王攀，唐成劍，周長征

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410007

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）又稱腰椎間盤纖維環(huán)破裂髓核突出癥，是指因腰椎間盤發(fā)生退變，纖維環(huán)和髓核含水量減少，髓核失去彈性，在外力作用下使纖維環(huán)破裂、髓核突出，刺激或壓迫硬脊膜及神經(jīng)根，而引起以腰痛及下肢坐骨神經(jīng)放射痛為特征的疾病[1]。其臨床表現(xiàn)多以腰痛、下肢疼痛、馬尾神經(jīng)癥狀為主。LDH的發(fā)病機(jī)制主要包括椎間盤退變、機(jī)械應(yīng)力損傷、免疫炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡等[2]。本病好發(fā)于20～40歲青壯年，男多于女，是臨床最常見的腰腿痛疾患之一。下腰部是全身應(yīng)力的中點(diǎn)，負(fù)重及活動度大，損傷概率高，是LDH的好發(fā)部位。其中以L4-5椎間盤發(fā)病率最高，L5-S1椎間盤次之。西醫(yī)對于本病主要采用改善循環(huán)、消炎鎮(zhèn)痛、脫水消腫、營養(yǎng)神經(jīng)等對癥支持治療，嚴(yán)重時需配合手術(shù)治療。而臨床上絕大多數(shù)患者不具有明顯的手術(shù)指征，相比之下，中醫(yī)中藥治療本病得到了廣泛的認(rèn)可。

中醫(yī)學(xué)將LDH歸屬于“腰痛”“痹證”的范疇。病證具有本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)。其病因病機(jī)在于肝腎不足，筋骨不健，復(fù)受扭挫，或感受風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)痹阻，氣滯血瘀，不通則痛。病延日久，則氣血亦虛，瘀滯凝結(jié)，纏綿難愈[3]。木瓜，其性溫，味酸，歸肝、脾經(jīng)，長于舒筋活絡(luò)、和胃化濕，善于治療濕痹、筋脈拘攣、腰膝酸重疼痛；淫羊藿，其性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，長于補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，善于治療腎虛筋骨萎軟、風(fēng)寒痹痛?！侗静菡x》[4]云淫羊藿善于走竄，其性走而不守，對于風(fēng)寒濕三氣侵襲筋脈、阻滯經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)活動屈伸不利等癥尤為適宜；二藥相配伍，標(biāo)本兼治，剛?cè)岵?jì)，常作為藥對用于痹證的治療。現(xiàn)代研究[5]表明，木瓜苷可以抑制NF-κB P65和TNF-α的表達(dá)，從而減緩炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。淫羊藿可提高退變椎體骨組織Ca和P的含量，下調(diào)血清中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的水平，具有阻止炎性反應(yīng)和抑制椎間盤退變的作用[6]。因此，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從分子水平初步闡明木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的潛在作用機(jī)制，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 “木瓜-淫羊藿”藥對有效成分的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）上檢索出木瓜-淫羊藿的所有化學(xué)成分。生物利用度（Oral bioavailability，OB）是指制劑中藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，是反映所給藥物進(jìn)入人體循環(huán)的藥量比例。類藥性（drug-likeness，DL）指化合物與已知藥物的相似性。具有類藥性的化合物并不是藥物，但具有成為藥物的可能。將OB≥30%和DL≥0.18作為條件，篩選出藥對的有效成分。

2 藥對有效成分的靶點(diǎn)預(yù)測與基因注釋

通過TCMSP預(yù)測木瓜-淫羊藿有效成分的對應(yīng)靶點(diǎn)，并通過Perl軟件和Universal Protein數(shù)據(jù)庫對預(yù)測出的靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋。

3 疾病靶點(diǎn)和木瓜-淫羊藿藥對靶點(diǎn)基因交集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數(shù) 據(jù) 庫 中，以“Lumbar disc herniation”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，剔除兩個數(shù)據(jù)庫中得到的相同的靶點(diǎn)基因，從而得到疾病的靶點(diǎn)基因。再利用R軟件將疾病的靶點(diǎn)基因與木瓜-淫羊藿藥對的靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集分析，并繪制出韋恩圖。

