龐彩燕， 李廣悅， 孫 靜， 朱家華

(南華大學 資源環(huán)境與安全工程學院，湖南 衡陽 421001)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株購自北納生物微生物菌種保藏中心，經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過16S rDNA序列鑒定，表明該菌株與沙福芽胞桿菌(Bacillussafensis)的同源性達99%。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)：牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0g/L；營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(平板培養(yǎng)基)：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15.0 g/L。

1.1.3 試劑與儀器 細菌細胞裂解液：B-PERTMBacterial Cell Lysis Reagents(Thermo Fisher Scientific)。雷磁pH計(PRS-3G，上海儀電科學儀器有限公司)；Bio Photometer 核酸蛋白檢測儀(德國，艾本德)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-78AV，上海知楚儀器有限公司)；高壓滅菌鍋(GI54DWS，致微儀器有限公司)；全自動酶免分析儀(Synergy LX,BioTek Instruments Inc.)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 在超凈工作臺內(nèi)，挑取一環(huán)平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于100 mL 液體培養(yǎng)基中。30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)12 h后，取2 mL菌液于100 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)6 h，用液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液OD600為0.5(Cell/mL=2.25×108)，作為備用菌懸液。

1.2.2 菌液OD600檢測 在超凈工作臺內(nèi)，取2 mL菌液，用液體培養(yǎng)基稀釋3倍后在蛋白核酸測定儀上測定其OD600值，平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 CA活性檢測 CA 活性檢測參照劉璐等[13]的方法，略作改進。采用酶標儀在400 nm處檢測對硝基苯酚(p-NP)濃度，并作其隨時間變化曲線，計算CA活性。①繪制對硝基苯酚標準曲線；②工作液的制備：0.02 mmol/L 乙酸對硝基苯酯(p-NPA)溶于1 mL無水乙醇，0.02 mmol/L二乙基丙二酸溶于9 mL磷酸緩沖溶液，將兩者混合均勻；③粗酶液制備：取5 mL菌懸液10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋2倍后，與工作液1∶1混合，制成胞外CA酶液；取5 mL菌懸液與1 mL B-PERTMBacterial Cell Lysis Reagents混合均勻，靜置30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋2倍后，與工作液1∶1混合，制成總CA酶液；④酶活性檢測：將粗酶液放入酶標檢測盒中，25 ℃反應3 min后測定OD400；⑤利用標準曲線求出生成p-NP的濃度，計算CA活性。酶活性定義：每毫升每分鐘內(nèi)生成1 μmol p-NP所需的酶量，單位：U/mL。

1.2.4 培養(yǎng)基初始pH對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響 用5 mol/L NaOH溶液與1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH值分別至6.0、7.0、8.0、9.0。以2%(體積分數(shù)，下同)的接種量將菌懸液(OD600=0.5)接至100 mL液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測菌液OD600，12、24、36、60、84 h檢測CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

1.2.5 接種量對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響 以1%、2%、4%、8%的接種量分別將菌懸液接至100 mL 液體培養(yǎng)基(pH=7.0)中，置于30 ℃、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測菌液OD600，12、24、36、60、84 h檢測CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

1.2.6 溫度對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響 以2%的接種量將菌懸液接至100 mL 液體培養(yǎng)基(pH=7.0)中，分別置于20、25、30、35、40、45、50和60 ℃、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測菌液OD600，12、24、36、60、84 h檢測CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

1.2.7 轉(zhuǎn)速對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響 以2%的接種量將菌懸液接至100 mL 液體培養(yǎng)基(pH=7.0)中，分別置于120、150、180 r/min、45 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測菌液OD600，12、24、36、60、84 h檢測CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

1.2.8 金屬離子對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響 設定Zn2+、Co2+、Cd2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金屬離子濃度梯度為0.005、0.010、0.020 mmol/L。以2%的接種量將菌懸液接入含不同濃度金屬離子的100 mL 液體培養(yǎng)基(pH=7.0)中，置于150 r/min、45 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)60 h后檢測CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

1.2.9 最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長及其產(chǎn)CA特性 以2%的接種量將菌懸液接至100 mL含0.010 mmol/L Mn2+的液體培養(yǎng)基(pH=7.0)中，置于150 r/min、45 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)。定期取樣檢測菌液OD600和CA活性。每組實驗設3個平行樣，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯酚標準曲線的繪制

配制不同濃度p-NP溶液(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L)，在波長400 nm下測定其吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 對硝基苯酚標準曲線圖

