魏稚力，張小波，高蕊，簡(jiǎn)勝男，馬曉菊，文躍強(qiáng)，周昕，沈濤

成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 四川成都 610072

糖尿?。―iabetes Mellitus， DM）作為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。據(jù)2017年相關(guān)報(bào)道，目前全球共有4.25億成人DM患者，而我國(guó)這一數(shù)字高達(dá)1.14億，居世界首位[1]。現(xiàn)降糖藥種類(lèi)繁多，因其各自臨床特點(diǎn)與不良反應(yīng)，尋求更加安全有效的治療藥物一直是該疾病的研究熱點(diǎn)[2]。DM屬中醫(yī)“消渴”范疇，但二者并不能等同[3]。相較于現(xiàn)代DM以血糖升高為主要診斷依據(jù)，消渴則以多飲、多食、多尿、消瘦等“三多一少”癥狀為典型表現(xiàn)[4]。消渴雖不等同于現(xiàn)代DM，但對(duì)于DM的治療亦可從“消渴”相關(guān)中醫(yī)治療獲益。大量研究顯示，中醫(yī)藥治療可發(fā)揮降低患病風(fēng)險(xiǎn)、降低血糖，改善胰島素抵抗、提高胰島素敏感性、改善DM癥狀及其并發(fā)癥損傷等多種治療作用[4-8]。鑒于此，基于中醫(yī)藥資源挖掘治療DM的有效藥物組合具有積極研究意義。

有關(guān)烏梅功效應(yīng)用，《本經(jīng)》[9]云：“下氣，除熱煩滿(mǎn)，安心，肢體痛，偏枯不仁，死肌，去青黑志、惡疾。”《景岳全書(shū)》載其：“止消渴……消癰疽瘡毒”[10]。2015年版《中國(guó)藥典》[11]載其用于：“虛熱消渴”?，F(xiàn)代化學(xué)藥理研究報(bào)道，烏梅中有機(jī)酸成分——蘋(píng)果酸、枸櫞酸可降低正常小鼠血糖水平，烏梅果肉中三萜類(lèi)成分——熊果酸、齊墩果酸具有降血糖作用[12，13]。臨床研究報(bào)道，烏梅丸可降低2型DM患者血糖水平[14]。除臨床藥用外，烏梅作為一種藥食同源性資源，亦被廣泛運(yùn)用于大眾生活當(dāng)中，如用于各類(lèi)烏梅飲品及凉果蜜餞的制作等。鑒于烏梅藥用價(jià)值及開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，本研究對(duì)《中醫(yī)方劑大辭典》中含烏梅方劑進(jìn)行收集整理，并運(yùn)用TCMISS進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析。在此基礎(chǔ)上，選取烏梅-人參核心藥對(duì)，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)一步探討該藥對(duì)治療DM的潛在作用機(jī)制，以期為烏梅的臨床運(yùn)用及后續(xù)研究提供更多參考。

資料與方法

1 方劑來(lái)源

以“烏梅”為檢索關(guān)鍵詞（“烏梅肉”“大烏梅”“烏梅炭”等均作為藥物烏梅納入檢索結(jié)果）對(duì)《中醫(yī)方劑大辭典》[15]中含烏梅方劑進(jìn)行篩取。

2 數(shù)據(jù)規(guī)范

主要涉及中藥因產(chǎn)地、別名、炮制加工、入藥部位等情況進(jìn)行藥名規(guī)范處理，主要參照2015年版《中國(guó)藥典》[11]及《中藥別名大辭典》[16]對(duì)所篩方劑進(jìn)行藥名規(guī)范。

3 中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)分析

3.1 數(shù)據(jù)錄入 通過(guò)TCMISS“平臺(tái)管理”模塊的“方劑管理”功能，將方名、方源、組成、主治疾病等信息錄入系統(tǒng)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并由雙人進(jìn)行數(shù)據(jù)核對(duì)與校正。

