黃志宏，丁 勇，厲 桓，陳 信，詹 妍，張冬萱，喬宏興

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 河南 鄭州 450001)

大腸菌群是指在37 ℃培養(yǎng)24 h后可以發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣的一大類需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌的總稱，大腸桿菌是腸道中普遍存在、數(shù)量較多的一類有益菌[1]。大腸桿菌普遍存在于人和動物腸道，作為有益菌可保護(hù)腸道的正常生理機(jī)能。作為致病性大腸桿菌，當(dāng)動物轉(zhuǎn)群、免疫、應(yīng)激等原因引起動物機(jī)體抵抗力下降時，會引起大腸桿菌病的發(fā)生[2]。致病性大腸桿菌不僅對養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重影響，還引發(fā)公共衛(wèi)生安全和食品安全問題。河南臨潁某林下鵝場鵝群時常出現(xiàn)零星死亡病例，剖檢病變主要表現(xiàn)為腹膜炎。排除飼料、環(huán)境等其他因素，懷疑其鵝場水源大腸桿菌超標(biāo)。從鵝場內(nèi)部8口水井進(jìn)行水樣采集，進(jìn)行水中大腸菌群和pH的測定，分析該場水源中大腸桿菌是否存在超標(biāo)和水源污染情況，旨在為鵝場大腸桿菌的防控提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 水樣采集

從河南臨潁某鵝場的8口水井采集8份水樣，其中1號水井為該鵝場附近城鎮(zhèn)的自來水，采集水樣深度為100米；2、3、4、5、6號水井位于某羊圈的左下方，均為壓力罐井，采集水樣深度除5號井約80米、其余4口井的深度均約20多米；7號水井為老辦公室壓力罐井，采集水樣深度約20米；8號水井為孵化場壓力罐井，采集水樣深度約20多米。采集的水樣放置20 mL的玻璃試管中，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑

試劑：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)，伊紅美藍(lán)瓊脂(杭州微生物試劑有限公司)，革蘭氏染液(鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司)，禽流感抗原(河南博士動物藥業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 多管發(fā)酵法

首先確定8口井中水源的污染情況及程度，按照污染程度確認(rèn)接種量，接種量分別為10 mL、1 mL、0.1 mL，每個接種量做5個重復(fù)，用無菌注射器抽取10 mL和1 mL水樣分別接種到10 mL的雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)管和10 mL的單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)管中，再抽取1 mL水樣于9 mL的無菌生理鹽水中混勻后，抽取1 mL接種到10 mL的單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)管中。將所有接種后的發(fā)酵管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，若所有發(fā)酵管均無產(chǎn)酸產(chǎn)氣則說明該水樣中的總大腸桿菌群數(shù)為陰性，若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管，則繼續(xù)進(jìn)行分離培養(yǎng)試驗。將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管用平板劃線法接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，靜置30 min，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取具有金屬光澤的深紫黑色菌落、不帶或略帶金屬光澤的紫黑色菌落和中心較深的淡紫紅色菌落做革蘭氏染色、鏡檢和證實試驗。若染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌落為革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落，則可用接種環(huán)挑取該菌落再次接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)24 h，若發(fā)酵管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，這說明該水樣中有大腸菌群存在?？筛鶕?jù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的培養(yǎng)管數(shù)量查表確定每100 mL水樣中總大腸菌群的最可能數(shù)。

2.2 發(fā)病場鵝蛋卵黃處理

先于2 mL EP管內(nèi)加入0.4 mL的16 %氯化鈉溶液，然后用移液器取等體積的鵝蛋蛋黃加入EP管內(nèi)混勻，放置4 ℃冰箱備用。

2.3 血凝抑制試驗

嚴(yán)格按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》GB/T18936-2003中1%雞紅細(xì)胞懸液制備，HA試驗和HI試驗(微量法)的操作步驟進(jìn)行[3]。為了驗證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)所測效價配置4單位抗原，分別作回歸試驗檢測。

3 結(jié)果

3.1 大腸菌群檢測結(jié)果

根據(jù)多管發(fā)酵法檢測的總大腸菌群陽性的管數(shù)，通過查MPN檢索表，得出每100 mL所測水樣中的總大腸菌群MPN值，結(jié)果如表1。試驗結(jié)果表明檢測的八口水井的pH均符合國家畜禽飲用水標(biāo)準(zhǔn)；水井1、2、3、4、6符合國家畜禽飲用水大腸菌群含量標(biāo)準(zhǔn)，而水井5、7、8大腸菌群含量超標(biāo)。

表1 多管發(fā)酵發(fā)測定水質(zhì)中大腸菌群的結(jié)果

3.2 禽流感抗體水平測定結(jié)果

抗體水平測定結(jié)果如表2。試驗結(jié)果表明檢測的4份鵝蛋禽流感抗體水平中1、2、3變異系數(shù)均比較大，說明其抗體水平較低，特別是同一個鵝舍內(nèi)鵝群針對禽流感H7的抗體水平差距較大。同時也說明當(dāng)鵝場水源中大腸菌群超標(biāo)可使鵝群的免疫力下降，從而導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。

表2 抗體水平檢測結(jié)果

4 討論

由于大多數(shù)鵝場都是在廠區(qū)內(nèi)打井取水供鵝群飲用，所以水井中大腸菌的含量對鵝群的生產(chǎn)影響重大。因此可通過對水樣中大腸菌群的含量進(jìn)行檢測來判斷水井的污染情況，從而制定相應(yīng)的防控措施。同時中華人民共和國農(nóng)業(yè)部頒布的《NY 5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》[4]，明確規(guī)定家禽飲用水的總大腸菌含量≤10個/100 mL，pH的范圍在6.4～8.0。

