周嬌嬌，張青萍，吳成挺，李果，何業(yè)輝，吳鵬

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西南寧 530200

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530023

癲癇的發(fā)作與腦神經(jīng)元的異常過(guò)度放電有關(guān)，是以突發(fā)性或暫時(shí)性的意識(shí)、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)或精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。流行病學(xué)顯示，癲癇的全球患病率為 7.6‰，其中10%～20%的患者停藥后容易復(fù)發(fā)[3]。目前臨床應(yīng)用丙戊酸鈉、苯妥英鈉、卡馬西平等西藥抗癲癇治療，這些藥物治療癲癇的臨床療效雖然得到了肯定，但卻存在著共濟(jì)失調(diào)、眩暈頭痛、過(guò)敏等不良反應(yīng)，部分患者常常因不能耐受而中斷治療[4]。因此迫切需要副作用更小，療效更穩(wěn)定的新藥來(lái)進(jìn)一步補(bǔ)充。中藥治療癲癇具有療效好、副作用小，整體辨證施治的特點(diǎn)，可在一定程度上彌補(bǔ)西醫(yī)治療的不足，得到越來(lái)越多學(xué)者的認(rèn)可[5]。

癲癇屬于中醫(yī)“癇病”“癇證”“癲疾”的范疇，與風(fēng)、痰、熱、瘀、毒等病理因素密切相關(guān)[6-7]。《內(nèi)經(jīng)》有言“諸風(fēng)掉眩皆屬于肝，熱盛動(dòng)風(fēng)，風(fēng)勝則動(dòng)”，《醫(yī)方考》曰：“癲疾者，風(fēng)痰之故也……風(fēng)熱盛于肝，則一身之筋牽掣，故令手足搐溺也”，均表明癇病的發(fā)病與肝熱盛、肝陽(yáng)亢密切相關(guān)。因此，臨床上治療癇病中醫(yī)辨治注重“清肝瀉火”[8-9]?！般^藤-黃芩”是導(dǎo)師治療癲癇的常用藥，臨床療效顯著，鉤藤首載于陶弘景《名醫(yī)別錄》，其味甘，性凉，“入足厥陰肝經(jīng)，瀉濕清風(fēng)，止驚安悸”，既清肝熱，平肝陽(yáng)，又能息風(fēng)定驚止痙。黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦，性寒，主入少陽(yáng)經(jīng) ，善清中上焦?jié)駸?，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功。鉤藤、黃芩相使為用，黃芩可增強(qiáng)鉤藤清肝熱平肝陽(yáng)之功效，大大提高了治療肝火痰熱癲癇的臨床效果。現(xiàn)代藥理研究顯示，鉤藤具有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥癲癇、保護(hù)心肌、降壓、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[10-11]。黃芩既可抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)，亦可抗癲癇[12]，其中黃芩有效成分黃芩苷保護(hù)神經(jīng)元、抗癲癇作用已在試驗(yàn)觀察中得到證實(shí)[13-15]，但目前尚沒(méi)有確切的證據(jù)表明“鉤藤-黃芩”兩者合用能有效地改善癲癇的癥狀，所以發(fā)現(xiàn)治療癲癇的關(guān)鍵活性成分及潛在作用機(jī)制尤為重要，以更好的應(yīng)用于臨床上治療癲癇病。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以“藥物-有效成分-基因-疾病”為關(guān)系網(wǎng)，從系統(tǒng)生物學(xué)與生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度剖析中藥治療疾病的作用靶點(diǎn)，從而預(yù)測(cè)出藥物的潛在作用機(jī)制的一種新興研究方法[16]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來(lái)剖析“鉤藤-黃芩”治療癲癇的潛在作用機(jī)制，以期于臨床上對(duì)癲癇的治療提供相關(guān)的參考。

鉤藤和黃芩有效成分篩選

本研究運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform），分 別以“鉤藤”和“黃芩”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，檢索其有效活性成分。

