沈紅玲，梁紅麗，達(dá)曉玉，王楠，羅堂亮，萬傳星

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

百脈根（Lotus japonicus），隸屬薔薇目豆科（Leguminosae）百脈根屬(Lotus corniculatus)，多年生草本植物，別名五葉草、牛角花、都草、鳥距草。我國百脈根屬共有9個(gè)種，主要產(chǎn)自于西北地區(qū)。百脈根喜溫暖濕潤氣候，根系萌蘗能力強(qiáng)、主根深入地下、對土壤環(huán)境要求較低，能夠適應(yīng)多種生境條件，在固持土壤、防風(fēng)固沙、植被恢復(fù)和水土保持中有重要的作用［1］。百脈根花期長，花量大，除供觀賞外，因種植簡便、營養(yǎng)豐富、適口性好，還可作為飼料資源。百脈根根系發(fā)達(dá)，并與土壤中的固氮菌結(jié)合以改善土壤肥力從而提高共生固氮效能，能夠作為荒漠生態(tài)恢復(fù)的先鋒物種［2］。

根瘤菌是一種能與豆科植物建立共生關(guān)系的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌［3］，包括固氮根瘤菌屬（Azorhizobium）、莖瘤菌屬（Allorhizobium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）等。在缺氮條件下，根瘤菌定殖到豆科植物的根毛細(xì)胞，感染根瘤菌誘發(fā)宿主植物細(xì)胞分化為共生器官的原基，誘導(dǎo)刺激植物組織分化出根瘤，開始進(jìn)行共生固氮過程，主要包括信號(hào)分子的感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵染線的形成和皮層細(xì)胞的分裂等，由雙方相關(guān)基因共同參與、相互識(shí)別、調(diào)節(jié)的過程，在這個(gè)過程中，豆科植物為根瘤菌提供碳源，根瘤菌向植物提供銨鹽和氨基酸。

根瘤是一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境，內(nèi)生菌具有豐富的生物多樣性，除根瘤菌外，發(fā)現(xiàn)根瘤內(nèi)還存在多種內(nèi)生菌，例如，內(nèi)桿菌屬（Endobacter）［4］、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）［5］、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）［6］、草螺菌屬（Herbaspirillum）［7］、假單胞菌屬（Pseudomonas）［8］、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）［9］等，因培養(yǎng)環(huán)境與微生物所處的自然環(huán)境之間存在很大差異，大量微生物通過可培養(yǎng)法不能獲得且無法分離得到不可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌，所以不能夠全面反映根瘤內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)。免培養(yǎng)法為內(nèi)生菌多樣性分析提供了有效的途徑，從而能全面客觀深入地揭示目標(biāo)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)，其結(jié)果不僅可以豐富對根瘤內(nèi)生菌多樣性的認(rèn)識(shí)，還將有助于進(jìn)一步加深對豆科植物根系相關(guān)微生物的認(rèn)識(shí)。張愛梅等［10］對中國沙棘(Hippophae rhamnoidoes)根瘤樣品運(yùn)用兩種方法分析了中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性；何建清等［11］對西藏砂生槐根瘤內(nèi)生細(xì)菌種群組成及其促生潛力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)根瘤內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富，且具有良好促生能力。假單胞菌屬（Pseudomonas）是一類嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性桿菌，是植物根際最為豐富細(xì)菌類群之一［12］，具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性和根際定殖能力，能夠直接促進(jìn)植物生長［13］和抑制植物病原菌，主要用于生物防治與生物化肥。

目前芽孢桿菌與根瘤菌和假單胞菌互作都有相關(guān)研究，百脈根在遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化分析［14］、抗逆境脅迫［15］、根瘤固氮［16］、縮合單寧［17］、作為生物反應(yīng)器［18］以及藥理學(xué)應(yīng)用等方向已經(jīng)有很深入的研究，而在根瘤內(nèi)生菌多樣性和根瘤菌與假單胞菌的互作關(guān)系方面研究較少。本研究以百脈根根瘤為研究材料，將免培養(yǎng)法和可培養(yǎng)法聯(lián)合使用，全面揭示百脈根根瘤內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，明確根瘤內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及組成，并獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的內(nèi)共生細(xì)菌資源；采用平板對峙法對根瘤菌與假單胞菌的關(guān)系進(jìn)行探究，以期能夠發(fā)現(xiàn)促進(jìn)植物生長的促生菌，為使用合成群落促進(jìn)生物固氮提供資源。

