江宇航， 辛維崗， 徐美余， 楊瑞思， 張棋麟*， 林連兵*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650500)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛分布于淡水、海洋和河口等水生環(huán)境中，是我國最為廣泛流行的一種典型人-畜-水生動物共患病原菌[1-2]。當?shù)~類感染嗜水氣單胞菌后易出現(xiàn)暴發(fā)性出血病，主要表現(xiàn)為頭部、腹部等部位充血，無食欲，漂浮于水面上等現(xiàn)象，致死率極高[2]。然而我國目前針對魚類養(yǎng)殖過程中防治嗜水氣單胞菌引發(fā)的病害仍主要以抗生素和化學(xué)藥物等進行防控[3]，雖然在短期內(nèi)能夠取得一定的療效，但長期使用會造成藥物殘留和耐藥性細菌形成等問題，使防治嗜水氣單胞菌引發(fā)的相關(guān)疾病變得更加困難[3-4]。此外，目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018-2021年)》中也明確指出，2020年7月1日起，全面退出抗生素在飼料端的使用[5]。因此，急需找到一種有效替代抗生素應(yīng)用于防治嗜水氣單胞菌引發(fā)的魚類疾病。乳酸菌屬(Lactobacillus)細菌在食品生產(chǎn)、畜牧和魚類養(yǎng)殖等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有安全、可靠、性能優(yōu)良等特點[6-7]。近年來，隨著對乳酸菌屬細菌的深入研究，諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分乳酸菌屬細菌能夠產(chǎn)生對一種或多種致病性細菌表現(xiàn)良好的抗菌活性物質(zhì)[8-9]。例如，李宏偉等[9]篩選到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)L2和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)L4，均對豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)表現(xiàn)出良好的抑菌效果，并能夠廣譜抑制大腸埃希菌(Escherichiacoli)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)等多種致病性細菌。同時，乳酸菌屬的部分細菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)具有安全、高效、無殘留、無耐藥性等特點，表現(xiàn)出良好的替抗?jié)摿7,9]。然而，目前雖已挖掘得到了部分抑制致病性細菌的乳酸菌屬細菌資源，但針對抑制魚類重要病原菌嗜水氣單胞菌的乳酸菌屬細菌資源較為匱乏，特別是來源于魚類腸道中的拮抗嗜水氣單胞菌乳酸菌資源[1-2]。因此，本研究從尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)腸道中挖掘、鑒定抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌菌種，測定其抑菌活性，熱、酸堿穩(wěn)定性及掃描電鏡觀察抑制后的嗜水氣單胞菌顯微形態(tài)變化，為魚類腸道乳酸菌應(yīng)用于防治魚類疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 乳酸菌(Lactobacillus)分離自健康尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(由云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心實驗養(yǎng)殖基地飼喂提供)腸道；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)分離自非正常死亡尼羅羅非魚腸道，該菌株由云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸、氫氧化鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶 K和過氧化氫酶，購自上海源葉生物科技有限公司；0.22 μm濾膜、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑和引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。低溫離心機(CF16RXII，Eppendorf公司)；體式顯微鏡(SZ61，奧林巴斯股份有限公司)；落地式超凈工作臺(SW-CJ-2F，上海蘇坤實業(yè)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(MIRH163P，三洋電器股份有限公司)； pH計(PHSJ-3F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；高分辨冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SM8010，日立(Hitachi)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 尼羅羅非魚腸道乳酸菌的分離和純化 取健康成年尼羅羅非魚5條，解剖鏡下收集腸道，置于裝有500 μL無菌水(ddH2O)的 1.5 mL已滅菌EP管中，研磨棒研磨勻漿，ddH2O補至 1.0 mL。然后用ddH2O梯度稀釋至10-3、10-5、10-7，取各梯度稀釋液100 μL涂布于含5%(質(zhì)量分數(shù))CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后[10]，挑取具有透明溶鈣圈的單菌落，在含5%的CaCO3MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化。將產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落進行革蘭染色，初步確定呈陽性的菌株為乳酸菌[9]，編號并保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌篩選 利用牛津杯雙層平板法篩選對嗜水氣單胞菌具有抑制作用的乳酸菌。以LB 固體培養(yǎng)基和100 μL嗜水氣單胞菌(107cfu/mL)與4 mL LB半固體培養(yǎng)基混合液配制成LB雙層平板。待其凝固后，用無菌鑷子夾取無菌牛津杯(直徑8 mm)置于雙層平板上。向上述牛津杯中加入經(jīng)過12 000 r/min離心10 min收集得到的上清液，并通過0.22 μm濾膜過濾后的200 μL乳酸菌無細胞培養(yǎng)液，于4 ℃ 冰箱中靜置4～6 h，使其充分擴散后，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)12 h，觀察記錄抑菌圈直徑[6,9]。以滅活后的乳酸菌無細胞培養(yǎng)液作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌鑒定 抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌鑒定，嚴格按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進行。將獲得的細菌基因組DNA作為模板，選擇兩條通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rRNA基因序列進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min[9]。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行Sanger測序。測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST在線服務(wù)器與細菌數(shù)據(jù)庫進行比對后，選取得分最高、序列一致性在99%以上的已知細菌種類確定為目標物種。