4 構(gòu)建中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將木瓜-淫羊藿藥對的有效成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)基因與剛獲得的交集靶點(diǎn)基因等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建藥物-有效成分-共同靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)。

5 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將木瓜-淫羊藿藥對與疾病的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring軟件，物種選擇為“Homo sapiens”，設(shè)置最小互作力為0.4，隱藏多余的點(diǎn)，構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)出相關(guān)的數(shù)據(jù)文件，運(yùn)用R軟件對剛導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析，并繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)條形圖。

6 GO和KEGG富集分析

將木瓜-淫羊藿藥對與疾病的共同靶點(diǎn)基因等數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，并繪制出柱狀圖和氣泡圖，得到可能相關(guān)的作用通路圖。

結(jié) 果

1 “木瓜-淫羊藿”藥對有效成分獲取結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫分別以“木瓜”、“淫羊藿”為檢索詞進(jìn)行檢索，并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，刪掉重復(fù)數(shù)據(jù)，最后得到藥對有效成分一共26個，其中木瓜4個，淫羊藿22個，見表1。

表1 木瓜-淫羊藿藥對有效成分

2 藥對有效成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中預(yù)測藥對有效成分的對應(yīng)靶點(diǎn)，再通過Perl軟件和Universal Protein數(shù)據(jù)庫對預(yù)測出的靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最后得到藥對有效成分對 應(yīng)靶點(diǎn)一共403個，其中木瓜141個，淫羊藿262個。

3 疾病靶點(diǎn)和木瓜-淫羊藿藥對靶點(diǎn)基因交集結(jié)果

在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到“Lumbar disc herniation”相關(guān)的靶點(diǎn)基因，剔除兩者中相同的靶點(diǎn)基因后獲得461個疾病靶點(diǎn)基因，利用R軟件將疾病的靶點(diǎn)基因與木瓜-淫羊藿藥對的靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集分析，得到51個交集靶點(diǎn)基因，并繪制出韋恩圖（見圖1）。

圖1 疾病與木瓜-淫羊藿藥對靶點(diǎn)基因韋恩圖

4 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過Cytoscape軟件對木瓜-淫羊藿藥對的有效成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)基因與交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，得到藥物-有效成分-共同靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。如圖所示，六邊形代表藥對木瓜-淫羊藿（MY），三角形代表藥對木瓜-淫羊藿的有效成分，菱形代表疾病LDH（Lumbar disc herniation），橢圓形代表疾病LDH與藥對木瓜-淫羊藿的共同靶點(diǎn)基因。由圖得知，藥對木瓜-淫羊藿主要通過18個有效成分共同作用于51個靶點(diǎn)基因，從而進(jìn)一步調(diào)控疾病LDH的發(fā)生發(fā)展。

圖2 藥物-有效成分-共同靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

5 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過String軟件構(gòu)建出木瓜-淫羊藿藥對治療LDH相關(guān)靶點(diǎn)基因的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。運(yùn)用R軟件對導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析，篩選出其主要的靶點(diǎn)基因，并繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)條形圖（見圖4）。其中Degree值排在前5的靶點(diǎn)基因作為核心靶點(diǎn)基因，分別是白細(xì)胞介素-6（IL6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）、白細(xì)胞介素-1β（IL1B）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）。這充分表明此5個靶點(diǎn)可能是木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH靶點(diǎn)互作關(guān)系barplot圖

6 GO富集分析結(jié)果

將木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的核心靶點(diǎn)基因?qū)隦軟件進(jìn)行GO富集分析，得到GO柱狀圖（見圖5）和GO氣泡圖（見圖6）。圖中木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的核心靶點(diǎn)基因的GO功能主要包括細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、受體-配體活性（receptor ligand activity）、信 號 受 體 激 活 劑 活 性（signaling receptor activator activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、生長因子受體結(jié)合（growth factor receptor binding）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、絲氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway）、整合素結(jié)合（integrin binding）、生長因子活性（growth factor activity）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過程（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）、血紅素結(jié)合（heme binding）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II-specific DNAbinding transcription factor binding）、激 酶 激 活 因 子（kinase activator activity）、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性（protein kinase regulator activity）等。柱狀圖和氣泡圖左側(cè)為GO名稱；柱狀圖下面的數(shù)字及氣泡圖中氣泡的大小表示富集在GO上的基因數(shù)量，數(shù)字及氣泡越大，表示富集基因越多；右側(cè)的p.adjust表示富集程度，其值越小，表示富集程度越高，對應(yīng)柱狀圖和氣泡圖的顏色也就越紅。