1 鉤藤和黃芩作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）查詢(xún)其活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，將靶點(diǎn)名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化，整理后去除重復(fù)值，獲得最終中藥作用靶點(diǎn)。

2 癲癇相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“epilepsy”為 檢 索 詞，運(yùn) 用OMIM 、CTD、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索癲癇疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)出結(jié)果，整合各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的疾病靶點(diǎn)，利用Excel去除重復(fù)項(xiàng)得到癲癇相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

3 獲取“鉤藤-黃芩”靶點(diǎn)與癲癇靶點(diǎn)的交集

借助Venny2.1在線(xiàn)軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），把“鉤藤-黃芩”作用靶點(diǎn)與癲癇靶點(diǎn)取交集，得到“鉤藤-黃芩”治療癲癇的關(guān)鍵靶點(diǎn)，即中藥-疾病共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖（見(jiàn)圖1）。

4 中藥-有效成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.8.2軟件繪制并構(gòu)建中藥-有效成分-靶基因-疾病調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），將1.1獲得的“鉤藤-黃芩”有效活性成分和1.4獲得的“鉤藤-黃芩”與癲癇交集靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)及拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析。

5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因的篩選

將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入string11.0在線(xiàn)軟 件（https://string-db.org/），在“Organism”中 選 擇“homo sapiens”，保存string_interactions.tsv文件，運(yùn)用Cytoscope3.8.2軟件對(duì)該文件節(jié)點(diǎn)分析排序處理（見(jiàn)圖3）。再運(yùn)用R軟件中的count.R對(duì)該文件進(jìn)行運(yùn)算，最終得出PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因條形圖（見(jiàn)圖4）。

6 中藥-疾病靶點(diǎn)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

下載clusterProfilerGO.R功能包將1.4中藥-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算分析，得到GO功能富集分析（見(jiàn)圖5）和KEGG通路富集分析（見(jiàn)圖6），以P≦0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，取前20的結(jié)果。

結(jié) 果

1 鉤藤有效成分和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到主要有效成分鉤藤33個(gè)，黃芩36個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后，共獲得66個(gè)目標(biāo)成分，檢索得到對(duì)應(yīng)的鉤藤相關(guān)靶點(diǎn)1074個(gè)，黃芩相關(guān)靶點(diǎn)1203個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后得到鉤藤對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)103個(gè)，黃芩對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)53個(gè)，合計(jì)“鉤藤-黃芩”作用靶點(diǎn)156個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)113個(gè)。

2 中藥-疾病靶點(diǎn)構(gòu)建結(jié)果

圖1韋恩圖表明中藥-疾病公共靶點(diǎn)即交集靶點(diǎn)46個(gè)。其中癲癇疾病相關(guān)靶點(diǎn)1716個(gè)，“鉤藤-黃芩”靶點(diǎn)113個(gè)。

圖1 中藥-疾病靶點(diǎn)

3 中藥-有效成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

運(yùn)用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建的中藥-有效成分-靶基因-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖2），發(fā)現(xiàn)“鉤藤-黃芩”主要通過(guò)66種有效活性成分作用于46個(gè)靶點(diǎn)，這46個(gè)靶點(diǎn)基因可能對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。其中紅色六邊形代表癲癇（癲癇），藍(lán)色、黃色八邊形分別代表鉤藤、黃芩，紫色橢圓形代表鉤藤-黃芩的有效成分，綠色菱形代表“鉤藤-黃芩”與癲癇的共同靶點(diǎn)基因。

圖2 中藥-有效成分-靶基因-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

由圖3、圖4可知，利用Cytoscape3.8.2軟件，根據(jù)Degree值對(duì)46個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行有序排列，排在前5的靶點(diǎn)依次為IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS，所以IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS最有可能成為核心靶點(diǎn)基因。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因條形圖

5 GO功能富集分析

最終得到107條GO生物學(xué)過(guò)程，均符合P≤0.05，“鉤藤-黃芩”治療癲癇的核心靶點(diǎn)GO功能富集分析見(jiàn)圖5（選取具有代表性的前20條），可知“鉤藤-黃芩”治療癲癇的核心靶點(diǎn)的GO功能主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、藥物結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、肽結(jié)合等。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