1.2.4 抑制嗜水氣單胞菌的抑菌成分確定 將抑菌活性最佳菌株的無細胞培養(yǎng)液，按以下處理進行抑制嗜水氣單胞菌的抑菌成分確定。①有機酸的排除：用乳酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基至與無細胞培養(yǎng)液pH相同的液體作為實驗組；②過氧化氫的排除：用乳酸調(diào)節(jié)乳酸菌無細胞培養(yǎng)液pH至7.0，加入終濃度為0.5 mg/mL的過氧化氫酶，37 ℃恒溫水浴處理2 h后，作為實驗組；③蛋白酶敏感性測定:分別向乳酸菌無細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mg/mL的不同蛋白酶溶液(胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)， 37 ℃恒溫水浴 2 h后，80 ℃恒溫水浴2 min使酶變性失活，作為實驗組。以上試驗均利用牛津杯雙層平板法檢測抑菌活性，均以無處理的乳酸菌無細胞培養(yǎng)液作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 抑制嗜水氣單胞菌的抑菌作用分析 ①將抑菌活性最佳菌株的無細胞培養(yǎng)液按以下處理進行熱、酸堿穩(wěn)定性測定：37、60、80、100 ℃恒溫水浴30 min，自然冷卻至室溫；以1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37 ℃恒溫水浴2 h 后，調(diào)回pH至6.5[10]。采用牛津杯雙層平板法檢測抑菌活性，以無處理的乳酸菌無細胞培養(yǎng)液作為對照，實驗重復(fù)3次。②掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：將嗜水氣單胞菌活化至對數(shù)期(107cfu/mL)，取2 mL 3 500 r/min，4 ℃條件下離心5 min收集菌體，PBS緩沖液(pH 7.4)洗脫3次。實驗組中加入100 μL乳酸菌無細胞培養(yǎng)液，對照組加入滅活后的乳酸菌無細胞培養(yǎng)液，分別于37 ℃反應(yīng)1 h后，3 500 r/min離心5 min收集菌體，PBS 緩沖液(pH 7.4)洗脫3次。2 mL 2.5%的戊二醛固定樣品6 h后，3 500 r/min離心10 min，收集菌體，PBS 緩沖液(pH 7.4)洗脫3次。再用1 mL 30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇以及無水乙醇按次序分別梯度脫水1次，每次脫水20 min。將脫水后的菌體均勻涂布到10 mm×10 mm硅片上(反光面)，自然干燥 24 h；最后，將含有菌體的硅片用雙面膠固定到樣品臺上，按順序放入離子濺射金儀器中250 s后取出，進行SEM觀察[6-7]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 每個實驗獨立重復(fù)3 次，以平均值±標準差(SD)方式呈現(xiàn)。采用Microsoft Excel 2010及IBM SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理分析。采用Student′s t test進行數(shù)據(jù)對間顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和純化

通過含有5%的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基篩選尼羅羅非魚腸道乳酸菌，共獲得12個具有明顯溶鈣圈的單菌落。進一步于MRS固體培養(yǎng)基平板上純化后，得到生長旺盛、具有溶鈣圈明顯的乳白色、革蘭陽性菌株，分別編號為菌株LX1～LX12。

