智凱亭，成龍，閻瀚威，陳生熬，劉潔雅*

（1塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新華水電發(fā)電公司阿爾塔什魚類增殖站，新疆 莎車 844700）

重金屬已成為環(huán)境中典型的污染物之一，近年來呈高發(fā)的態(tài)勢。有相關報道，在2013年有2 0743 t的鋅、3 703 t的銅、2 004 t的鉛、1 38 t的鎘、40 t的汞和2 976 t的砷通過陸地系統(tǒng)排入海洋［1］。其中，造成水體重金屬污染的主要原因有兩點：一是化工行業(yè)所排放的工業(yè)廢水；二是含有大量重金屬離子的生活廢水和水產(chǎn)養(yǎng)殖所產(chǎn)生的廢水。由于重金屬進入水體環(huán)境后不能被生物所降解，只能進行形式和濃度的改變，如由高濃度轉變?yōu)榈蜐舛?，不能從環(huán)境中徹底清除，而導致水體重金屬污染。此外，李靜靜［2］研究指出重金屬還會隨著食物鏈在生物體內不斷富集，當達到臨界計量后就會破壞生物的生理代謝過程，嚴重影響水生生物的生長甚至生存，從而破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，最終使人類健康受到嚴重威脅。SODANGO T H等［3］指出評價水環(huán)境中重金屬對水生生物的毒性效應對于重金屬的安全性評價以及開展如何減弱或祛除水體中重金屬的污染物問題具有重大意義。

而蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)是綠藻門單細胞藻類，宋崇崇等［4］提到其具有分布均勻、不易下沉、光合自養(yǎng)、繁殖速度快等特點，且其特殊的網(wǎng)狀細胞壁結構利于重金屬分子吸附于其上，使其整個細胞能與重金屬污染物緊密結合，同時蛋白核小球藻因其個體小、富含葉綠素、易于在室內培養(yǎng)且養(yǎng)殖周期短等特征，是一種理想的毒理學指示生物。此外，NONG Q Y等［5］及LIU B Y等［6］相關研究表明在有毒物質的作用下綠藻能夠產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS的存在則直接干擾或降低綠藻細胞的光合過程從而影響其葉綠素的代謝過程，最終干擾細胞的生長和增殖。同時，ROS的產(chǎn)生會激活細胞的抗氧化酶活性，如SOD和CAT，從而防止自由基在氧化應激過程中對細胞本身造成損傷［7］。目前國內外的研究較多集中在重金屬對藻類的短期毒性效應上，對重金屬毒性的長期效應與藻類耐受機制的研究還較少。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)，2021年4月購買于中國科學院水生生物研究所。

1.2 試驗方法

所用試驗儀器預先消毒滅菌備用。選取BG11培養(yǎng)基，購置于海博生物技術有限公司。配制培養(yǎng)基，滅菌后接種蛋白核小球藻，接種量為1.5 mL/1 500 mL。在光照強度4 000 Lux，溫度（24±2）℃，光暗比12 h:12 h條件下，置于光照培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中為防止細胞沉降，每日定期搖晃錐形瓶3～5次。為了保持穩(wěn)定均衡光照強度，每日隨機調換錐形瓶位置2～3次。

稱取1 g CuSO4·5H2O，定容至 1 000 mL，配制成Cu2+濃度為1 g/L的母液，按預實驗設計Cu2+濃度空白組、低濃度組(0.10 mg/L、0.50 mg/L)、中濃度組(1 mg/L)、高濃度組(2 mg/L)三個梯度制備母液和所需的反應液，并將制備好的培養(yǎng)液滅菌備用［8］。

將接種量為1.5 mL/1 500 mL的藻液于光照強度4 000 Lux，溫度（24±2）℃，光暗比12 h:12 h條件下，置于光照培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)3 d后，測定其初始生理指標（生物量、葉綠素和蛋白質含量），之后將培養(yǎng)后的藻種培養(yǎng)液分裝于250 mL錐形瓶中，每組設置3個平行，加入反應液開始毒理實驗。暴露時長為14 d，采用濁度比色法、考馬斯亮藍法和葉綠素分析法，每隔48 h進行一次生理指標測定。連續(xù)暴露14 d后觀察蛋白核小球藻形態(tài)有無變化。

