馬 輝，溫 花，趙緒永，李國慶

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

氯霉素是一種廣譜的抑菌型抗生素，其藥性穩(wěn)定，治療及預(yù)防作用顯著[1,2]，但其會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留[3]，殘留的氯霉素可能抑制人體的造血功能，減少血細(xì)胞的數(shù)量，引起再生障礙性貧血[4,5]。

氯霉素檢測通常采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)和氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等方法。酶聯(lián)免疫法檢測氯霉素殘留量較為方便，并且可簡化預(yù)處理過程[6]。膠體金免疫層析法不需要檢測設(shè)備，無需提前準(zhǔn)備，成本低，操作快，適合少量樣品的抗生素含量檢測[7]。在氯霉素殘留檢測過程時(shí)，甲醇、乙醇及乙酸乙酯等常用作氯霉素的提取劑，乙醚、石油醚和苯等則不常用，因?yàn)槁让顾卦谝颐?、石油醚和苯等試劑中不易溶解。氯霉素在干燥環(huán)境下較穩(wěn)定，但受熱易降解[8]。在弱酸或中性溶液中性質(zhì)比較穩(wěn)定，在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易于分解。氯霉素的取代苯環(huán)與蛋白質(zhì)載體發(fā)生反應(yīng)，使得氯霉素的紫外吸收增強(qiáng)[9]。

本試驗(yàn)用膠體金免疫層析法檢測六種市售牛奶樣品的氯霉素殘留量，比較四種不同前處理方法對檢測效果的影響，為牛奶中氯霉素的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

巴氏殺菌鮮牛奶、風(fēng)味牛奶(復(fù)原乳)、紅棗牛奶等三種奶制品均購自河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院教育超市；伊利品牌盒裝牛奶購自網(wǎng)上超市；兩種生牛乳購自某牛場。

1.2 試驗(yàn)儀器

FA2104A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；MK-3酶標(biāo)儀(賽默飛世爾有限公司)；MIX-25P渦旋器(杭州米歐儀器有限公司)；RE-52旋蒸儀(上海亞榮生化儀器公司)；H1650離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)。

1.3 試劑

氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒和氯霉素快速檢測卡(北京勤邦有限公司)；乙酸乙酯(華天生物科技有限公司)；氯化鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷、甲醇均為國產(chǎn)分析純(天津恒興化學(xué)制劑有限公司)；氫氧化鈉為國產(chǎn)分析純(鄭州派尼化學(xué)試劑廠)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒4 ℃冷藏，使用時(shí)從冰箱拿出，恢復(fù)至室溫。在微孔板的微孔中加入50 μL不同濃度(0.025、0.075、0.3、1.2、4.8 ppb)的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再各加入50 μL氯霉素單抗-HRP結(jié)合物。用薄板將微孔板蓋住，在陰處或避光處靜置30 min。待反應(yīng)完畢后將微孔內(nèi)的液體倒出，加入提前配制好的PBST洗滌液250 μL，輕微震動(dòng)或拍打微孔板四周，隨后倒出，用專用吸水紙吸取孔板四周多余水分，洗滌5～6次，每次間隔20 s。加入底物液TMB和H2O2各50 μL，輕微敲打微孔板四周，并略振蕩，以防孔內(nèi)液體濺出，把整個(gè)微孔板避光保存20 min，加入終止液H2SO450 μL，于波長450 nm處進(jìn)行檢測。手動(dòng)換位檢測1次/min，將上述過程重復(fù)2～3次，以減小誤差。

1.4.2 吸光率的計(jì)算

B表示標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值；

B0表示陰性對照的平均吸光度值。

以氯霉素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 牛奶樣品的前處理方法

利用不同的方法對牛奶樣品進(jìn)行前處理，制備用于分析的樣品溶液。

1.5.1 方法一

取10 mL牛奶至離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋30 min，室溫3500 r/min離心10 min。若兩相之間出現(xiàn)乳化層，可將樣品放在80 ℃水浴鍋5 min。若未出現(xiàn)乳化層，則移取1 mL乙酸乙酯至10 mL的一次性管內(nèi)，在旋蒸儀內(nèi)蒸干，加入2 mL正己烷和2 mL復(fù)溶工作液溶解干燥物，除去上層，保留下層。

1.5.2 方法二

取10 mL牛奶至離心管中，室溫3500 r/min離心10 min。加入0.40 mol/L亞鐵氰化鉀溶液300 μL、1.05 mol/L硫酸鋅溶液600 μL，渦旋1 min。室溫3500 r/min離心10 min，吸取上層清液至離心管中。

1.5.3 方法三

取10 mL牛奶至離心管中，加入250 μL乙腈，渦旋10 s使其混合。加入10 mL乙酸乙酯，渦旋30 min。室溫3500 r/min離心10 min，吸取上層有機(jī)相2～10 mL，在旋蒸儀內(nèi)蒸干。加入0.25 mL正己烷，加入復(fù)溶工作液即水-乙腈混合物(78∶22)0.25 mL，渦旋30 s。取2～10 mL移入離心管中，離心5 min，下層溶液用于分析。

1.5.4 方法四

取10 mL牛奶至離心管中，加入2 mL去離子水和8 mL乙酸乙酯，渦旋30 min，室溫3500 r/min離心10 min，取上層清液2～10 mL，在旋蒸儀內(nèi)蒸干，加入100 μL復(fù)溶工作液即水-乙腈混合物(78∶22)，渦動(dòng)30 s。

