朱文靚，王淼，王杰，崔寶山 ，劉嘉偉，賈小東，高慶華*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（3塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

精液中細(xì)菌會(huì)抑制精子運(yùn)動(dòng)，降低精子的活力，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，影響精液的保存時(shí)長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，還可能會(huì)使母畜感染生殖系統(tǒng)疾病，威脅到畜群［1-3］。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，使得精子濃度降低，喪失運(yùn)動(dòng)力，精子形態(tài)異常，頂體受損等［4］。研究者為了降低精液中細(xì)菌造成的危害，通常在稀釋液中添加以青鏈霉素為主的抗生素［5］。青鏈霉素作為廣譜抗生素能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性菌［6］，但也有研究表明從精液中分離出的細(xì)菌對(duì)鏈霉素和青霉素具有耐藥性［7］。恩諾沙星是一種殺菌藥物，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)阻斷DNA復(fù)制的旋轉(zhuǎn)酶，破壞細(xì)胞核酸合成，迅速殺滅病原菌，優(yōu)于青鏈霉素［8-9］。目前，恩諾沙星已用于豬（50 μg/L）［9］、牛（400 μg/mL）［10］、山羊（50 μg/mL）［11］的精液稀釋液中，但鮮有綿羊精液稀釋液中添加恩諾沙星的相關(guān)報(bào)道，也沒(méi)有統(tǒng)一的添加量。本試驗(yàn)室研發(fā)的Tris-卵黃專利稀釋液（昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液），用于綿羊精液低溫保存，能有效保存綿羊精液10 d。因此，本研究將0 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL的恩諾沙星分別添加進(jìn)昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液中，并檢測(cè)其低溫保存綿羊精液的效果，確定恩諾沙星適宜添加劑量，為后期的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品及主要試劑

綿羊精液采自塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地具有正常繁殖能力的3只健康公羊（3～4歲）；Tris、檸檬酸、三磷酸腺苷（ATP）、維生素C、牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；果糖、海藻糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；恩諾沙星、姬姆薩染液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉購(gòu)自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；瓊脂粉購(gòu)自上海山浦化工有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)（SHC-CT-22，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；熒光倒置顯微鏡（T1-SM，尼康公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 溶液配制

稀釋液配制：按照昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液配方稱取，去除稀釋液中的青鏈霉素成分，添加不同濃度的恩諾沙星，用三蒸水溶解，磁力攪拌器攪拌30 min后，分裝放入-80℃冰箱避光冷凍保存待用。

福爾馬林磷酸鹽固定液配制：稱取磷酸氫二鈉2.25 g、磷酸二氫鈉0.55 g，加入30 mL生理鹽水，30℃靜置3 h溶解，再加入經(jīng)碳酸鎂飽和的甲醛8 mL，用生理鹽水定容至100 mL。

姬姆薩染液配制：按照姬姆薩濃縮液與姬姆薩稀釋液1:4的比例配制。

培養(yǎng)基的制備：稱取牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂粉10 g放入燒杯中，溶解后用蒸餾水定容至500 mL，過(guò)濾、分裝入250 mL錐形瓶，并用瓶塞塞住，高壓待用。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將5個(gè)不同濃度的恩諾沙星（E0：0 μg/mL；E25：25 μg/mL；E50：50 μg/mL；E75：75 μg/mL；E100：100 μg/mL）添加于昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液中，在低溫保存綿羊精液第0 d，2 d，4 d，6 d，8 d，10 d，12 d時(shí)對(duì)精子活力、頂體完整率及細(xì)菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并比較，每個(gè)樣本檢測(cè)3次。

2.2 樣品采集及稀釋保存

使用電刺激采精法進(jìn)行精液采集，采集的精液放入保溫裝置中迅速送至試驗(yàn)室。將合格的精液按適宜的稀釋比例稀釋后，在2 h內(nèi)緩慢降至0℃，并保存在冰水混合物中。

2.3 精液品質(zhì)檢測(cè)

精子活力檢測(cè)：將保存的精液輕輕混勻，吸取10 μL精液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于37℃載物臺(tái)上，在400倍視野下觀察并計(jì)數(shù)。

精子頂體完整率檢測(cè)：將保存的精液輕輕混勻，吸取10 μL精液滴于載玻片上，用另一潔凈載玻片將其制成抹片，自然風(fēng)干，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，蒸餾水沖洗，自然風(fēng)干，姬姆薩染液染色90 min，蒸餾水沖洗，干燥待檢。

精液細(xì)菌數(shù)檢測(cè)：將保存的精液輕輕混勻，吸取100 μL精液于生理鹽水中稀釋至20倍待用，在超凈工作臺(tái)中的酒精燈火焰旁操作，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL左右培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基未凝固時(shí)加入100 μL稀釋后的精液，混勻，凝固后放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存的綿羊精子活力

如表1所示，隨著低溫保存時(shí)間的增長(zhǎng)，精子活力逐漸下降；E75組精子在低溫保存至12 d時(shí)精子活力達(dá)到50%以上，且E75組精子活力在每一天均高于其余4組，從第8 d開始極顯著高于其余4組（P<0.01）；E0組精子活力除第0 d外，均低于其余4組，從第6 d開始極顯著低于E50組和E75組（P<0.01）。

表1 低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的精子活力 %

3.2 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存的綿羊精子頂體完整率

精子頂體完整效果見圖1，精子頂體完整率變化情況見表2。由表2可見，5組添加不同濃度恩諾沙星的稀釋液低溫保存綿羊精液隨著低溫保存時(shí)間的增長(zhǎng)，精子的頂體完整率呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)；從第6 d開始E0組精子頂體完整率顯著低于其余4組（P<0.05）；E75組精子頂體完整率僅在第10 d顯著高于其余4組（P<0.05），其他天數(shù)均與E25、E50、E100組差異不顯著（P>0.05）。