1.3 試驗指標測定

1.3.1 生物量測定

用721分光光度計測定樣本光密度值(OD680nm)，以確定藻的生長情況。接種后每2 d從培養(yǎng)瓶中取2 mL的藻液稀釋至10 mL，測定其在波長680 nm處的OD值，根據(jù)藻液在680 nm處的OD值，由標準曲線或其直線回歸方程公式Y=0.950 8X+0.012（r2=0.998 5）［9］可得出蛋白核小球藻在不同 Cu2+濃度培養(yǎng)條件下的生物量。

1.3.2 葉綠素含量的測定

取錐形瓶中藻液2 mL，離心（3 000 r/min，5 min），去上清，收集藻餅。置于2 mL 90%丙酮中重懸浮，之后用錫箔紙將離心管完全包裹，在4℃全黑暗條件下抽提24 h，離心（4 000 r/min，10 min），取上清液至10 mL刻度試管中，用90%丙酮定容至5 mL，利用公式：Ca(mg/L)=12.7 OD663nm-2.69 OD645nm；Cb(mg/L)=22.9 OD645nm-4.68 OD663nm；CT(mg/L)=OD652nm×1 000/34.5；測定663 nm、645 nm、652 nm處的樣本吸光度值。

1.3.3 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白核小球藻蛋白質含量。

標準曲線繪制：采用考馬斯亮藍法以牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）為標準品制作標準曲線。稱取20.0 mg牛血清蛋白，用去離子水定容至體積200 mL。分別取 10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL牛血清蛋白加入到1.5 mL離心管中，加雙蒸水定容至100 μL，并設100 μL雙蒸水作為對照。加入1 mL考馬斯亮藍G-250染料（Coomassie brilliant blue，CBB）后混勻，于室溫靜置5 min。取250 μL于酶標板中，在酶標儀中測定595 nm處OD值。以595 nm處吸光值為縱坐標，牛血清蛋白含量（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線:Y=0.0024X+0.7364（r2=0.9972）。

樣品測定：取錐形瓶中藻液3 mL，離心（5 000 r/min，10 min），去上清。藻餅用PBS緩沖液沖洗兩次，加入2 mL 0.35 mol/L的NaOH溶液，震蕩均勻，置于74.5℃水浴69 min。離心（5 000 r/min，10 min），吸取100 μL上清液，加入新的離心管中，加入1 mL CBB染料，室溫靜置5 min，取250 μL于酶標板中，測得595 nm處OD值。按照標準曲線回歸方程計算得出蛋白核小球藻的蛋白質含量［10］。

2 結果

2.1 不同濃度Cu2+長期暴露下蛋白核小球藻生物量的變化

不同濃度Cu2+長期暴露下對蛋白核小球藻生長影響顯著，結果表明，空白對照組中蛋白核小球藻生物量迅速增長在暴露0～4 d，與低濃度組(0.10 mg/L)差異不明顯，同時低濃度組(0.50 mg/L)蛋白核小球藻生物量迅速增長期集中在0～6 d，之后增長速度減緩。這三組蛋白核小株藻生物量達到峰值的時間和生物量分別在第10 d為120.39 mg/L；第4d為118.45 mg/L；第6 d為115.03 mg/L。達到峰值后各組蛋白核小球藻生物量與暴露時間呈負相關(P<0.01)。而中高濃度組（1 mg/L、2 mg/L）的蛋白核小球藻生物量則在0～2 d內含量迅速降低，于第2 d減少至最低值，分別為95.16 mg/L、92.42 mg/L，之后蛋白核小球藻生物量則與暴露時間呈正相關(P>0.05)，如圖1所示。