圖5 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的GO柱狀圖

圖6 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的GO氣泡圖

7 KEGG富集分析結(jié)果

將木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的核心靶點(diǎn)基因?qū)隦軟件進(jìn)行KEGG富集分析，得到KEGG柱狀圖（見圖7）和KEGG氣泡圖（見圖8）。圖中木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的核心靶點(diǎn)基因的KEGG通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信 號 通 路（IL-17 signaling pathway）、腫 瘤 壞死 因 子 信 號 通 路（TNF signaling pathway）、恰 加 斯?。–hagas disease）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、松弛素信號通路（Relaxin signaling pathway）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、百 日 咳（Pertussis）、類 風(fēng) 濕 性 關(guān) 節(jié) 炎（Rheumatoid arthritis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、膀胱癌（Bladder cancer）、前 列 腺 癌（Prostate cancer）、癌 癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、甲型流感（Influenza A）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、耶爾森菌感染（Yersinia infection）、利什曼?。↙eishmaniasis）等。與GO富集分析類似，柱狀圖和氣泡圖左側(cè)為KEGG名稱；柱狀圖下面的數(shù)字及氣泡圖中氣泡的大小表示富集在KEGG上的基因數(shù)量，數(shù)字及氣泡越大，表示富集基因越多；右側(cè)的p.adjust表示富集程度，其值越小，表示富集程度越高，對應(yīng)柱狀圖和氣泡圖的顏色也就越紅。結(jié)果顯示富集程度最高的靶點(diǎn)通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications），進(jìn)一步繪制出其相關(guān)的作用通路圖（見圖9）。

圖7 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的KEGG柱狀圖

圖8 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的KEGG氣泡圖

圖9 木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的AGE-RAGE信號通路圖

討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定的信號節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計的新學(xué)科。隨著醫(yī)藥研究的不斷深入和疾病譜的變化，中藥在近些年對于疾病的防治上展現(xiàn)出其獨(dú)特的魅力。通過檢索中藥多成分、多靶點(diǎn)，篩選出中藥的有效活性成分，闡明中藥的作用機(jī)制，強(qiáng)調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費(fèi)用，對科研具有重要的指導(dǎo)意義[7]。加味獨(dú)活寄生合劑是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)在獨(dú)活寄生湯原方基礎(chǔ)上加制南星、黃芩、木瓜、淫羊藿而成，大量前期研究[8-11]表明，其對膝骨關(guān)節(jié)炎具有顯而易見的療效。關(guān)于獨(dú)活寄生湯治療腰椎間盤突出癥的文獻(xiàn)研究目前已較完善，也有文獻(xiàn)[12]報道，加味獨(dú)活寄生合劑對腰椎間盤突出癥亦具有明顯療效。而木瓜-淫羊藿補(bǔ)益肝腎、活絡(luò)化濕，對于腰椎間盤突出癥有一定的治療作用。