表2 低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的精子頂體完整率 %%

圖1 精子頂體完整效果圖（400×）

3.3 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存綿羊精液的細(xì)菌數(shù)

如圖2所示，E0組稀釋液低溫保存綿羊精液的細(xì)菌總數(shù)隨著保存時(shí)間的增加逐漸增加，其余4組細(xì)菌數(shù)總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但5組精液的細(xì)菌菌落數(shù)均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)；E0組精液細(xì)菌菌落數(shù)從第4 d開始極顯著高于其余4組（P<0.01）。

圖2 低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的細(xì)菌數(shù)

4 討論

本試驗(yàn)是在昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液中添加5組不同濃度的恩諾沙星低溫保存綿羊精液，分別在不同天數(shù)檢測(cè)精子活力、頂體完整率及細(xì)菌數(shù)。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著低溫保存時(shí)間的增長(zhǎng)，精子活力與頂體完整率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，E75組精子活力在低溫保存至12 d時(shí)仍能達(dá)到國(guó)家鮮精輸精標(biāo)準(zhǔn)，5組精液的細(xì)菌數(shù)均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

恩諾沙星對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原菌都具有抗菌活性，對(duì)廣譜需氧菌和一些兼性厭氧菌具有殺菌作用［10］，并且恩諾沙星對(duì)于精液中的大腸桿菌具有良好的抗菌能力［9］。有研究表明恩諾沙星具有藥效穩(wěn)定、迅速滅菌、無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)［8］。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出5組稀釋液低溫保存綿羊精液精子活力隨著保存時(shí)間的增長(zhǎng)而下降，E0組精子活力在第8 d就已降至50%以下，這可能是因?yàn)镋0組稀釋液中并未添加任何抗生素，精液中細(xì)菌增多，細(xì)菌可能會(huì)與精子競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致精子能量耗竭，降低了精子的活力，這與AKHTER S等［12］研究結(jié)果相似；E50組精子活力在10 d內(nèi)能達(dá)到國(guó)家鮮精輸精標(biāo)準(zhǔn)，與王杰等［13-14］、趙建清等［15］的研究結(jié)果相符；添加75 μg/mL恩諾沙星稀釋液組（E75）精子活力能在12 d內(nèi)達(dá)到50%以上，而添加100 μg/mL恩諾沙星稀釋液組精子活力在第10 d就已降到45%，這說(shuō)明稀釋液中添加適當(dāng)濃度的抗生素能夠抑制精液中微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而延長(zhǎng)精液保存時(shí)間，改善保存精液的品質(zhì)［16］，且稀釋液中抗生素的添加劑量必須有一定的限度。有研究表明精液中含有大腸桿菌會(huì)損害精子頂體，而本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E0組精子從第6 d開始頂體完整率顯著低于其余四組（P<0.05），這可能是因?yàn)镋0組稀釋液未添加恩諾沙星，而恩諾沙星能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)［9］，ANDRABI S M等［17］發(fā)現(xiàn)添加適當(dāng)恩諾沙星的稀釋液保存精子會(huì)使精子頂體完整性更高，這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稀釋液中添加75 μg/mL恩諾沙星低溫保存綿羊精液精子頂體完整率高于其余4組的結(jié)果相似。

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/4143—2008《牛冷凍精液》中明確規(guī)定，每劑量牛冷凍精液中細(xì)菌數(shù)最多不得超過(guò)1 000個(gè)［18］，GB/20557—2006《山羊冷凍精液》中規(guī)定，山羊冷凍精液細(xì)菌數(shù)不得超過(guò)800個(gè)［19］，在本試驗(yàn)中，5組稀釋液低溫保存綿羊精液細(xì)菌數(shù)在12 d內(nèi)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定范圍；ZHANG J等［20］研究發(fā)現(xiàn)精液可能會(huì)在精液采集和加工儲(chǔ)存過(guò)程中被細(xì)菌污染，精液中存在細(xì)菌會(huì)對(duì)精液質(zhì)量和生育力有負(fù)面影響，本試驗(yàn)中添加恩諾沙星的處理組隨低溫保存時(shí)間的增長(zhǎng)細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，細(xì)菌數(shù)上升，精子活力下降，這與WANG H等［21］研究結(jié)果相一致。E0組精液稀釋液低溫保存綿羊精液細(xì)菌數(shù)除第1 d外均高于其余4組，從第4 d開始極顯著高于其余4組，這是因?yàn)镋0組稀釋液中并未添加恩諾沙星，而恩諾沙星能夠通過(guò)抑制DNA的合成從而對(duì)廣泛的病原菌具有殺菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原菌與革蘭氏陰性病原菌均有殺菌作用［22］；本試驗(yàn)結(jié)果表明添加75 μg/mL恩諾沙星的昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液低溫保存綿羊精液的效果較優(yōu)，與茆達(dá)干等［11］研究發(fā)現(xiàn)在稀釋液中添加50 μg/mL恩諾沙星低溫保存波爾山羊精液效果較好的結(jié)果不同，可能是因?yàn)橄♂屢撼煞植灰恢?，并且其并未?duì)恩諾沙星的添加劑量進(jìn)行篩選。本試驗(yàn)確定了恩諾沙星適宜添加劑量，為后續(xù)研究卵黃稀釋液中添加恩諾沙星低溫保存綿羊精子效果研究奠定一定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)在昆侖Ⅰ號(hào)稀釋液中添加75 μg/mL恩諾沙星低溫保存綿羊精液效果最優(yōu)，精子活力在第12 d仍能達(dá)到50%以上，可對(duì)綿羊精液進(jìn)行低溫長(zhǎng)效保存。