6 KEGG通路富集分析

共獲得106條KEGG信號(hào)通路，P均≦0.05，“鉤藤-黃芩”治療癲癇的KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖6，并構(gòu)建通路-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（取前30條，見(jiàn)圖7）。說(shuō)明“鉤藤-黃芩”可能通過(guò)作用于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等治療癲癇。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 通路-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

1 潛在有效成分

本研究預(yù)測(cè)“鉤藤-黃芩”作用于癲癇的主要成分包括Rhynchophylline（鉤藤堿）、Baicalein（黃芩素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 quercetin（槲皮素）。其中發(fā)揮抗癲癇作用的有效成分主要為鉤藤堿，其抗癇機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿不僅可減少內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)（mEC）Ⅲ層神經(jīng)元凋亡，使mECⅡ?qū)由窠?jīng)元的自發(fā)性癲癇樣放電終止，還可以通過(guò)抑制持續(xù)鈉電流和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體電流來(lái)抑制神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度興奮，從而有效降低大鼠動(dòng)物模型癲癇發(fā)作程度[17]。黃芩素不僅可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗神經(jīng)細(xì)胞毒性和抑制神經(jīng)元凋亡等分子機(jī)制對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用[18-20]，還可以抗癲癰并改善大腦認(rèn)知功能，Xu Qian[21]等通過(guò)研究進(jìn)一步證明黃芩素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素等多種途徑，從而減少癲癇大鼠海馬損害，改善大鼠認(rèn)知功能。β-谷甾醇可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮其抗炎、抗氧化、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[22]，董雪等[23]研究證實(shí)了β-谷甾醇不僅對(duì)海馬神經(jīng)元無(wú)毒性，還可以保護(hù)神經(jīng)元并用于癲癇的治療。BDNF是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，主要參與神經(jīng)細(xì)胞分化，神經(jīng)遞質(zhì)合成及海馬的興奮性，癲癇發(fā)生時(shí)BDNF表達(dá)增加，槲皮素可干預(yù)并降低癲癇大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA的上調(diào)，發(fā)揮其抗癲癇作用[24]。

2 關(guān)鍵基因靶點(diǎn)

本研究預(yù)測(cè)白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、Fos等是“鉤藤-黃芩”治療癲癇的潛在基因靶點(diǎn)，其中EGFR、Fos與癲癇關(guān)系目前研究較少，IL-6、VEGFA、CASP3等相關(guān)靶點(diǎn)基因與癲癇的發(fā)生更為密切，IL-6是一種多效性的低分子量炎癥因子，為炎癥相關(guān)通路的上游介質(zhì)，是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要且敏感的標(biāo)志物[25]。而癲癇發(fā)作的機(jī)制與炎癥密切相關(guān)，在某些特殊類(lèi)型的癲癇綜合征（如Rasmussen綜合征）中，IL-6指標(biāo)顯著上升[26-27]。諸多研究表明炎癥因子IL-6在癲癇起源區(qū)域以及播散區(qū)域的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，同時(shí)該區(qū)域炎性因子的受體蛋白上調(diào)，并通過(guò)細(xì)胞的自分泌或者旁分泌系統(tǒng)啟動(dòng)相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而導(dǎo)致癲癇的發(fā)作[28]。由此可見(jiàn)，炎癥因素是癲癇反復(fù)、長(zhǎng)期發(fā)作的重要機(jī)制之一，因此通過(guò)檢測(cè)患者血清IL-6水平可很好的了解患者癲癇發(fā)作的炎性反應(yīng)情況。VEGF主要由神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，具有增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成以及保護(hù)神經(jīng)組織等作用，大量研究表明，VEGF可直接作用于神經(jīng)細(xì)胞，參與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程[29]。癲癇發(fā)作后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的VEGF表達(dá)上調(diào)，可拮抗癲癇發(fā)作所導(dǎo)致的神經(jīng)退化。另外，癲癇發(fā)作后可出現(xiàn)腦內(nèi)血氧不足的情況，缺氧則易導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損，而VEGF能抗細(xì)胞凋亡[30]。Caspase家族在細(xì)胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-3的激活是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。在癲癇病中，隨著神經(jīng)元的凋亡，Caspase-3表達(dá)增加，丁春曉等[31]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證了Caspase-3參與癲癇所致的神經(jīng)元凋亡的過(guò)程。