通過蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖可知，木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的5個核心靶點(diǎn)基因分別是白細(xì)胞介素-6（IL6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）、白細(xì)胞介素-1β（IL1B）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）。研究[13]顯示，LDH患者的血清中IL-6等炎癥因子明顯高于正常人，故LDH的發(fā)病可能與炎癥因子相關(guān)。李洪濤[14]等通過對60例LDH患者的血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IL-6是重要的炎癥因子，可以通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的活性并抑制其合成。而TIMP-1的減少又會引起椎間盤基質(zhì)內(nèi)蛋白相關(guān)生物的改變，從而使纖維環(huán)變薄并且失去彈性，在內(nèi)外因的作用下，髓核突出壓迫硬膜囊和神經(jīng)根，導(dǎo)致LDH的發(fā)生。MMP-9是金屬基質(zhì)蛋白酶的一種，其可降解蛋白多糖聚合體以及纖維連接蛋白，從而加快椎間盤的退變[15]。IL-1β既是炎癥因子，又是致痛物質(zhì)，可促進(jìn)蛋白多糖的降解，增加血管通透性，影響髓核細(xì)胞的正常代謝，加速纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡[16]。退變的椎間盤也會釋放IL-1β等，在炎癥因子的刺激下，加快腰椎間盤突出癥的發(fā)生發(fā)展，從而引發(fā)腰腿痛等一系列癥狀，形成一個惡性循環(huán)[17]。李曉春[18]等將63只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，將取得的大鼠椎間盤做VEGF免疫組化。結(jié)果表明突出的椎間盤組織中有VEGF的表達(dá)，并在腰椎間盤破裂型突出后重吸收中起重要作用。VEGF水平的增加可刺激椎間盤表面的血管新生，將自身的抗原和炎性因子更多的吸收入血，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)[19]。魏明[20]等將54只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溶劑組、AMD3100組、SDF-1中和抗體組、對照Ig G組。通過鞘內(nèi)注射相應(yīng)藥物，測量大鼠脊髓中pAKT的表達(dá)。結(jié)果鞘內(nèi)注射SDF-1中和抗體或CXCR4抑制劑AMD3100升高髓核自體移植大鼠脊髓中pAKT表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。該研究說明了SDF-1/CXCR4通過激活PI3K/AKT通路介導(dǎo)髓核致炎根性疼痛。以上均從炎性致病學(xué)說層面進(jìn)行闡述，充分體現(xiàn)出其與LDH的相關(guān)性。

上述研究表明，木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的信號通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、恰加斯病、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、Toll樣受體信號通路等。相關(guān)研究[21]提示，IL-17是一種前炎性細(xì)胞因子，其可以誘導(dǎo)和活化T細(xì)胞，刺激巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等釋放其他促炎性因子；其次也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，IL-17常與其他炎癥因子相互作用，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。如IL-17能夠增加人成纖維母細(xì)胞黏附分子-1 （ICAM-1） 的表達(dá)，刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、G-CSF[22]，并通過ICAM-1使椎間盤內(nèi)的淋巴等免疫細(xì)胞聚集起來，引起相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[23]。故IL-17以直接或間接的方式，打破原有的椎間盤內(nèi)環(huán)境的代謝平衡，誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞凋亡，加劇椎間盤的退變。TNF-α又稱惡質(zhì)素，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[24]，在椎間盤的退變中起到多重作用。大量研究[25-26]證實(shí)，體內(nèi)TNF-α水平越高，椎間盤退變的程度就越嚴(yán)重，即TNF-α與椎間盤退變成正相關(guān)。再者，TNF-α具有對椎間盤突出組織的重吸收作用。在TNF-α的作用下，基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和基因表達(dá)加快，從而減少膠原和蛋白多糖的合成；同時激活NF-κB和MAPK信號分子通路，促進(jìn)椎間盤組織細(xì)胞基質(zhì)的降解，加劇炎癥反應(yīng)，改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，間接利于椎間盤突出組織的重吸收[27]。已有研究[28]表明，TNF-α抑制劑在一定程度上可減緩椎間盤疾病的進(jìn)程。TLR是一類具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的跨膜受體蛋白，其具有不同的亞型，分別分布于不同的免疫細(xì)胞中，通過識別特異性的信號分子，激活對應(yīng)的信號通路，最終介導(dǎo)炎癥與疼痛反應(yīng)的發(fā)生[29]。木瓜-淫羊藿藥對可能通過這些信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，從而起到治療LDH的作用，有些信號通路的相關(guān)報道尚顯不足，有待進(jìn)一步深入研究。

小 結(jié)

綜上所述，木瓜-淫羊藿藥對可能通過糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、恰加斯病、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、Toll樣受體信號通路等多個途徑作用于白細(xì)胞介素-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、白細(xì)胞介素-1β、血管內(nèi)皮生長因子A、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等靶點(diǎn)參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，從而起到防治LDH的作用。本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡述木瓜-淫羊藿藥對治療LDH的可能作用機(jī)制，對后期的藥效及臨床研究均具有一定的指導(dǎo)意義。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的疾病譜、基因譜及相關(guān)的算法均不夠全面，為取得可靠的突破性成就，仍需后續(xù)廣泛而又深入的研究。