朱小玲，李文靜，王憲娥，宋文莉，徐 莉，張 立，馮向輝，路瑞芳，釋 棟，孟煥新△

(1.北京大學人民醫(yī)院口腔科， 北京 100044； 2.北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院牙周科，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室，口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081)

侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis， AgP)是一類臨床和實驗室檢查結果均與慢性牙周炎明顯不同的疾病，以快速的附著喪失和牙槽骨破壞為特征，具有家族聚集性[1]。大量研究表明， AgP是由多個基因相互關聯(lián)或疊加，并與微生物、環(huán)境因素等協(xié)同作用所致。廣泛型侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis，GAgP)是AgP的一個分型，通常發(fā)生于30歲以下的患者，主要的臨床特點是廣泛的鄰面附著喪失累及至少3顆除切牙和第一磨牙以外的恒牙，有嚴重而快速的附著喪失和牙槽骨破壞等。

膽固醇酯轉運蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)基因介導血漿脂蛋白之間脂質的交換和轉運，尤其是促進高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)向低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)膽固醇轉運，在膽固醇逆向轉運中發(fā)揮重要作用[8-9]。CETP基因變異與脂蛋白代謝異常及動脈粥樣硬化的研究已成為熱點[10-11]，rs12720922(A/G)是一個新發(fā)現(xiàn)的CETP基因多態(tài)性位點，A等位基因攜帶者血清CETP升高[12]。

鑒于牙周炎與冠心病及代謝綜合征存在共同的發(fā)病機制，本研究根據(jù)以往文獻報道及GenBank數(shù)據(jù)庫信息篩選出可能與AgP易感性有關聯(lián)的兩個基因多態(tài)性位點——CYBArs4673和CETPrs12720922，探討其與GAgP易感性的關系及兩者在GAgP 易感性方面是否存在交互作用，為篩選GAgP高危人群提供遺傳學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為病例對照研究，研究開始前已獲得北京大學生物醫(yī)學倫理委員會審查批準(批準號：0313)。所有受試者均簽署知情同意書，并完成問卷調查，內容包括口腔衛(wèi)生習慣、吸煙及全身健康狀況等。

選擇2001年 1月至 2015年 12 月期間于北京大學口腔醫(yī)院牙周科門診就診的中國漢族GAgP 患者372例，選擇同期133名全身及牙周均健康的本院漢族職工及在讀學生作為對照組。GAgP診斷參照 1999 年牙周病分類國際研討會制定的診斷標準，依據(jù)2018年牙周病和植體周病國際新分類，本研究納入的GAgP均為牙周炎Ⅲ期C級(快速進展)。

GAgP組納入標準：(1)年齡≤35歲；(2)快速的附著喪失和牙槽骨破壞，全口至少6顆牙(其中至少3顆為非第一磨牙和切牙)探診深度(probing depth，PD)≥5 mm，鄰面附著喪失(attachment loss，AL)≥3 mm；(3)經(jīng)全口根尖X線片證實有鄰面牙槽骨吸收。對照組納入標準：(1)年齡≤35 歲；(2)PD≤3 mm，無附著喪失；(3)出血指數(shù)(bleeding index，BI)≥2 的位點數(shù)<10%，無BI為4的位點。

GAgP組及對照組排除標準：(1)吸煙；(2)患有糖尿病、心血管疾病或血液系統(tǒng)疾病等；(3)妊娠期或哺乳期女性。

1.2 臨床檢查

使用Williams牙周探針，測量每位受試者每顆牙6個位點的PD和AL(頰側和腭側的近中、中央、遠中位點)；探診30 s后記錄出血最嚴重部位的BI。此外，GAgP患者拍攝全口根尖X線片。

1.3 基因型鑒定

每位受試者抽取外周靜脈血至含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空管中，分離白細胞，提取全基因組 DNA(上海華舜生物技術有限公司)。CYBArs4673與CETPrs12720922基因型鑒定由上海邃志生物科技股份有限公司采用基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術完成(美國Sequenom 公司 MassARRAY 系統(tǒng))。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 研究人群描述