圖1 蛋白核小球藻在不同濃度Cu2+長期暴露各階段生物量

2.2 不同濃度Cu2+長期暴露下蛋白核小球藻葉綠素含量的變化

2.2.1 不同濃度Cu2+長期暴露下蛋白核小球藻葉綠素a、b含量的變化

蛋白核小球藻葉綠素a和葉綠素b的含量在7個暴露時間節(jié)點（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）下的變化情況。圖2a的結果表明，不同濃度Cu2+長期暴露下對蛋白核小球藻葉綠素a含量影響較大，隨著暴露時間增加，對照組、中濃度組（1 mg/L）和高濃度組（2 mg/L）葉綠素a含量都在8 d內完成了累積并達到峰值分別為1.66 mg/L、2.15 mg/L和1.80 mg/L。但與對照組不同的是中低濃度組中葉綠素a合成在2 d內受到抑制，在第4 d后快速積累至峰值。而低濃度組則都在Cu2+14 d暴露期間出現(xiàn)兩個峰值是在第2 d和第8 d，含量分別為0.93 mg/L、1.22 mg/L和1.50 mg/L、1.71 mg/L。

圖2b的結果表明，隨著暴露時間增加,對照組、低濃度組（0.10 mg/L）和中高濃度組葉綠素b含量都于第8 d達到峰值，分別為2.92 mg/L、3.49 mg/L、4.37 mg/L、3.58 mg/L，后隨暴露時間延長含量逐漸下降。而低濃度組（0.50 mg/L）在則在第10 d達到峰值2.87 mg/L。高濃度組2 d內葉綠素b合成也受抑制，于第2 d降低至最小值0.76 mg/L，之后逐漸升高至峰值且含量高于低濃度組峰值。綜上，就累積速率而言在0～4 d內空白組和低濃度組優(yōu)于中高濃度組，但在4 d后中高濃度組的葉綠素積累速率和峰值顯著高于低濃度組和對照組(P<0.01)，其中又以中濃度試驗組的葉綠素a、b含量最高。

圖2 蛋白核小球藻在不同濃度Cu2+長期暴露各階段葉綠素a、b含量

2.2.2 不同濃度Cu2+長期暴露下蛋白核小球藻葉綠素總含量的變化

如圖3所示，在暴露于Cu2+后的7個時間節(jié)點下（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d），蛋白核小球藻總葉綠素含量的變化情況。結果表明，隨著暴露時間增加對照組總葉綠素含量0～8 d增加迅速，并于第8 d達到峰值4.21 mg/L，后隨暴露時間延長迅速減少。低濃度組（0.10 mg/L）在0～2 d含量迅速增加，2～6 d緩慢增加，后又迅速增加，在第8天達到峰值3.91 mg/L，后隨暴露時間延長含量逐漸減少。低濃度組（0.50 mg/L）在0～2 d含量迅速增加，2～4 d含量降低，后迅速增加，在第8 d達到峰值5.16 mg/L，后隨暴露時間延長含量迅速減少。中濃度組（1 mg/L）在0～4 d含量逐漸升高，4～8 d迅速升高，并于第8 d達到峰值5.83 mg/L，高于低濃度組峰值，之后葉綠素含量隨暴露時間延長迅速減少。高濃度組（2 mg/L）在0～2 d內含量降低，于第2 d降低至最小值1.06 mg/L，2～8 d含量逐漸升高，并于第8 d達到峰值6.27 mg/L，高于中濃度組峰值，其中高濃度組（2 mg/L）在此處含量最高。