1 材料與方法

1.1 植物根瘤樣品

百脈根材料采自塔里木大學(xué)校園內(nèi)（81°17′E，40°32′N），由塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉艷萍教授鑒定為細(xì)葉百脈根。采集根瘤樣品后先用流水清洗表面，再用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液分別進(jìn)行表面消毒，最后用無菌水反復(fù)沖洗，收集最后一次沖洗的無菌水進(jìn)行無菌檢測。

1.2 主要試劑與儀器

PCR儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像儀（Bio-Rad公司）、電泳儀（Bio-Rad公司）、微量高速離心機(jī)（Bio-Rad公司）；10×Easy Taq buffer、dNTPs、Taq（全式金生物公司）；蛋白酶K和溶菌酶（天根生化科技北京有限公司）；細(xì)菌引物27 F和引物1492 R（生物工程上海股份有限公司）。

1.3 免培養(yǎng)法分析百脈根根瘤內(nèi)生菌多樣性

1.3.1 內(nèi)生菌總DNA提取與16S rRNA V5-V7區(qū)PCR擴(kuò)增

根瘤內(nèi)共生細(xì)菌總DNA用試劑盒（OMEGA Soil DNA Kit）提取，同時(shí)采用Nanodrop對DNA進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。根瘤內(nèi)生菌16S rRNA的V5-V7可變區(qū)的PCR擴(kuò)增采用帶特異性引物799 F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和 1193 R（5′-ACGTCATC CCCACC TTCC-3′），PCR 擴(kuò)增采用25 μL擴(kuò)增體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，在熒光定量系統(tǒng)（Promega QuantiFluor）上對文庫進(jìn)行定量，文庫合格后在Novaseq測序平臺(tái)上測序，測序由上海派森諾生物科技有限公司（http://www.personalbio.cn）完成。

1.3.2 免培養(yǎng)法數(shù)據(jù)分析

樣品經(jīng)過質(zhì)檢，文庫構(gòu)建，運(yùn)用Illumina Navaseq測序平臺(tái)進(jìn)行分析，根據(jù)Barcode序列拆分樣本，使用DADA2進(jìn)行去引物，過濾，去噪，拼接和去嵌合體獲得優(yōu)質(zhì)序列，然后使用特征分類器根據(jù)sklearn na?ve Bayes算法將優(yōu)質(zhì)序列歸屬到對應(yīng)的ASVs(amplicon sequence variants)并與 Silva數(shù)據(jù)庫（Release132 http://www.arb-silva.de）［19］進(jìn)行比對獲得物種分類信息。

1.4 可培養(yǎng)法分析根瘤內(nèi)生細(xì)菌多樣性

1.4.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

選取粒大、飽滿的根瘤，在無菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎，擠出汁液，用滅菌的生理鹽水稀釋至10-4、10-5、10-6梯度，每個(gè)梯度10 個(gè)重復(fù)，涂布在含剛果紅（終濃度25 ppm）的YMA，NA，R2A，1/2 LA固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，長出菌落后采用劃線分離法多次轉(zhuǎn)至YMA培養(yǎng)基中獲得單菌落，觀察菌的形態(tài)、大小、透明度、粘稠度、顏色等，直到純化為止。

1.4.2 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

采用堿解法［20］提取內(nèi)共生細(xì)菌DNA。16S RNA基因擴(kuò)增通用引物27 F（5′-ACACTTTCAT CCTCCC TCAC-3′）和 1492 R（5′-CCCTACCTTCTTA CCACTT-3′）。PCR反應(yīng)總體系為25 μL：引物各0.5 μL，10×Easy Taq buffer 0.5 μL，模板3 μL，dNTPs 1 μL，Taq 0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測序，將菌株的測序結(jié)果上傳至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對。