2.2 培養(yǎng)基初始pH對B.safensis 生長及其產(chǎn)CA的影響

不同初始pH條件下，B.safensis生長及其產(chǎn)CA活性變化如圖2所示。初始pH在6.0～9.0范圍內(nèi)，其對細菌生長幾乎無影響，說明該菌株對弱酸和弱堿性環(huán)境均有一定的耐受性。初始 pH值為7.0時，菌液OD600值最高，為3.97。初始pH對CA活性的影響較為明顯。在不同初始pH條件下，CA活性均隨著培養(yǎng)時間延長呈先增長后降低的趨勢，并在60 h左右達到峰值，其中初始 pH值為7.0時酶活最高，為0.182 U/mL。Zheng等[7]報道，初始pH值為8.0時，膠凍樣芽胞桿菌產(chǎn)CA的活性最高，但在7.0～9.0范圍內(nèi)，酶活變化不大。本研究表明，B.safensis產(chǎn)CA最適的初始pH值為7.0，這可能與細菌種類、培養(yǎng)基組份不同而導致培養(yǎng)后期pH值存在差異有關。

2.3 接種量對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響

接種量對B.safensis生長及其產(chǎn)CA活性的影響如圖3所示。接種量對細菌生長的影響無顯著差異，均在36 h達到峰值，其中接種量為2%時，菌液OD600值最高，為4.36。接種量為2%時，在12～60 h培養(yǎng)期內(nèi)，CA的活性逐漸升高，60 h達到峰值。結(jié)果表明，在接種量為2%條件下更有利于B.safensis生長和獲得高活性的CA。

2.4 培養(yǎng)溫度對B.safensis生長及產(chǎn)CA的影響

如圖4所示，隨著溫度升高，B.safensis生長加快，到達30 ℃最適溫度后，其生長開始減慢，而在60 ℃時幾乎不生長，這可能是高溫對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生了不可逆的傷害[14]。在35～45 ℃條件下，細菌在對數(shù)生長期的OD600值最低，為2.31。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對B.safensis生長與CA活性的影響Fig.2 Effects of initial pH of the medium on B.safensis growth and CA activitya：生長曲線；b：酶活曲線a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

圖3 接種量對B.safensis生長與CA活性的影響Fig.3 Effects of inoculum size on B.safensis growth and CA activity a：生長曲線；b：酶活曲線a: Growth curve；b: Enzyme activity curve

圖4 培養(yǎng)溫度對B.safensis生長與CA活性的影響Fig.4 Effects of incubation temperature on B.safensis growth and CA activity a：生長曲線；b：酶活曲線a: Growth curve；b: Enzyme activity curve

與30 ℃相比，在35、40和45 ℃條件下，細菌數(shù)量分別在培養(yǎng)60、36、36 h后急劇下降，但其產(chǎn)CA的活性反而明顯提高，其中溫度為45 ℃時的酶活最高，60 h時的酶活約是30 ℃時的4.76倍。

為了驗證B.safensis胞內(nèi)是否產(chǎn)CA及溫度對CA活性的影響，在接種量為2%、培養(yǎng)基初始pH值為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，設置培養(yǎng)溫度為30、45 ℃，培養(yǎng)時間為84 h，定期檢測其胞外及總CA的活性，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，總CA的活性均高于胞內(nèi)CA，表明B.safensis產(chǎn)胞內(nèi)CA。溫度為45 ℃、培養(yǎng)時間為60 h時，總CA的活性和胞內(nèi)CA活性均達到最高。而且培養(yǎng)溫度為45 ℃的總CA活性比30 ℃高5.7倍。

圖5 培養(yǎng)溫度對B.safensis胞外和總CA活性的影響Fig.5 Effects of incubation temperature on extracellular and total CA activity of B.safensis

2.5 轉(zhuǎn)速對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響

在不同搖床轉(zhuǎn)速條件下，B.safensis生長及其產(chǎn)CA的活性變化如圖6所示。細菌的生長隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而加快。當轉(zhuǎn)速為120 r/min時，細菌生長速度較慢，分泌積累的CA活性較低；當轉(zhuǎn)速為180 r/min時，會產(chǎn)生較大的剪切作用，對酶的活性產(chǎn)生抑制；當轉(zhuǎn)速為150 r/min時，CA活性最高，并在60 h達到最大值。