3.2 統(tǒng)計(jì)與關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 運(yùn)用TCMISS“數(shù)據(jù)分析”模塊之“方劑分析”、“數(shù)據(jù)查詢(xún)”等功能，輔以Excel數(shù)據(jù)表格，對(duì)查詢(xún)出的目標(biāo)方劑進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)與關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

4.1 有效成分的收集 借助TCMSP檢索烏梅和人參中的化學(xué)成分。一般認(rèn)為藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）性質(zhì)中口服生物利用度（OB）和類(lèi)藥性（DL）具有重要意義，滿(mǎn)足OB≥30%和DL≥0.18的化合物通常被認(rèn)為是潛在的活性成分，故以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行活性成分的篩選。同時(shí)，在TCMSP上下載符合條件成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為MOL2格式。4.2 成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及疾病靶點(diǎn)獲取 將前一步獲得的成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得各成分的作用靶點(diǎn)，并對(duì)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞檢索DM的相關(guān)治療靶點(diǎn)，保留相關(guān)性得分大于20的靶點(diǎn)。之后將獲得的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集。

4.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，蛋白種類(lèi)定義為“人”，置信度>0.7設(shè)為篩選條件進(jìn)行篩選，獲得蛋白互作關(guān)系，下載TSV格式文件。將TSV文件信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1中，并運(yùn)用其插件“Network Analyze”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點(diǎn)度值、介數(shù)均超過(guò)平均值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)。

4.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析 利用R軟件的Bioconductor數(shù)據(jù)包對(duì)PPI中所涉及的核心調(diào)控基因進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析，并畫(huà)出富集分析的氣泡及柱狀圖。

結(jié) 果

1 統(tǒng)計(jì)與關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

本研究共篩取整理出《中醫(yī)方劑大辭典》含烏梅方劑1373首，涉及中藥663味。其中用藥頻次前20位的藥物，見(jiàn)表1，可見(jiàn)除甘草外，烏梅最常與人參聯(lián)用。根據(jù)《中藥學(xué)》[17]藥物分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)常與烏梅聯(lián)用的前100位藥物進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表2，提示烏梅常與補(bǔ)虛藥、清熱藥、解表藥、理氣藥、溫里藥、化痰止咳平喘藥等聯(lián)用。基于關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori算法，分析48首含烏梅治療消渴方劑的用藥規(guī)則，得到支持度≥0.29，置信度為1的含烏梅治療消渴的強(qiáng)關(guān)聯(lián)規(guī)則藥對(duì)組合（核心藥對(duì)），見(jiàn)表3。篩得含烏梅-人參主治消渴的歷代方劑11首，見(jiàn)表4。

表1 含烏梅方劑前20位常用藥物（頻次≥119）

表2 常與烏梅聯(lián)用的前100位藥物的分類(lèi)情況

表3 含烏梅治療消渴的強(qiáng)關(guān)聯(lián)規(guī)則藥對(duì)組合（核心藥對(duì)）

表4 含烏梅-人參主治消渴方劑

2 烏梅-人參藥對(duì)治療DM的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1 烏梅、人參活性成分 基于TCMSP共獲得27個(gè)成分，得到烏梅活性成分8個(gè)，人參活性成分22個(gè)，其中Stigmasterol、beta-sitosterol和kaempferol為二者共有成分，見(jiàn)表5。

表5 烏梅-人參活性成分基本信息

2.2 成分潛在靶點(diǎn) 通過(guò)Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)并提出重復(fù)目標(biāo)后，共得到627個(gè)烏梅、人參的治療靶點(diǎn)。Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到DM相關(guān)靶點(diǎn)301個(gè)。將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集后共得到52個(gè)共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 烏梅-人參疾病-成分靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI分析 在PPI網(wǎng)絡(luò)中，具有較高“度”值的節(jié)點(diǎn)通常認(rèn)為是關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白。如圖2所示，AKT1（21）、TNF（20）、VEGFA（20）、MAPK1（18）、STAT3（18）、TP53（18）、MAPK8（16）、PIK3CA（15）具 有 較 高的度值，在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，其很可能是烏梅-人參藥對(duì)治療DM的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白。