1.5 可培養(yǎng)根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，下載數(shù)據(jù)庫中與分離菌株最相似的標(biāo)準(zhǔn)菌16S rRNA序列，分離獲得的11種根瘤菌如下：新瀉氨基桿菌（Aminobacter niigataensis）TRM95017、纖維素根瘤菌（Rhizobium cellulosilyticum）TRM95031、甘薯根瘤菌（Rhizobium ipomoeae）TRM95046、羅氏根瘤菌（Rhizobium rosettiformans）TRM95060、葡萄汁新根瘤菌（Neorhizobium vignae）TRM95085、附著劍菌（Ensifer adhaerens）TRM95093、雞眼草申氏桿菌（Shinella kummerowiae）TRM95114、谷粒申氏桿菌（Shinella granuli）TRM95115、動(dòng)膠菌樣申氏桿菌（Shinella zoogloeoides）TRM95116、中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sanjuanii）TRM95624、戈壁中慢生根瘤菌(Me-sorhizobium gobiense)TRM9524。將所有分離菌株及其最相近標(biāo)準(zhǔn)菌的16S rRNA序列整合到一個(gè)fasta文件中用于后續(xù)的進(jìn)化分析。使用鄰接法（Neighbour-Joining）對菌株進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 結(jié)瘤根瘤菌的篩選

選顆粒飽滿、大小均勻的百脈根種子，先用75%乙醇處理30 s，再用2.5%次氯酸鈉溶液消毒3min，最后用無菌水洗滌8～10次，均勻鋪于0.8%水瓊脂平板上，28℃正置催芽2～3 d。催芽后的種子播種于滅菌無氮營養(yǎng)培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶1顆，等到植物長出第一片子葉后，根系處接種200μL根瘤菌菌液，光照室溫度30℃，光照16 h，黑暗8 h，光照室培養(yǎng)25～30 d，不定期觀察幼苗的長勢及結(jié)瘤情況。

1.7 平板對峙法分析根瘤菌與假單胞菌關(guān)系

采用平板對峙法將11種根瘤菌和15種假單胞菌在YMA固體培養(yǎng)基上以不同距離(0.3 cm或0.6 cm)共培養(yǎng)4 d，不定期觀察根瘤菌和假單胞菌菌落生長情況及兩者之間關(guān)系，詳細(xì)的操作參照HAN Q等［21］方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 免培養(yǎng)法分析百脈根根瘤內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)組成

采用Novaseq測序平臺(tái)進(jìn)行測序，得到107 322條原始數(shù)據(jù)，拼接和質(zhì)控后進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效序列74 076條。在門和屬分類單元進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)，各分類單元相對豐度前10的物種（圖1A）。在門分類單元水平，百脈根根瘤內(nèi)生菌主要屬于變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），其中變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢門。在綱水平上（圖1B），α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)是豐度最高的綱，占總菌的80.22%，而芽孢桿菌綱（Bacilli）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌（ctinobacteria）分別占總菌的9.97%、7.63%和0.93%。

在屬分類單元水平（圖1C），百脈根根瘤內(nèi)共生細(xì)菌主要包括中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、氨基桿菌屬（Aminobacter）、莖根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、劍菌屬（Ensifer）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、申氏桿屬（Shinella）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium），中慢生根瘤菌屬、金黃桿菌屬和假單胞菌屬為百脈根根瘤內(nèi)的優(yōu)勢類群。