2.2 具有抑制嗜水氣單胞菌作用的乳酸菌篩選與鑒定

通過牛津杯法雙層平板法檢測尼羅羅非魚腸道內(nèi)篩選得到的12株備選菌株抑菌能力，結(jié)果顯示，菌株LX3、LX7、LX8的無細胞培養(yǎng)液對嗜水氣單胞菌具有明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑依次為(25.25±0.23)(抑菌活性最佳)、(23.85±0.12)、(18.26±0.36) mm，均與對照(8.02±0.03) mm相比存在顯著差異(P<0.05)(表1)。此外，將3株乳酸菌的16S rRNA基因序列提交到NCBI，選取相似性在99%以上的已知細菌種類比對發(fā)現(xiàn)，菌株LX3和LX7為植物乳桿菌，菌株LX8為唾液乳桿菌(表1)。

表1 抑制嗜水氣單胞菌乳酸菌的分子鑒定及抑菌活性

2.3 抑制嗜水氣單胞菌的抑菌成分分析

與乳酸菌無細胞培養(yǎng)液相同pH的乳酸和過氧化氫酶處理后的乳酸菌無細胞培養(yǎng)液分別進行抑制嗜水氣單胞菌試驗。結(jié)果顯示，相同pH的乳酸與對照結(jié)果相似(P>0.05)，未出現(xiàn)明顯的抑菌效果，初步排除有機酸的干擾；經(jīng)過氧化氫酶處理后的抑菌圈直徑與對照相比，也未發(fā)生顯著減小(P>0.05)，初步排除了過氧化氫的干擾(表2)。此外，經(jīng)蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白酶分別處理后，發(fā)現(xiàn)其抑菌圈直徑均顯著減小(P<0.05)(表2)。

表2 抑制嗜水氣單胞菌的抑菌成分分析

2.4 抑制嗜水氣單胞菌的酸堿、熱穩(wěn)定性分析

將菌株LX3的無細胞培養(yǎng)液經(jīng)不同溫度和pH處理后，分別對嗜水氣單胞菌進行抑菌試驗(圖1)。結(jié)果顯示，隨著pH的增加抑菌圈直徑逐漸減小，pH 8.0～12.0時，抑菌圈直徑減小最為明顯，由(19.58±0.21) mm減小至(13.87±0.12) mm，但與對照相比仍存在顯著差異(P<0.05)(圖1A)。同時，菌株LX3的抑菌物質(zhì)活性受溫度的影響，隨著溫度升高抑菌圈直徑逐漸減小，80～100 ℃高溫段減小最為明顯，由(21.49±0.28) mm減小至(16.65±0.26) mm，但與對照相比也存在顯著差異(P<0.05)(圖1B)。

圖1 抑制嗜水氣單胞菌的酸堿(A)、熱(B)穩(wěn)定性Fig.1 Acid base (A) and heat (B) stability of inhibiting Aeromonas hydrophila*表示該組數(shù)據(jù)與對照組間存在顯著差異(P<0.05)* There is a significant difference between the group data and the control group (P<0.05)

2.5 SEM觀察嗜水氣單胞菌細胞形態(tài)變化

利用菌株LX3的無細胞培養(yǎng)液處理嗜水氣單胞菌1 h后，在SEM下觀察菌體細胞形態(tài)變化(圖2)。觀察對照組發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌菌體細胞呈均勻的短桿狀，表面光滑，邊緣整齊，輪廓清晰，細胞結(jié)構(gòu)完整豐滿，為典型嗜水氣單胞菌細胞形態(tài)(圖2A)。觀察實驗組發(fā)現(xiàn)，處理后的嗜水氣單胞菌，菌體細胞的內(nèi)容物有明顯溶出，菌體表面凹凸不平、褶皺明顯，且大部分菌體細胞出現(xiàn)明顯破裂(圖2B)。