圖2 關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白信息條形圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 GO富集分析描述了一系列復(fù)雜的事件，這些事件是由一個(gè)或多個(gè)層次通過(guò)組織良好的協(xié)同作用來(lái)完成的。如圖3所示，展示了前20條GO途徑，主要集中在激素結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、胰島素受體底物結(jié)合、核受體活性、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、胰島素受體結(jié)合等方面。KEGG前20條途徑主要集中在DM并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、胰島素抵抗、內(nèi)分泌抵抗、VEGF信號(hào)通路、II型糖尿病、TNF信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等通路上，見(jiàn)圖4。

圖3 前20條GO富集途徑

圖4 前20條KEGG通路富集途徑

討 論

中醫(yī)藥防治DM多從“消渴”論之。消渴傳統(tǒng)病機(jī)以“陰虛燥熱”為主論，治以滋陰清熱，并分消論治[18]。但氣與津液關(guān)系密切，津液之生成、輸布、排泄，有賴(lài)于氣的推動(dòng)、固攝及升降出入運(yùn)動(dòng)，而氣亦離不開(kāi)津液之滋潤(rùn)與運(yùn)載[19]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)疏》[20]云：“消渴者，津液不足之候也，氣回則津液生，津液生則渴自止矣。”隨著現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)DM臨床實(shí)踐與認(rèn)識(shí)的不斷深入，對(duì)于DM中醫(yī)核心病機(jī)的概括亦出現(xiàn)了新的認(rèn)識(shí)。沈紹功教授對(duì)538例2型DM患者進(jìn)行辨證調(diào)研，發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證高達(dá)77.51%，明顯高于傳統(tǒng)陰虛燥熱證，之后進(jìn)一步提出轉(zhuǎn)變對(duì)2型DM “陰虛燥熱”病機(jī)的一般認(rèn)識(shí)，并以“氣陰兩虛側(cè)重氣虛”為消渴之病機(jī)關(guān)鍵[21]。張延群等收集2080例DM患者臨床資料，統(tǒng)計(jì)顯示氣虛證頻率達(dá)88.75%，居首位，高于陰虛證的64.09%[22]。謝春光教授提出“氣陰兩虛”為現(xiàn)代DM發(fā)生發(fā)展的核心病機(jī)，并以益氣養(yǎng)陰為治療原則，自擬方“參芪復(fù)方”獲得良好臨床療效[23]?？梢?jiàn)“益氣養(yǎng)陰”對(duì)于現(xiàn)代DM防治的重要指導(dǎo)意義。

本研究以含烏梅方劑數(shù)據(jù)挖掘?yàn)榍腥朦c(diǎn)，從頻次來(lái)看，盡管甘草亦屬補(bǔ)氣藥且頻次高于人參，但其在許多方劑中常作調(diào)和藥性之用，且在配伍中常與人參同用或輔助人參發(fā)揮補(bǔ)益類(lèi)作用，如炙甘草湯（《傷寒論》）、四君子湯（《局方》）等[24]。此外，在基于關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得到的核心藥對(duì)中，除人參、甘草外，麥冬、葛根、天花粉并不屬補(bǔ)氣藥。故本研究?jī)?yōu)先選取烏梅-人參這一核心藥對(duì)，并進(jìn)一步探討其治療DM的潛在作用機(jī)制。