圖1 百脈根根瘤免培養(yǎng)法細(xì)菌群落組成

2.2 可培養(yǎng)法分析百脈根根瘤內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成

本研究利用不同培養(yǎng)基從百脈根根瘤中分離獲得278株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定，這278株內(nèi)生細(xì)菌分屬于3門4綱12目17科28屬58種。門水平上（圖2D），可培養(yǎng)法從百脈根根瘤內(nèi)分離的內(nèi)生菌分屬于變形菌門（Proteobacteria）為主導(dǎo)類群（168株，61.51%），其次是厚壁菌門（Firmicutes）（90株，27.34%）和放線菌門（Actinobacteria）（29株，9.71%）。綱水平上（圖2E），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）是豐度最高的綱，占總菌的32.73%，而芽孢桿菌綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和放線菌綱，分別占總菌的28.77%、28.77%和9.71%。同時(shí)，α-變形菌綱共包含11個(gè)屬，γ-變形菌綱包含8個(gè)屬，放線菌綱包含6個(gè)屬，芽孢桿菌綱包含3個(gè)屬。

屬水平上（圖2F），278株菌株分屬于28個(gè)屬，主要有：芽孢桿菌屬（Bacillus）54株、假單胞菌（Pseudomonas）42株、根瘤菌屬（Rhizobium）29株、申氏桿屬（Shinella）20株、纖維菌屬寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）20株、纖維菌屬（Cellulosimicrobium）12株、氨基桿菌屬（Aminobacter）14株、微桿菌屬（Microbacterium）10株、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）5株，根瘤菌、芽孢桿菌和假單胞菌為優(yōu)勢種群，其中根瘤菌屬有新瀉氨基桿菌（Aminobacter niigataensis）、纖維素根瘤菌（Rhizobium cellulosilyticum）、甘薯根瘤菌（Rhizobium ipomoeae）、羅氏根瘤菌（Rhizobium rosettiformans）、葡萄汁新根瘤菌（Neorhizobium vignae）、附著劍菌（Ensifer adhaerens）、雞眼草申氏桿菌（Shinella kummerowiae）、谷粒申氏桿菌（Shinella granuli）、動(dòng)膠菌樣申氏桿菌（Shinella zoogloeoides）、桑娟中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sanjuanii）、戈壁中慢生根瘤菌(Mesorhizobium gobiense)；假單胞菌有魚假單胞菌（Pseudomonas piscium）、亞硝酸假單胞菌（Pseudomonas nitrititolerans）、猴假單胞菌（Pseudomonas simiae）、阿塔卡姆假單胞菌（Pseudomonas atacamensis）、氧化砷假單胞菌（Pseudomonas arsenicoxydans）、山綠假單胞菌（Pseudomonas yamanorum），青苔假單胞菌（Pseudomonas mosselii）、湖南假單胞菌（Pseudomonas hunanensis）、門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、西里西假單胞菌（Pseudomonas silesiensis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas alloputida）、溫哥華假單胞菌（Pseudomonas vancouverensis）、普農(nóng)假單胞菌（Pseudomonas punonensis）、米氏假單胞菌（Pseudomonas migulae）、惡性假單胞菌（Pseudomonas viciae），根瘤菌、假單胞菌和芽孢桿菌為優(yōu)勢菌群，這與鐘宇舟等［22］關(guān)于根瘤內(nèi)生細(xì)菌的研究結(jié)果一致。免培養(yǎng)方法分析的前10個(gè)優(yōu)勢屬在本次分離過程中大部分都有分離到，但不是優(yōu)勢屬，表明免培養(yǎng)方法分析在一定程度上可以指導(dǎo)可培養(yǎng)分析。

圖2 百脈根根瘤可培養(yǎng)法細(xì)菌群落組成

2.3 可培養(yǎng)根瘤菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

對77株根瘤菌菌株的16S rRNA基因進(jìn)行序列測定，選取11種代表性菌株利用NCBI中的Blast對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對搜索，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，百脈根根瘤內(nèi)根瘤菌屬于6個(gè)不同的屬，分別為根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬、新根瘤菌屬、氨基桿菌屬、劍菌屬和申氏桿屬。

圖3 可培養(yǎng)根瘤菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 百脈根根瘤內(nèi)生菌免培養(yǎng)法和可培養(yǎng)法多樣性差異分析