圖3 蛋白核小球藻在不同濃度Cu2+長期暴露各階段總葉綠素含量

2.3 不同濃度Cu2+長期暴露下對蛋白核小球藻蛋白質含量的影響

不同濃度Cu2+長期暴露下對蛋白核小球藻蛋白質含量影響較大。如圖4所示，不同濃度組在7個暴露時間節(jié)點（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）下蛋白核小球藻蛋白質的含量變化。結果表明，空白對照組、低濃度組隨著暴露時間增加蛋白質含量分別在0～4 d、0～4 d和0～2 d增加迅速，之后緩慢增加，分別在第10 d、4 d和6 d達到峰值64.56 mg/L、56.94 mg/L和56.64 mg/L，后隨暴露時間延長迅速降低。中濃度組和高濃度組在0～2 d內蛋白質含量減少，于第2 d減少至最小值24.14 mg/L和20.81 mg/L，隨暴露時間延長逐漸升高。且高濃度組中的蛋白質含量于第12 d達到峰值64.06 mg/L。

圖4 蛋白核小球藻在不同濃度Cu2+長期暴露各階段蛋白質含量

2.4 不同濃度Cu2+長期暴露對蛋白核小球藻形態(tài)的作用

圖5為不同濃度Cu2+長期暴露14 d后，400×倍顯微鏡下蛋白核小球藻的細胞形態(tài)，從圖中可看出空白組藻細胞大小形態(tài)均勻且飽滿，而隨著Cu2+濃度增加藻細胞大小出現(xiàn)差異，細胞體積和形態(tài)都有所變化。其中以高濃度組最為明顯，藻細胞密度增大，但形態(tài)大小不一、細胞飽滿度和圓潤程度降低，出現(xiàn)橢圓和扁平的藻細胞。

圖5 蛋白核小球藻在不同濃度Cu2+長期暴露14 d后藻細胞形態(tài)

3 討論

3.1 Cu2+長期暴露對蛋白核小球藻生物的影響

在自然界中Cu2+是生物生長的必需微量元素之一，故而Cu2+存在對生物的生長至關重要，蛋白核小球藻也不例外，即Cu2+的缺乏或者過量都會對細胞生長產(chǎn)生不利影響。該試驗結果表明，蛋白核小球藻經(jīng)Cu2+短期（0～48 h）暴露后，低濃度組促進生長，中高濃度組生長則受到抑制。最可能的原因是低濃度中的藻細胞將Cu2+作為微量營養(yǎng)物質進行吸收利用，從而促進其本身的生長，而這種低濃度促進而高濃度抑制的現(xiàn)象也早已被證實,被稱為生物的自我平衡機制［11-12］。本研究中，Cu2+長期（1.5～15 d）暴露的作用下，空白對照組生物量于第10 d達到峰值120.39 mg/L，低濃度組Cu2+生物量于第4 d和第6 d達到峰值118.45 mg/L和115.03 mg/L，試驗結果表明較低濃度的Cu2+能更快促進蛋白核小球藻生長，在短期內達到最大環(huán)境容納量也驗證了這一機制。相似地在沈國興等［13］研究中也顯示了類似的試驗結果，其在藻液中加入少量芐嘧磺隆，藻細胞會將芐嘧磺隆作為營養(yǎng)物質吸收利用，以促進藻的生長。與之相對的中高濃度組中的蛋白核小球藻細胞在短期內受到強刺激，藻細胞結構受到一定程度的破壞，生理機能受到抑制，生物量迅速降低，于第2 d達到最小值，分別為95.16 mg/L、92.42 mg/L。后隨Cu2+暴露時間延長蛋白核小球藻生物量又逐漸升高，試驗結束前仍處于上升趨勢，這種變化趨勢的可能原因是48 h后藻細胞對Cu2+的耐受性增加，導致其抑制效果降低。而這種耐受性可能是因為多種因素的作用，例如：表面反應或者與金屬復合物性質有關的胞外有機物質的產(chǎn)生等，影響了測試溶液中的金屬化學性質，從而降低了Cu2+對蛋白核小球藻的毒性［14-16］。