2.6 金屬離子對B.safensis產(chǎn)CA的影響

金屬離子對B.safensis產(chǎn)CA活性的影響如圖7所示。結(jié)果表明，Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+均能提高CA活性的表達。其中，0.010 mmol/L Mn2+的作用最大，比對照組提高了2.6倍；0.010 mmol/L Zn2+和0.005 mmol/L Mg2+次之，分別比對照組提高了1.59倍和1.69倍；0.005 mmol/L Ca2+也使CA的活性略有增加。而Cd2+對CA活性幾乎沒有影響，Co2+會抑制CA活性。

2.7 最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長及其產(chǎn)CA特性

在最佳培養(yǎng)條件下，B.safensis生長及其產(chǎn)CA特性如圖8所示。細菌幾乎無生長遲滯期，快速進入對數(shù)期，24 h達到生長最大值，說明該菌株對環(huán)境具有很好的適應能力。24 h后細菌生長速度趨于平緩，進入生長穩(wěn)定期，36 h后生長速度開始急劇下降，進入凋亡期。在12～60 h，CA活性逐漸升高，60 h達到峰值2.46 U/mL。60 h后CA活性逐漸降低，這可能是由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，毒性產(chǎn)物(OH-)的積累，其他蛋白酶的產(chǎn)生或抑制CA活性的胞外代謝物等原因造成的[2,6]。

圖6 轉(zhuǎn)速對B.safensis生長與CA活性的影響Fig.6 Effects of rotational speed on B.safensis growth and CA activity a：生長曲線；b：酶活曲線a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

圖7 金屬離子對B.safensis CA活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on B.safensis CA activity

圖8 最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長曲線與CA活性曲線Fig.8 Curve of B.safensis growth and CA activity under the optimum culture condition a：生長曲線；b：酶活曲線a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

3 討 論

掌握細菌的生長和產(chǎn)CA特性，對獲得高活性酶液具有重要的意義。為了探明培養(yǎng)條件對B.safensis生長及其產(chǎn)CA的影響，通過單因素實驗，確定了其產(chǎn)高酶活性CA的最佳培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)B.safensis產(chǎn)高酶活性CA的最佳培養(yǎng)條件與其最佳生長條件并不完全一致。該菌株在30 ℃條件下生長最快，而45 ℃時產(chǎn)CA的酶活性最高；在培養(yǎng)24 h 時細菌生物量最大，但進入衰亡期(60 h)CA酶活性最大。微生物在適宜的生長環(huán)境下，生長迅速、代謝旺盛。Zheng等[7]和Kaur等[8]的研究表明B.mucilaginosus與B.megaterium的生長和產(chǎn)高酶活性CA的培養(yǎng)條件均一致，且生物量最大時酶活性最高。本研究中，通過總CA活性檢測，證實B.safensis具有產(chǎn)胞內(nèi)CA的能力。當溫度升高或細菌進入衰亡期，菌體自溶導致了胞內(nèi)CA外排，使總CA活性增高。因此，充分利用細菌胞內(nèi)CA，獲得高酶活性的酶液具有重要的實際意義。李為[15]通過研磨破裂細菌細胞獲得胞內(nèi)CA。本研究采用細菌細胞裂解液裂解細菌，使細菌胞內(nèi)CA釋放，便于對胞內(nèi)CA的進一步利用。

CA促進CO2水合反應的核心機理是金屬離子對CO2的親核攻擊[16]。因此，金屬離子對CA活性影響顯著。目前通常使用Zn2+作為輔助因子，激活CA活性。然而，在已發(fā)現(xiàn)的9種不同基因水平上的CA(α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-、η-、θ-、ι-CA)[17]中，雖然其結(jié)構相似度不高，但每種CA的活性中心都會結(jié)合一個對催化過程起著重要作用的金屬離子。α-，β-，η-，θ-CA均以Zn2+作為輔助因子[18-23]；γ-CA 以Zn2+、Fe2+、Co2+作為輔助因子[20]；δ-CA 以Zn2+、Co2+作為輔助因子[24-25]；ζ-CA以 Zn2+、Cd2+作為輔助因子[26]；ι-CA以Mn2+作為輔助因子[17,27]；而ε-CA的輔助因子至今未見報道[28]。為了探明B.safensis產(chǎn)CA的輔助因子，研究了Zn2+、Co2+、Cd2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金屬離子對酶活性的影響。結(jié)果表明Mn2+對B.safensisCA活性的激活作用最顯著。最近，Jensen等[17]從Thalassiosirapseudonana中鑒定了一種以Mn2+作為CA輔助因子的新型ι-CA。推測獲得的B.safensis菌株也可能產(chǎn)ι-CA。