曲子妹，王 脈，王 樹，薛貴平

（河北北方學(xué)院 藥學(xué)系 河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000）

大黃酚具有抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、改善學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙、保護(hù)心肌等多種藥理活性[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)大黃酚在體內(nèi)可增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠腦組織的耐缺氧能力[5]。體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃酚對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力強(qiáng)于大黃中其他游離蒽醌成分[6]。但大黃酚易被氧化，穩(wěn)定性較差。

多項(xiàng)研究證實(shí)中藥單體的金屬配合物的藥理活性較單體增強(qiáng)，說明中藥單體與金屬離子具有協(xié)同作用[6-7]?；谇捌谥兴巻误w金屬配合物的研究基礎(chǔ)[8]，本研究以天然有機(jī)活性物質(zhì)大黃酚為先導(dǎo)化合物，合成了大黃酚-鋅金屬配合物，并測定其配位前后的抗氧化活性，為中藥新藥的開發(fā)提供思路和方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA1245型分析天平[十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KS-6000超聲波清洗機(jī)（寧波科生儀器廠）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；ELITIST 5K-R型立式低速冷凍離心機(jī)（長沙市鑫奧儀器儀表有限公司）；DHG-9140AS型真空干燥箱（寧波江南儀器廠）；UV9100 B型紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器（美國Waters公司）；Vario EL III元素分析儀（德國Elementar 公司）；Agilent 7700 電感耦合等離子質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Tensor II型傅立葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）。

1.2 藥品與試劑

大黃酚（批號(hào)：20041611），無水氯化鋅（上海鼎瑞化工有限公司）；鄰苯三酚，1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海瑞永生物科技有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，北京Biotopped Science & Technology公司）；水楊酸（天津市北辰方正試劑廠）；七水合硫酸亞鐵[福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]；維生素C（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇，無水甲醇，乙酸乙酯，二甲基亞砜（DMSO，天津大茂化學(xué)試劑廠）；雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制；主要試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃酚-鋅的合成

精密稱取大黃酚254.0 mg，置于三頸燒瓶中，加入適量無水乙醇，氮?dú)猸h(huán)境下，40 ℃下加熱攪拌溶解。精密稱取68.0 mg無水氯化鋅，溶于適量無水乙醇后，滴入大黃酚無水乙醇溶液中，此時(shí)大黃酚醇溶液由黃色變?yōu)槌壬Ｓ肗H3·H2OCH3CH2OH溶液（v:v=1:1）調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至7.0，溶液變渾濁，有紅棕色沉淀生成，回流4 h?；亓鹘Y(jié)束，反應(yīng)液冷卻至室溫，2500 r/min離心5 min，用乙酸乙酯、無水乙醇洗滌沉淀，真空干燥24 h，得紅棕色粉末，產(chǎn)率為83.2 %。

2.2 大黃酚-鋅的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外可見分光光度法 將大黃酚及大黃酚-鋅用無水甲醇溶解，配成濃度為1.0×10-4mol/L的溶液，進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，掃描范圍為220～600 nm。大黃酚-鋅的峰形與大黃酚基本一致，只是吸收峰的位置及強(qiáng)度發(fā)生了改變，見圖1。

圖1 大黃酚-鋅與大黃酚的紫外-可見光譜

大黃酚在225，256，287 nm處有3個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，是苯環(huán)共軛體系與醌樣結(jié)構(gòu)譜帶；而大黃酚-鋅在228，258，288 nm出現(xiàn)吸收峰。大黃酚在428 nm處的吸收峰為醌羰基吸收譜帶，大黃酚-鋅在432 nm出現(xiàn)醌羰基吸收譜帶。此外大黃酚-鋅在516 nm左右出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。通過比較得出，大黃酚-鋅在苯環(huán)共軛體系與醌樣結(jié)構(gòu)譜帶處的吸收峰有輕微的紅移現(xiàn)象。且醌羰基吸收峰位移較大。結(jié)果見表1。

表1 大黃酚-鋅與大黃酚的紫外吸收峰

2.2.2 紅外光譜分析 采用KBr壓片法，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)對(duì)大黃酚及其金屬配合物進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖2。

圖2 大黃酚-鋅與大黃酚的紅外譜圖

大黃酚-鋅在1400～1500 cm-1處的苯環(huán)骨架的吸收峰基本無變化。其中，大黃酚的1, 8位酚羥基可與9位醌羰基中的O形成分子內(nèi)氫鍵，因此，在2924 cm-1處為締合羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，而在配合物的圖譜中，該峰明顯減弱。此外，C=O伸縮振動(dòng)峰在大黃酚中位于1628 cm-1，但在大黃酚-鋅中位于1605 cm-1，大黃酚-鋅中的C=O伸縮振動(dòng)峰移至低波數(shù)處，在520～559 cm-1間出現(xiàn)了M(II)-O伸縮振動(dòng)吸收峰。結(jié)果見表2。

