給羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及其子實(shí)體質(zhì)量安全均構(gòu)成潛在的威脅。Liu等[54]通過(guò)比對(duì)梯棱羊肚菌的參考基因組序列，發(fā)現(xiàn)存在鎘脅迫響應(yīng)基因(ATX1)，可能與重金屬鎘的代謝相關(guān)；梯陵羊肚菌ATX1基因的沉默及超表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明，該基因表達(dá)量的增加會(huì)提高梯棱羊肚菌對(duì)于鎘的敏感度，降低菌絲對(duì)鎘的抗性[55]。可見(jiàn)ATX1基因極有可能以一種反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制在梯棱羊肚菌鎘脅迫響應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用，不過(guò)其在梯棱羊肚菌鎘代謝中的具體作用機(jī)理并不明確，仍需做進(jìn)一步的研究。

3.7 子實(shí)體形成機(jī)制研究

雖然有些羊肚菌種類(lèi)經(jīng)過(guò)馴化已大規(guī)模人工栽培，但因其子實(shí)體形成機(jī)制尚不清楚，難以達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)。為了探討羊肚菌子實(shí)體形成的機(jī)制，Hao等[56]分別對(duì)羊肚菌菌絲體和幼子實(shí)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)12 500多個(gè)差異表達(dá)基因多數(shù)集中在前體代謝物質(zhì)和能量生產(chǎn)、碳水化合物代謝和氧化還原酶活性的功能基因類(lèi)別；酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，從菌絲期到幼子實(shí)體期，碳水化合物活性酶、氧化還原酶、過(guò)氧化氫酶和線粒體酶復(fù)合體(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)的活性水平明顯升高；此外，編碼碳水化合物活性酶、線粒體蛋白、氧化還原酶和熱休克蛋白的基因在幼子實(shí)體期的表達(dá)水平高于菌絲期，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR也發(fā)現(xiàn)相似趨勢(shì)[57]。因此，子實(shí)體在幼菇階段各種生理活性變得旺盛，此時(shí)碳水化合物分解代謝和能量代謝顯著增強(qiáng)，同時(shí)生長(zhǎng)環(huán)境、溫度變化也影響了子實(shí)體的形成。

4 展 望

羊肚菌的分子生物學(xué)研究已經(jīng)取得了可喜的成果，利用分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了羊肚菌屬方便快捷的分子鑒定，較全面地顯示了該屬內(nèi)種群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，利用組學(xué)技術(shù)初步揭示了羊肚菌菌核發(fā)育和子實(shí)體形成的機(jī)制，此外還克隆、表達(dá)了某些與羊肚菌抗逆和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因。但作為重要的食藥用真菌之一，羊肚菌的分子生物學(xué)研究還不夠系統(tǒng)、全面，需要進(jìn)一步深化。后續(xù)羊肚菌的分子生物學(xué)研究工作，第一應(yīng)側(cè)重于新型分子標(biāo)記的挖掘。DNA分子標(biāo)記是對(duì)生物個(gè)體在核酸水平上進(jìn)行遺傳差異檢測(cè)的有效手段，應(yīng)用廣泛。目前在羊肚菌研究中得到應(yīng)用的只有隨機(jī)分子標(biāo)記和少數(shù)種類(lèi)的目標(biāo)分子標(biāo)記，其他種類(lèi)的新型羊肚菌分子標(biāo)記還有待開(kāi)發(fā)。第二應(yīng)注重羊肚菌具備藥用價(jià)值的活性成分在生物合成途徑中起關(guān)鍵作用的酶基因的挖掘和基因的調(diào)控機(jī)制分析。目前只有MIL等少量基因被克隆獲得基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)于轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平調(diào)控研究報(bào)道極少。所以綜合運(yùn)用組學(xué)技術(shù)來(lái)系統(tǒng)揭示羊肚菌活性成分的遺傳信息表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，為將來(lái)分析、合成及利用活性成分打下基礎(chǔ)。第三要注重羊肚菌菌核形成和子實(shí)體發(fā)育的分子機(jī)制研究，目前雖有羊肚菌部分重要的功能基因已得到一定詮釋，但對(duì)于羊肚菌重要發(fā)育基因的功能、重要代謝產(chǎn)物的代謝途徑以及分子調(diào)控機(jī)理的研究很少，從而限制了對(duì)這類(lèi)珍稀食藥用真菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。