在門、綱、目、科及屬分類單元，免培養(yǎng)法共從百脈根根瘤菌內(nèi)檢測到內(nèi)生菌分屬于17門31綱69目103科140屬，香農(nóng)指數(shù)為5.81，辛普森指數(shù)為0.85，而可培養(yǎng)法只分離獲得了3門4綱12目17科28屬內(nèi)生菌，香農(nóng)指數(shù)為3.57，辛普森指數(shù)為0.84，結(jié)果表明：免培養(yǎng)法靈敏度較高、檢測到的微生物物種數(shù)多、多樣性要優(yōu)于可培養(yǎng)法，可培養(yǎng)法因培養(yǎng)條件的限制使分離獲得物種豐富度低于免培養(yǎng)法。

在屬分類單元，運(yùn)用兩種方法比較了根瘤內(nèi)生細(xì)菌的相對豐度，發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)法分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌的相對豐度普遍高于其在免培養(yǎng)法中的豐度（圖4）?？膳囵B(yǎng)法分離獲得的芽孢桿菌屬的相對豐度為19.42%，但在免培養(yǎng)方法中沒有檢測到；相反，免培養(yǎng)法檢測到的優(yōu)勢屬中慢生根瘤菌屬占66.73%，而可培養(yǎng)法只分離到1.80%，原因可能是中慢生根瘤菌生長速度較慢，培養(yǎng)初期生長速度較快的菌種“淹沒”了中慢生根瘤菌的生長，或是中慢生根瘤菌未找到適合的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

圖4 免培養(yǎng)法與可培養(yǎng)法差異性分析

2.5 結(jié)瘤根瘤菌

將11種根瘤菌回接到百脈根植物根際，實(shí)驗(yàn)觀察到，接種根瘤菌的植株長勢相對較好，未接種根瘤菌的植株葉片黃，接種根瘤菌菌株TRM95017（Aminobacter niigataensis）后百脈根出現(xiàn)結(jié)瘤現(xiàn)象（圖5），其余菌株侵染植物根際后無結(jié)瘤現(xiàn)象，表明不同菌株與同一植物匹配存在專一性。

圖5 根瘤菌回接百脈根結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 對峙法分析根瘤菌與假單胞菌的關(guān)系

將11種根瘤菌和15種假單胞菌在YMA固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4 d，觀察根瘤菌和假單胞菌菌落生長情況及兩者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)根瘤菌與假單胞菌主要出現(xiàn)的關(guān)系為抑制、融合共生、無作用關(guān)系，其中9種根瘤菌分別與15種假單胞菌有選擇性抑制現(xiàn)象，抑制的假單胞菌有魚假單胞菌（TRM95006）、亞硝酸假單胞菌（TRM95007）、猴假單胞菌（TRM95024）、阿塔卡姆假單胞菌（TRM95028）、氧化砷假單胞菌（TRM95035）、山綠假單胞菌（TRM95052）、青苔假單胞菌（TRM95084）、湖南假單胞菌（TRM95090）、門多薩假單胞菌（TRM95091）、西里西假單胞菌（TRM95100）、惡臭假單胞菌（TRM95121）、溫哥華假單胞菌（TRM95122）、普農(nóng)假單胞菌（TRM95125）、米氏假單胞菌（TRM95140）、惡性假單胞菌（TRM95169），說明根瘤菌與假單胞菌為滿足自身生長，兩者之間產(chǎn)生特異性的信號(hào)或菌株產(chǎn)生某種特殊的代謝產(chǎn)物來維持自身生長不受影響；8種根瘤菌分別與13種假單胞菌選擇性發(fā)生融合共生關(guān)系，根瘤菌有新瀉氨基桿菌（TRM95017）、纖維素根瘤菌（TRM95031）、甘薯根瘤菌（TRM95046）、羅氏根瘤菌（TRM95060）、葡萄汁新根瘤菌（RM95085）、附著劍菌（TRM95093）、中慢生根瘤菌（TRM95624）、戈壁中慢生根瘤菌（TRM95240），說明根瘤菌與假單胞菌選擇性結(jié)合使兩者生長的更好。還有部分根瘤菌與假單胞菌之間無特異性信號(hào)，結(jié)果見表1。