3.2 Cu2+長期暴露對蛋白核小球藻中葉綠素含量的影響

葉綠素是藻類光合作用的重要組成。而藻類對重金屬離子極為敏感，重金屬通過抑制葉綠素合成有關酶的活性，來抑制葉綠素的合成，從而影響藻類進行光合作用［17］。史慶華等［18］研究表明適量 Cu2+能提高植物葉綠素含量，而Cu2+過量時對植物產(chǎn)生毒性從而顯著降低其葉綠素含量。一方面，F(xiàn)ERNANDES J C等［19］研究表明Cu2+對藻類生長的影響主要是歸因于引起了許多細胞學過程的故障。另外，也有研究表明，藻類的生長離不開光合作用、細胞分裂等一系列過程，任何一環(huán)節(jié)受到破壞或干擾都會導致藻類生長受阻［20-22］。本研究結果表明，蛋白核小球藻經(jīng)Cu2+長期暴露后，低濃度組在短時間內可較為明顯地促進葉綠素含量生成，隨后緩慢積累，產(chǎn)生耐受性后快速合成，于第8 d達到峰值，后隨暴露延長含量逐漸下降。中高濃度組短期內受到較強抑制，待藻細胞產(chǎn)生耐受性后，葉綠素含量逐漸升高，于第8 d達到峰值，后隨暴露延長迅速減少。其可能原因是低濃度Cu2+有助于蛋白核小球藻對于微量元素的吸收，從而促進了葉綠素a的合成，但過量的Cu2+會導致葉綠素a的分解［23］。另一方面，葉綠素a構成光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）的主要反應中心，而葉綠素b構成光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的主要反應中心。因此，結果表明，在短期內低濃度Cu2+對PSⅠ的作用更明顯，但經(jīng)過長期暴露后Cu2+對葉綠素b的效應明顯大于葉綠素a。因此，蛋白核小球藻對Cu2+毒性的耐受機制主要集中在PSⅡ。

3.3 Cu2+長期暴露與蛋白核小球藻蛋白質含量的關系

銅的毒性效應歸因于活性氧自由基（包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等）的產(chǎn)生而引起的氧化脅迫。而氧化可使蛋清蛋白質羰基含量顯著升高,平均粒徑逐漸增大［24-25］。本試驗結果得出，蛋白核小球藻經(jīng)Cu2+暴露后，低濃度組（0.10 mg/L、0.50 mg/L）促進蛋白質合成，0.50 mg/L Cu2+的蛋白質含量在0～2 d迅速增加，后隨著長期Cu2+暴露蛋白質含量緩慢增加，并于第6 d達到峰值56.64 mg/L；高濃度組（1 mg/L、2 mg/L）抑制蛋白質合成，2 mg/L Cu2+的蛋白質含量在0～2 d內減少，于第2 d減少至最小值20.81 mg/L，后隨著長期Cu2+暴露蛋白質含量逐漸增長，并于第12 d達到峰值64.06 mg/L。有研究認為這是因為在低濃度Cu2+脅迫下，蛋白核小球藻為了合成更多的蛋白質來結合重金屬離子以抵御Cu2+脅迫；高濃度Cu2+通過引起的氧化脅迫從而改變蛋白質的結構特性，造成蛋白質含量的降低［26-27］。

3.4 Cu2+長期暴露對蛋白核小球藻形態(tài)變化的影響

細胞外物質，包括營養(yǎng)物質和污染物質，都需要通過細胞膜進入細胞，而環(huán)境脅迫會造成細胞形態(tài)發(fā)生變化。MAZNAH W O W等［28］研究發(fā)現(xiàn)銅的毒性作用會使小球藻細胞出現(xiàn)溶解和破碎現(xiàn)象，石磊［27］研究表示，重金屬對藻的毒性主要是使核酸組成發(fā)生變化，進而影響細胞生長，并縮小細胞體。本研究在試驗期間觀察發(fā)現(xiàn)，藻細胞在2 mg/L Cu2+濃度的長期（15 d）暴露后，出現(xiàn)形態(tài)變小、細胞飽滿度低、圓潤度低、出現(xiàn)橢圓和扁平等差異。這種藻細胞在重金屬脅迫下出現(xiàn)干癟的情況，可能是由于離子快速在藻細胞內部與外部交換所導致的細胞膜完整性受到損傷［29］。