本試驗對河南臨潁某鵝場內(nèi)8口水井的水樣采用多管發(fā)酵法[5,6]檢測其大腸菌總含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該8口水井中的pH均符合國家畜禽飲用水標(biāo)準(zhǔn)，其中采樣深度為100米的1號自來水井和采樣深度約20多米的2、3、4、6號壓力罐井均符合國家畜禽飲用水大腸菌含量標(biāo)準(zhǔn)，因此可發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)離鵝場的自來水井和消毒效果較好的2、3、4、6號壓力罐井污染較少，水質(zhì)達(dá)標(biāo)。而采樣深度約80米的5號壓力罐、采樣深度約20多米的7號老辦公室壓力罐井和8號孵化場壓力罐井的水樣中大腸菌群含量均超過國家畜禽飲用水標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，老辦公室壓力罐井和孵化場壓力罐井對于大腸桿菌的消毒效果欠佳，5號壓力罐的大腸菌群含量超標(biāo)可能是由于鵝場內(nèi)的糞便污染了水井，或者是由于靠近羊圈，糞便滲透土壤污染水源，因此可判定該鵝場發(fā)生的零星死亡是由于鵝場內(nèi)的水井遭受到大腸菌的污染所致，可按照大腸桿菌病的防控措施進(jìn)行防控。這說明鵝場的選址非常重要，應(yīng)選擇地勢高，附近無養(yǎng)殖場，水源不易被污染的環(huán)境。

多管發(fā)酵法是一種實用范圍極廣的方法，該方法試驗成本相對較低，所需設(shè)備價廉簡便，同時濁度較大的水樣也可用該法進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果易于辨認(rèn)[7]。王宣等[8]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)所測水樣的水位在9～13 m深的地下水中，檢測的水樣總大腸菌群超標(biāo)率高達(dá)75 %～100 %，細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)率約達(dá)25 %～100 %，總大腸菌群數(shù)和細(xì)菌總數(shù)的超標(biāo)現(xiàn)象異常嚴(yán)重，接觸新鮮糞便的土壤中大腸菌群總數(shù)可高達(dá)105個/g以上。

通過檢測該鵝場四個棚舍的鵝蛋禽流感卵黃抗體，發(fā)現(xiàn)1、2、3禽流感變異系數(shù)較大，說明其抗體水平較低，特別是同一個鵝舍內(nèi)鵝群對禽流感H7的抗體水平差距較大，感染禽流感的風(fēng)險較大。同時也說明當(dāng)鵝場水源中大腸菌群超標(biāo)時可使鵝群的免疫力下降，從而導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。通過研究發(fā)現(xiàn)各畜禽場隨季節(jié)夏、秋、春、冬季而環(huán)境污染程度依次降低，但地下水的衛(wèi)生指標(biāo)菌數(shù)量無明顯的季節(jié)性變化。只有在疫病流行時，衛(wèi)生指標(biāo)菌增多。同時環(huán)境污染程度低的畜禽場，種鴨的發(fā)病率低，產(chǎn)蛋率高；種蛋受精率高，出雛率高，即環(huán)境污染程度與生產(chǎn)性能成負(fù)相關(guān)[9]。

飲水質(zhì)量是影響鵝群生產(chǎn)業(yè)績和產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素之一，大多數(shù)鵝場的水井都在鵝場內(nèi)，所以鵝糞有可能導(dǎo)致水井中大腸菌含量超標(biāo)。因此預(yù)防大腸桿菌病首先要將水井打在水塔內(nèi)，并對水井內(nèi)的水源做定期消毒和檢測水源中的大腸菌群含量是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)。尤其在夏天，往水井內(nèi)添加的營養(yǎng)劑常常會導(dǎo)致水井內(nèi)的有害微生物的大量繁殖，因此要縮短對水井消毒的時間間隔，有條件的鵝場可使用符合國家畜禽飲用水標(biāo)準(zhǔn)的自來水作為蛋鵝的飲用水[10]。

本試驗也存在許多局限性，多管發(fā)酵法操作復(fù)雜，時間周期長，受干擾因素多，易對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響[11]。同時部分大腸桿菌會出現(xiàn)延遲發(fā)酵的情況，需要更長的時間才能得出結(jié)果?？朔@些局限首先要提高操作者的技能和無菌操作意識，其次要加強(qiáng)對試驗設(shè)備的控制，同時要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件。

要防制該鵝場的大腸桿菌病，首先可進(jìn)行生物防控，增強(qiáng)對飼養(yǎng)環(huán)境條件的消毒，保持鵝舍的清潔和干燥，加強(qiáng)對鵝舍的通風(fēng)，保持適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)密度，在傳播途徑上切斷疾病流行的可能。在引進(jìn)鵝群時，要做到全進(jìn)全出，在傳染源上避免疾病的發(fā)生[12]。其次可采用抗生素和中草藥進(jìn)行防控，因為臨床上對于抗生素的長期以及不合理使用，導(dǎo)致大腸桿菌對抗生素的耐藥性增加，因此在使用藥物治療時要選用一些藥物敏感性高的抗生素，在上市前期采用輪換用藥和聯(lián)合用藥[13]。而中草藥對大腸桿菌的防制則有其獨特的效果，中草藥防制大腸桿菌最顯著的優(yōu)勢是無公害，毒副作用小，不會對人畜健康造成危害，適宜無公害綠色養(yǎng)禽場推廣使用。中草藥不僅來源廣泛，價格便宜，而且使用方便，未來可廣泛應(yīng)用于畜禽疾病的治療[14]。同時也可從該鵝場分離其致病菌株，制成適用于該場的滅活苗。也可將當(dāng)?shù)亓餍械难逍途昱c該鵝場分離出的致病菌株結(jié)合制成的多價滅活苗用來防制當(dāng)?shù)亓餍械拇竽c桿菌病[13]。