1.6 氯霉素膠體金免疫層析法

從4 ℃冰箱拿出氯霉素膠體金免疫層析檢測卡，恢復(fù)至室溫，吸取80 μL樣品溶液滴加在加樣孔中，等待20～30 min，即可肉眼觀察對照線T和檢測線C的有無以及顏色變化。氯霉素膠體金免疫層析快速檢測卡的靈敏度為0.1 ppb，樣品檢測完成后可能出現(xiàn)C、T檢測線的顯色和顏色變化，若樣品中未含氯霉素或者含量低于檢測線,則卡片結(jié)果為陰性，反之則為陽性(圖1)。

圖1 氯霉素膠體金試紙條示意圖

1.7 ELISA法

(1)將酶聯(lián)免疫試劑盒從4 ℃冰箱中取出，回溫20 min，使用之前將各試劑搖晃均勻；(2)按照試劑盒說明書配制酶結(jié)合物工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用；(3)加入處理好的牛奶待檢溶液50 μL于微孔中，加入50 μL氯霉素單抗-HRP結(jié)合物，輕微振蕩，用錫紙包裹放在暗處等待30 min；(4)每孔加入洗滌液250 μL，洗滌5次，每次間隔20 s，洗滌時(shí)應(yīng)充分洗滌，避免誤差；(5)分別加入50 μL TMB，微振，用錫紙包裹,放在暗處等待20 min；(6)加入終止液50 μL輕微敲打四周，微振(以防液體濺出)，為檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，應(yīng)提前將酶標(biāo)儀預(yù)熱5 min，在波長450 nm處檢測1次/min，連續(xù)檢測3次為一組。

2 結(jié)果

2.1 膠體金免疫層析法檢測結(jié)果

六種牛奶的氯霉素殘留量檢測結(jié)果均為陰性，表示六種牛奶不含有氯霉素或氯霉素的含量低于檢測線。

2.2 ELISA法檢測結(jié)果及四種前處理方法的比較

2.2.1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以氯霉素濃度的對數(shù)為自變量，以標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率為因變量，進(jìn)行回歸分析，線性方程為y=-27.262x+48.243，相關(guān)系數(shù)R2為0.9893(圖2)。

圖2 ELISA法檢測氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 ELISA法的檢測結(jié)果

選取一種牛奶樣品，用1.5中的四種方法對牛奶樣品進(jìn)行前處理，然后用ELISA法對樣品中氯霉素的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。

表1 氯霉素的檢測濃度

2.2.3 準(zhǔn)確度測定

取一種已知氯霉素含量的牛奶樣品，分為兩組，分別加入50 μL或100 μL 100 ppb標(biāo)準(zhǔn)氯霉素溶液。根據(jù)1.5中的四種方法對牛奶樣品進(jìn)行前處理，用ELISA法檢測樣品中氯霉素含量，結(jié)果如表2所示，從兩組數(shù)據(jù)可直觀地看出,方法三的平均回收率最高，方法二的平均回收率最低。

表2 牛奶中的氯霉素回收率檢測結(jié)果

如圖3所示，加標(biāo)量50 μL時(shí)，方法三相比方法一差異顯著(P<0.01)，相比方法二差異極顯著(P<0.05)。圖4顯示，加標(biāo)量100 μL時(shí)，方法三相比方法二的結(jié)果顯著差異(P<0.05)。無論加標(biāo)量大小，方法三的平均回收率都是最高的。

圖3 牛奶加標(biāo)回收率結(jié)果對比(加標(biāo)量50 μL)

圖4 牛奶加標(biāo)回收率結(jié)果對比(加標(biāo)量100 μL)

2.2.4 精密度結(jié)果

如表3所示，牛奶前處理方法的批內(nèi)變異系數(shù)在3.20%～6.31%之間，批間變異系數(shù)在4.99%～13.65%之間。方法三批內(nèi)變異變異系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為3.20%、4.99%，在四種方法中均最小，說明在四種方法中，方法三提取效果最好。

表3 不同牛奶前處理方法的精密度對比

3 討論

畜禽長期使用抗生素會(huì)造成其加工生產(chǎn)的產(chǎn)品攜帶有抗生素[10]。人們長期食入含有抗生素的畜禽食品會(huì)影響身體健康[11,12]。人們對乳制品的需求量較大，牛奶中氯霉素殘留量的檢測很重要，本試驗(yàn)對市售六種牛奶氯霉素殘留進(jìn)行檢測，并對四種前處理方法進(jìn)行了比較，為牛奶衛(wèi)生安全監(jiān)督提供了技術(shù)支撐。

本試驗(yàn)中，我們選用了四種前處理方法，對比其提取效率，這四種方法中，氯霉素回收率區(qū)間為76.92%～98.58%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.20%～6.31%，批間變異系數(shù)為4.99%～13.65%，均小于15%。各方法回收率大小依次為：方法三>方法四>方法一>方法二，四種方法均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。整體來看，方法三對牛奶中氯霉素的提取效果最好，該方法的準(zhǔn)確度及精密度良好。

對氯霉素等半抗原的檢測通常采用色譜分析法和免疫分析法。高效液相色譜(HPLC)和氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等色譜分析法需要較長的時(shí)間及昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，被限制在實(shí)驗(yàn)室中使用[13,14]。免疫分析法已被廣泛用于小分子物質(zhì)的診斷檢測，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和高通量等優(yōu)點(diǎn)。以膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)為代表的膠體金免疫層析試紙條使用方便、簡單快速，適合于現(xiàn)場檢測。