表2 大黃酚-鋅與大黃酚的主要紅外吸收峰

2.2.3 鋅的含量測定 取適量大黃酚-鋅，用酸消解，消解霧化后上機(jī)測試，檢測配合物中金屬元素的含量。由參考文獻(xiàn)[9]得知蒽醌與金屬鹽的化學(xué)計(jì)量比為2:1或者1:1，大黃酚-鋅中鋅元素含量的實(shí)測值是11.57 %，大黃酚與鋅的化學(xué)計(jì)量比為2:1時(shí)的鋅元素含量理論值是11.43 %。因此推測出大黃酚與鋅的化學(xué)計(jì)量比為2:1。金屬配合物的可能組成為C30H18O8Zn。

2.2.4 質(zhì)譜分析 取適量大黃酚-鋅，溶于DMSO，上機(jī)測試，收集離子峰。[M+H]+為573，其相對(duì)分子質(zhì)量為572。

2.2.5 元素分析 稱取適量大黃酚-鋅，以He為載氣，加O2燃燒，檢測樣品中的C、H、N含量，結(jié)果見表3。

表3 大黃酚-鋅的元素含量

根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量及元素含量得出金屬配合物的分子式為C30H18O8Zn，與推測的可能組成相吻合。

2.3 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

分別取20，40，60，80 mg/L大黃酚和大黃酚-鋅樣品溶液1.0 ml，置于4 ml EP管中，再加入0.02 mmol/L DPPH溶液3.0 ml，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min。以無水乙醇為空白，測定A517值，重復(fù)3次，求平均值，記為As。分別用相同體積的DMSO代替樣品溶液，相同體積的無水乙醇代替DPPH溶液，相同條件下法測定吸光度，記為A0和Ac，維生素C作為陽性對(duì)照。

DPPH自由基清除率（%）= （A0-（As-Ac））/A0×100

實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，大黃酚和大黃酚-鋅對(duì)DPPH自由基的清除率分別為6.47 %～57.4 %和27.0 %～86.3 %，大黃酚和大黃酚-鋅對(duì)DPPH自由基的清除率與樣品的濃度呈正相關(guān)。結(jié)果表明二者對(duì)DPPH自由基均有清除作用，但大黃酚-鋅自由基清除作用強(qiáng)于大黃酚。結(jié)果見表4。

表4 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.4 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)羥基自由基（OH·）清除能力的測定

采用芬頓-水楊酸法，在EP管中依次加2.0 mmol/L FeSO4溶液0.48 ml，1.0 mmol/L H2O2溶液0.48 ml，不同濃度（20，40，60，80，100 mg/L）的大黃酚溶液和大黃酚-鋅溶液1.0 ml，37 ℃水浴中加熱15 min后，再加入6.0 mmol/L水楊酸溶液0.48 ml，繼續(xù)在37 ℃水浴中加熱15 min，取出后用雙蒸水補(bǔ)充體積至4.0 ml，搖勻，以雙蒸水為對(duì)照，測定溶液510 nm處的吸光度值，重復(fù)3次，求平均值，記為As。分別用相同體積的DMSO代替樣品溶液，相同體積的雙蒸水代替H2O2溶液，相同條件下測定吸光度，記為A0和Ac，維生素C作為陽性對(duì)照。

OH·清除率（%）=（A0-（As-Ac））/A0×100

實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，大黃酚的OH·清除率為9.88 %～59.4 %，大黃酚-鋅OH·清除率為31.6 %～91.3 %，作用呈劑量依賴性。較高濃度時(shí)，大黃酚-鋅的OH·清除能力高于維生素C，表明大黃酚-鋅有較好的抗氧化性能。結(jié)果見表5。

表5 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)OH·的清除作用

2.5 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)O2-·清除能力的測定

在EP管中加入0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2）2.0 ml，分別加入不同濃度（20，40，60，80 mg/L）的大黃酚溶液和大黃酚-鋅溶液1.0 ml，再加入2.0 mmol/L鄰苯三酚溶液0.12 ml，以雙蒸水為空白，測定322 nm處吸光度（A）值，每30 s記錄一次，共反應(yīng)4 min。以t為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，直線回歸得到的斜率即為V1。重復(fù)測定3次，求平均值。用相同體積的DMSO代替樣品溶液，相同條件測定吸光度，其直線斜率記為V0。維生素C作為陽性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，大黃酚的O2-·清除率范圍是3.69 %～54.6 %，大黃酚-鋅的O2-·清除率范圍是27.2 %～84.6 %，作用呈劑量依賴性。且較高濃度的大黃酚-鋅O2-·清除能力高于維生素C，表明大黃酚-鋅有較好的抗氧化性能。結(jié)果見表6。

表6 大黃酚及大黃酚-鋅對(duì)O2-·自由基的清除作用

3 小結(jié)

大黃酚是蒽醌類化合物，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性。但由于其含多個(gè)酚羥基，易被氧化，使其對(duì)自由基的清除能力受到限制。本研究結(jié)果表明，鋅與大黃酚配位后，其穩(wěn)定性增加，抗氧化活性增強(qiáng)，說明金屬元素與大黃酚經(jīng)過配位反應(yīng)產(chǎn)生了協(xié)同作用，表明大黃酚金屬配合物在抗氧化活性方面有良好的開發(fā)前景。