表1 根瘤菌與假單胞菌互作關(guān)系

3 討論與結(jié)論

微生物群落結(jié)構(gòu)是其整體功能的基礎(chǔ)，對根瘤環(huán)境中有著重要的意義。本研究采用免培養(yǎng)法和可培養(yǎng)法對百脈根根瘤內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行了分析，免培養(yǎng)法檢測到的優(yōu)勢屬為中慢生根瘤菌屬、金黃桿菌屬和假單胞菌屬等，可培養(yǎng)法分離獲得的優(yōu)勢菌群為根瘤菌、芽孢桿菌和假單胞菌等，兩者在細(xì)菌群落組成和分離物豐度上存在差異，原因一是免培養(yǎng)法自身具有優(yōu)勢，靈敏度比較高，檢測到的微生物物種數(shù)多，二是可培養(yǎng)過程中存在“微生物暗物質(zhì)（不可培養(yǎng)的微生物）”［23］，三是不同細(xì)菌對不同培養(yǎng)基具有選擇性，可培養(yǎng)法培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的種類有限。針對可培養(yǎng)法的局限性豐富培養(yǎng)基種類和分離手段，優(yōu)化差異條件，針對性設(shè)計(jì)分離方案，形成多類型的“增菌培養(yǎng)基”［24］，或使用I Chip法原位富集一些不可培養(yǎng)的細(xì)菌［25］，是可培養(yǎng)法新的策略。因可培養(yǎng)法的局限性，使得免培養(yǎng)法檢測到百脈根根瘤內(nèi)相對豐度較高的中慢生根瘤菌屬在可培養(yǎng)分離過程中不是優(yōu)勢屬，可能是微生物培養(yǎng)過程中，個(gè)別種類的微生物由于數(shù)量占優(yōu)勢或生長速度較快，在培養(yǎng)初期大量生長，“淹沒”了生長較慢的中慢生根瘤菌。然而免培養(yǎng)法也不能完全代替可培養(yǎng)法，可培養(yǎng)分離獲得的芽孢桿菌屬在免培養(yǎng)法中未檢測到，說明免培養(yǎng)法不能注釋所有的微生物，只有將免培養(yǎng)法與可培養(yǎng)法相結(jié)合方才能更全面系統(tǒng)地揭示根瘤內(nèi)細(xì)菌的多樣性，挖掘潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物資源。

目前根瘤菌、芽孢桿菌和假單胞菌在結(jié)瘤固氮、促進(jìn)植物生長及互作關(guān)系方面有研究，MEYER S D等［26］從30種豆科植物根瘤中分離鑒定出芽孢桿菌和假單胞菌，其他植物［27］內(nèi)生菌中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等為最常見的屬，本研究結(jié)果與其一致。HAN Q等［21］研究發(fā)現(xiàn)蠟樣類芽孢桿菌組不僅能特異性地促進(jìn)快生根瘤菌，抑制慢生根瘤菌的生長，還能緩解鹽堿脅迫對快生根瘤菌結(jié)瘤的負(fù)面影響，增加其在根瘤中的定殖。SUN X L等［28］研究發(fā)現(xiàn)施用典型根際益生芽孢桿菌（Bacillus velezensis）不僅可獨(dú)自促進(jìn)植物生長，其代謝產(chǎn)物能誘導(dǎo)施式假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）的顯著富集，促進(jìn)植物生長并協(xié)助植物耐鹽性。

本研究通過免培養(yǎng)與可培養(yǎng)相結(jié)合方法揭示了百脈根根瘤內(nèi)生菌多樣性，免培養(yǎng)法檢測到根瘤內(nèi)前10個(gè)優(yōu)勢屬在可培養(yǎng)分離中大部分都有分離到，表明免培養(yǎng)法在一定程度上可以指導(dǎo)可培養(yǎng)法，為后期有目的地分離特定物種奠定了基礎(chǔ)。另外獲得了1株結(jié)瘤根瘤菌和13種與根瘤菌共生的假單胞菌，為生物固氮研究儲(chǔ)備了重要的菌種資源。