圖2 SEM觀察嗜水氣單胞菌的顯微形態(tài)變化

3 討 論

乳酸菌作為重要的益生性菌，在食品健康、飼料工業(yè)及預(yù)防動物疾病等方面應(yīng)用廣泛[8,11]。本研究通過分離尼羅羅非魚腸道內(nèi)的乳酸菌，篩選獲得了3株具有明顯抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌菌株，經(jīng)過16S rRNA分子鑒定后發(fā)現(xiàn)3株乳酸菌菌株分別為植物乳桿菌(LX3、LX7)和唾液乳桿菌(LX8)，這與以往研究中從其他魚類腸道中分離獲得的產(chǎn)抑菌活性乳酸菌菌種資源具有相似性[12-13]。值得注意的是，篩選獲得的3株乳酸菌均對嗜水氣單胞菌顯示出了良好的抑菌活性，特別是菌株LX3的抑菌活性可達到(25.25±0.23) mm，遠高于目前從發(fā)酵蔬菜[14]和腌漬蔬菜[15]等來源獲得的乳酸菌對嗜水氣單胞菌的抑菌活性的1.2～2倍。研究結(jié)果進一步證實了魚類腸道中存在著具有高活性抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌。此外，為進一步明確菌株LX3產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)，本研究在排除有機酸和過氧化氫干擾的基礎(chǔ)上，將菌株LX3的無細胞培養(yǎng)液經(jīng)過多種蛋白酶處理后，發(fā)現(xiàn)抑菌活性均出現(xiàn)不同程度的下降，表明由菌株LX3產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對一種或多種供試蛋白酶敏感，為一類類蛋白物質(zhì)[16]。乳酸菌產(chǎn)生的抑菌活性成分復(fù)雜，對于其確切的成分需要進一步采用質(zhì)譜鑒定及SDS-PAGE蛋白膠等方法進一步確認。

乳酸菌抑菌活性物質(zhì)作為抗生素替代品應(yīng)用于飼料工業(yè)、畜牧和魚類養(yǎng)殖過程中，其熱、酸堿穩(wěn)定性及抑菌機制等也是值得考慮的問題[17-18]。本研究將嗜水氣單胞菌活性最佳菌株LX3的抑菌活性物質(zhì)進行酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑菌活性受堿和高溫的影響，隨著溫度和pH的不斷上升抑菌活性逐漸降低，這一結(jié)果與其他研究中乳酸菌的抑菌活性物質(zhì)受到酸堿和高溫影響的結(jié)果相似，這主要與乳酸菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)具有類蛋白性質(zhì)有關(guān)[21-22]。盡管本研究中分離得到的菌株LX3產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)受到了堿和高溫的影響，但相同處理條件下的殘留抑菌活性與以往研究相比[14-15]，顯示出了較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受能力。此外，為進一步明確乳酸菌抑菌活性物質(zhì)如何有效抑制或殺滅嗜水氣單胞菌，本研究通過SEM觀察抑菌活性物質(zhì)處理后的嗜水氣單胞菌細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的菌體細胞破裂、細胞的內(nèi)溶物溶出，表明乳酸菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)促使嗜水氣單胞菌菌體發(fā)生了裂解、導(dǎo)致其細胞死亡[16,22]。因此，本研究結(jié)果證實了尼羅羅非魚腸道中篩選得到的乳酸菌能夠有效抑制和殺滅嗜水氣單胞菌，具有良好的防治嗜水氣單胞菌的應(yīng)用潛力。

目前，畜牧和魚類養(yǎng)殖正朝著無抗化養(yǎng)殖的方向發(fā)展。本研究篩選到的多株能夠有效抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌，尤其是菌株LX3顯示出了良好的抑菌活性和抑菌特性，能夠有效破壞嗜水氣單胞菌的細胞結(jié)構(gòu)使其發(fā)生裂解死亡。但在實際生產(chǎn)應(yīng)用時，乳酸菌等潛在益生菌資源的安全性及益生性評價是必不可少的，而本研究旨在篩選具有抑制嗜水氣單胞菌的乳酸菌菌株，并進行體外抑菌作用評估，以獲得具有良好抑菌特性的乳酸菌菌種資源。因此，未來為了更好地將尼羅羅非魚腸道乳酸菌應(yīng)用于畜牧和魚類養(yǎng)殖中，還將對篩選獲得的高抑菌活性菌株進行安全性和益生性評價，為降低嗜水氣單胞菌引起的食物中毒風險和畜牧及魚類無抗化養(yǎng)殖等方面提供有價值的益生性乳酸菌菌種。此外，未來還將對獲得的抑制嗜水氣單胞菌乳酸菌資源展開相關(guān)致病菌攻毒試驗治療研究，以更好地將乳酸菌菌種資源實際應(yīng)用于預(yù)防和治療嗜水氣單胞菌相關(guān)的魚類疾病。