3 KEGG分析

利用R語(yǔ)言預(yù)測(cè) KEGG 通路，發(fā)現(xiàn)“鉤藤-黃芩”主要可能通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等途徑發(fā)揮對(duì)癲癇的作用。

PI3K-Akt、TNF、IL-17、AGE-RAGE四條信號(hào)通路主要參與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖與凋亡。PI3K-Akt信號(hào)通路是一條經(jīng)典的抑制細(xì)胞凋亡與促進(jìn)細(xì)胞存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，PI3K為上游信號(hào)，可以激活并促使其下游AKT磷酸化的發(fā)生，并參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的整個(gè)過(guò)程，促使細(xì)胞自噬凋亡、能量代謝與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。PI3K-Akt信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以在一定程度上抑制炎癥通路的激活及相關(guān)炎癥因子的釋放，從而減輕對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷[32]。PI3K-Akt通路的激活在缺血缺氧性神經(jīng)元損傷中起著重要作用，若在癲癇發(fā)作干預(yù)該信號(hào)通路，可以降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生而減輕腦損傷[33-35]。李萍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路與海馬組織細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，激活PI3K/AKT通路可抑制其下游凋亡信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡。TNF信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡，同時(shí)TNF在參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程能夠引起炎性病理?yè)p害，進(jìn)而直接或間接的導(dǎo)致腦組織損傷[37]，TNF還能介導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，從而參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程[38]。IL-17信號(hào)通路也同樣起介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[39]，M.Lv通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷的大鼠大腦皮層中，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中釋放的IL-17可加速神經(jīng)元的死亡，下調(diào)IL-17的生成可明顯使神經(jīng)元的凋亡減少[40]。Mao等[41]觀察到IL-17在癲癇患者的腦脊液及血清中明顯增加，并且與癲癇發(fā)作強(qiáng)度呈正相關(guān)。已有研究證實(shí)RAGE也可干預(yù)一系列炎癥信號(hào)，同時(shí)RAGE也參與癲癇發(fā)作的炎癥反應(yīng)[42]。由以上四條信號(hào)通路推測(cè)“鉤藤-黃芩”的有效成分可以通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)及降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡以達(dá)到治療癲癇的作用。

在癲癇發(fā)作導(dǎo)致的腦損傷中，可出現(xiàn)腦缺血缺氧反應(yīng)，而HIF-1信號(hào)通路在癲癇發(fā)作中可被啟動(dòng)，并且在組織缺氧狀態(tài)下的表達(dá)增加以抑制缺氧狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞的分化[43]。由此推測(cè)，“鉤藤-黃芩”還可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的適應(yīng)性來(lái)治療癲癇。

結(jié) 語(yǔ)

綜上，本研究推測(cè)出“鉤藤-黃芩”可通過(guò)鉤藤堿、黃芩素、β-谷甾醇、槲皮素等66個(gè)有效活性成分調(diào)控IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS等46個(gè)癲癇病的疾病靶點(diǎn)，影響炎癥應(yīng)答、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程及PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療癲癇的作用，為后續(xù)深入研究“鉤藤-黃芩”治療癲癇提供了理論依據(jù)，為“鉤藤-黃芩”藥物的開(kāi)發(fā)利用提供新思路，但仍需進(jìn)一步加強(qiáng)試驗(yàn)研究及驗(yàn)證，為更深層次的充分挖掘奠定基礎(chǔ)。