2.1.1一般特征 372例 GAgP 患者平均年齡(27.5±5.2)歲，其中男性 152例，女性 220例，男女比1 ∶1.45；133名健康對照者平均年齡(28.8±7.1)歲，其中男性 53 例，女性 80例，男女比1 ∶1.51。兩組人群年齡差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)， 性別構成比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GAgP組的牙周臨床指標(PD、BI、AL)與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。CYBArs4673與CETPrs12720922基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.1.2CYBArs4673基因型 共有366例GAgP患者及132名健康對照者檢測出CYBArs4673基因型，檢出率為98.6%(498/505)。將CYBArs4673的CT與TT基因型合并后，GAgP組CT/TT基因型頻率顯著高于對照組(18.03%vs.10.61%，P<0.05，表1)。

2.1.3CETPrs12720922 基因型 共有368例GAgP患者及132名健康對照者檢測出CETPrs12720922基因型，檢出率為99.0%(500/505)。CETPrs12720922基因型分布在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組一般情況及基因型分布比較Table 1 Comparison of demographic, clinical characteristics and genotype distributions in patients and controls

2.2 GAgP患病風險多元回歸模型分析

調整性別、年齡后，CYBArs4673不同基因型的GAgP患病風險差異存在統(tǒng)計學意義，與 CC基因型相比，CT/TT基因型患病風險明顯增加(OR=1.86，95%CI：1.01～3.45，P=0.048)。CETPrs12720922不同基因型的GAgP患病風險差異無統(tǒng)計學意義，與GG基因型相比，AA/AG基因型患病風險無明顯改變(OR=0.70，95%CI：0.43～1.12，P=0.138)。

2.3 CYBA rs4673與CETP rs12720922的交互作用分析

調整年齡、性別后，與CYBArs4673 CC基因型及CETPrs12720922 AA/AG基因型相比，CYBArs4673 CT/TT基因型及CETPrs12720922 GG基因型的GAgP患病風險增加了2.25倍(OR=3.25，95%CI：1.36～7.75，P<0.01)，而CYBArs4673 CT/TT基因型單獨存在時OR值為1.86，表明CYBArs4673 CT/TT基因型與CETPrs12720922 GG基因型在GAgP患病風險方面的交互作用為協(xié)同作用(表2)。

表2 CYBA rs4673、CETP rs12720922基因與GAgP易感性的交互作用分析Table 2 Interaction analysis between CYBA rs4673 and CETP rs12720922 gene polymorphisms and susceptibility to generalized aggressive periodontitis

3 討論

本研究根據(jù)既往文獻報道及GenBank數(shù)據(jù)庫信息，選擇CYBArs4673和CETPrs12720922兩個單核苷酸位點，分析它們與GAgP易感性的關系以及基因間的交互作用，發(fā)現(xiàn)CYBArs4673基因多態(tài)性與GAgP患病風險相關，與CC基因型相比，CT/TT基因型患病風險明顯增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)CYBArs4673和CETPrs12720922在GAgP易感性方面存在顯著的交互作用，當CYBArs4673為CT/TT基因型，CETPrs12720922為GG基因型時，與CYBArs4673 CC基因型、CETPrs12720922 AA/AG基因型相比，GAgP患病風險明顯增加，CYBArs4673 CT/TT基因型與CETPrs12720922 GG基因型在GAgP患病風險方面的交互作用為協(xié)同作用。

CYBA基因編碼NADPH的p22phox跨膜亞基，其rs4673(C242T)的多態(tài)性導致p22phox亞基第72位組氨酸被絡氨酸代替，從而影響NADPH氧化酶的活性及超氧化物產(chǎn)生。有關rs4673 C/T多態(tài)性對NADPH氧化酶功能的影響研究較少，而且結論并不一致[13-14]。超氧化物是殺滅細菌的關鍵物質，同時也會導致組織損害。過度的氧化爆發(fā)與一些疾病的病理發(fā)生有關，體外研究表明，其對牙周韌帶細胞和牙齦上皮細胞都有損害[15-16]。Nibali等[6]通過病例對照研究的方法分析了CYBArs4673(C242T)多態(tài)性與AgP(特別是GAgP)易感性的關系，發(fā)現(xiàn)T等位基因頻率在AgP組增高(CT基因型頻率在高加索人群中增高，而TT基因型頻率在黑人人群中增高)，表明CYBArs4673(C242T)多態(tài)性與AgP(特別是GAgP)的易感性相關。本研究也發(fā)現(xiàn)CT/TT基因型頻率在GAgP組增高，與Nibali等[6]的研究結果一致。