烏梅酸斂，生津除煩；人參甘補(bǔ)，益氣生津。二藥相伍，相輔相成，益氣同時(shí)養(yǎng)陰生津之功益彰，具“酸甘化陰”之義。酸甘化陰法用治消渴由來(lái)已久，首見(jiàn)于仲景所制之腎氣丸，方中山茱萸與干地黃、山藥伍用，酸甘化陰，亦寓陰中求陽(yáng)之意。此外，諸如口含酸棗丸（《備急千金要方》）、六味地黃丸（《小兒藥證直訣》）、烏梅四物湯（《醫(yī)門(mén)八法》）、生脈散（《醫(yī)學(xué)啟源》）、玉泉丸（《雜病源流犀燭》）等典型酸甘化陰法配伍的方劑亦被廣泛用于消渴的臨床治療[25，26]。研究報(bào)道，烏梅作君藥的酸甘化陰法方劑可改善氣陰兩虛型2型DM患者中醫(yī)證候，并降低空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)[27]。烏梅-人參藥對(duì)切合消渴“氣陰兩虛”病機(jī)，亦是中醫(yī)酸甘化陰法之典型運(yùn)用，其對(duì)于現(xiàn)代DM的相關(guān)研究值得進(jìn)一步深入。

本研究進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)烏梅-人參藥對(duì)進(jìn)行DM相關(guān)作用機(jī)制探討。TCMSP搜集得到二藥共有27個(gè)成分，可作用于52個(gè)DM相關(guān)靶點(diǎn)。PPI網(wǎng) 絡(luò) 分 析 表 明AKT1、TNF、VEGFA、MAPK1、STAT3、TP53、MAPK8和PIK3CA可能是烏梅-人參治療DM的主要靶點(diǎn)。TNF是一組可以引起細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子，該家族包括兩個(gè)成員，TNF-α和TNF-β。其中TNF-α參與了全身炎癥反應(yīng)，同時(shí)它可以通過(guò)減弱胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少脂肪細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，以及抑制脂聯(lián)素等方式在胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[28]。STAT3是STAT家族中的成員，其除了參與癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，還在調(diào)節(jié)糖類(lèi)及脂質(zhì)代謝， 維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面扮演著重要角色。研究表明，STAT3可通過(guò)抑制肝臟糖異生的關(guān)鍵基因Pck1和G6pc來(lái)改善胰島素抵抗癥狀[29]。P53蛋白由17號(hào)染色體上的P53基因編碼，P53蛋白在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、抑制惡性增殖中起著重要作用，并與胰島素抵抗關(guān)系密切，是治療DM的新靶點(diǎn)[30]。

KEGG分析顯示，52個(gè)與DM相關(guān)的靶點(diǎn)主要富集在胰島素及胰島素并發(fā)癥相關(guān)通路上。胰島素抵抗是引起DM的重要原因。通常，肥胖誘發(fā)的慢性炎癥會(huì)引起IL-6、TNF-α等炎性因子的增加，而TNF-α?xí)T導(dǎo)JNK的激活，激活的JNK可以使胰島素信號(hào)通路中IRS蛋白上的Ser位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致其相應(yīng)Tyr位點(diǎn)的磷酸化降低，從而使下游的PI3K、AKTV蛋白不能被活化，從而產(chǎn)生胰島素抵抗[31]。IL-6可以激活STAT3，誘導(dǎo)SOCS蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，使胰島素PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，最終引起胰島素抵抗[32]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明烏梅-人參藥對(duì)可以與關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、STAT3和PIK3CA產(chǎn)生作用，因而其可能通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素抵抗通路中的TNF-α/JNK/PI3K或IL-6/STAT3/PI3K途徑來(lái)治療DM，如圖5所示。

圖5 胰島素抵抗信號(hào)通路圖

綜上，本研究通過(guò)整理《中醫(yī)方劑大辭典》中含烏梅方劑，運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并以DM “氣陰兩虛”病機(jī)為切入點(diǎn)，選取烏梅-人參核心藥對(duì)進(jìn)行DM相關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制探討，可為烏梅的臨床用藥及后續(xù)開(kāi)發(fā)研究提供有益線索?；谥嗅t(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可為進(jìn)一步研究提供方向，但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而更加系統(tǒng)、科學(xué)地闡述烏梅-人參防治DM的機(jī)制。