早期的觀點認為AgP發(fā)病與中性粒細胞功能缺陷(趨化、吞噬、殺菌等)有關，后來的研究結果提示，AgP嚴重的牙周組織破壞是由于中性粒細胞活性過度增強，釋放過量的毒性產(chǎn)物引起的。Leino等[17]和Gronert等[18]報道AgP患者，特別是局限型侵襲性牙周炎(localized aggressive periodontitis，LAgP)患者的中性多形核白細胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)超氧化物產(chǎn)生增高。Shimo-Naka-nishi等[13]發(fā)現(xiàn)攜帶CYBArs4673T等位基因個體的中性粒細胞過氧化物產(chǎn)生活性明顯增高，而Wyche等[14]發(fā)現(xiàn)CYBArs4673 TT基因型個體與CC/CT基因型個體相比，吞噬細胞的呼吸爆發(fā)活性明顯降低。Nibali等[6-7]認為T等位基因突變可能是導致AgP患者中性粒細胞功能改變的機制之一。CYBArs4673基因多態(tài)性對AgP患者中性粒細胞NADPH氧化酶活性的影響還有待進一步研究。

CETP基因變異與動脈粥樣硬化及脂蛋白代謝異常有關。Blauw等[12, 19]通過全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)確定CETPrs12720922(A/G)是一個獨立的且顯著影響血清CETP水平的多態(tài)性位點，A等位基因攜帶者血清CETP升高，且血清CETP升高與血清HDL膽固醇降低及LDL和VLDL膽固醇增高有關，從而與冠狀動脈疾病的危險性相關。Bordoni等[20]研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病患者與健康對照者的CETPrs12720922基因型頻率無顯著差異，A/G多態(tài)性與HDL水平明顯相關，但與心血管疾病的危險性可能并無直接的相關關系。有關CETPrs12720922(A/G)多態(tài)性與牙周炎易感性的關系尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，CETPrs12720922基因型的分布在GAgP組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學意義，通過基因間交互作用分析發(fā)現(xiàn)，CETPrs12720922 GG基因型與CYBArs4673 CT/TT基因型在GAgP患病風險方面具有協(xié)同作用。大量研究表明，血脂異常與牙周炎有密切關系，而且是雙向的關系[21-23]，血脂異常增加了患牙周疾病的風險，而牙周感染也影響了血脂的控制。牙周炎作為一個慢性感染性疾病，產(chǎn)生大量的促炎癥因子，引起血脂水平改變，導致高血脂的發(fā)生。血脂升高超過正常的生理范圍，就會引起免疫細胞功能改變；脂類可以改變巨噬細胞多肽生長因子的基因表達，使得腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β產(chǎn)生增多，從而增加了牙周炎的易感性[24]。另外，高血脂癥患者PMN受到趨化肽N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)刺激時，氧自由基和血小板活化因子產(chǎn)生明顯增高，PMN的過度活化可能與牙周炎的易感性相關[25]。CETPrs12720922(A/G)多態(tài)性可能通過影響血清CETP水平改變血脂水平，從而與CYBArs4673 CT/TT基因型在GAgP患病風險方面產(chǎn)生交互作用。這兩個位點的單核苷酸多態(tài)性在GAgP易感性方面存在交互作用的機制還有待進一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)CYBArs4673 CT/TT基因型頻率在GAgP組增高，與GAgP易感性相關，而且與CETPrs12720922 GG基因型存在顯著的交互作用。相對于單個基因的研究，本研究結果解釋了GAgP發(fā)病機制中遺傳因素的重要性，對預測人群的患病風險有一定意義。但同時本研究也存在一定的局限性，一是樣本量不夠大，這與GAgP發(fā)病率較低有一定關系，在后續(xù)工作中需進一步擴大樣本量進行驗證；二是本研究只是通過病例對照研究分析基因多態(tài)性與GAgP易感性的關系，尚未涉及基因多態(tài)性影響GAgP發(fā)生的具體機制，如CYBArs4673基因多態(tài)性對AgP患者中性粒細胞NADPH氧化酶活性的影響等。今后將從基因功能水平進一步探討CYBArs4673參與GAgP發(fā)病的機制以及與CETPrs12720922產(chǎn)生交互作用的機制。