劉楠楠，李杰鑾，常志光

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 吉林 132108）

長白山脈是歐亞大陸東緣的最高山系，擁有東北亞溫帶地區(qū)譜系最多的山地垂直帶系統(tǒng)，是我國東北地區(qū)最重要的生態(tài)屏障[1]，動(dòng)植物資源獨(dú)特而豐富。長白山中華蜜蜂（Apis cerana cerana，以下簡稱長白山中蜂）是其分布區(qū)內(nèi)的自然蜂種，它是在長白山生態(tài)條件下，經(jīng)過長期自然選擇而形成的中華蜜蜂的一個(gè)類型[2]，廣義的長白山中蜂尚包括分布于朝鮮半島乃至俄羅斯遠(yuǎn)東海冰邊疆地區(qū)的東方蜜蜂生態(tài)型[3]。種群在長白山脈長期棲息，形成了明顯的長白山區(qū)適應(yīng)特征，特別是耐寒性較強(qiáng)，在﹣40℃的酷寒條件下，依然能夠自然越冬。在棲息地的喪失和碎片化以及西方蜜蜂長期干擾東方蜜蜂生殖行為等威脅因素的持續(xù)作用下，長白山中蜂數(shù)量明顯減少[4-6]，目前的種群數(shù)量已不足1萬群，處于瀕危-維持狀態(tài)[2]，遺傳資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)和利用工作迫在眉睫。

昆蟲的抗寒生理機(jī)制極為復(fù)雜，是昆蟲長期進(jìn)化過程中形成的一系列的低溫適應(yīng)對(duì)策。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）合稱昆蟲的保護(hù)酶系統(tǒng)[7]，能相互協(xié)作調(diào)控清除機(jī)體內(nèi)活性氧，使自由基濃度維持在正常水平，構(gòu)成有機(jī)體相互保護(hù)的防御系統(tǒng)，可作為昆蟲生理狀態(tài)改變的度量指標(biāo)[8,9]。有研究表明抗氧化能力降低是蜜蜂壽命縮短和行為衰老的主要原因[10]，當(dāng)蜜蜂個(gè)體處于低溫逆境條件時(shí)，昆蟲保護(hù)酶系統(tǒng)會(huì)對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激做出一系列的防御反應(yīng)，誘發(fā)機(jī)體的生理代謝活動(dòng)發(fā)生改變[11]；另一方面，根據(jù)越冬昆蟲體內(nèi)是否存在冰晶，其越冬對(duì)策可分為避凍和耐凍兩種策略[12]，它們共同的越冬機(jī)制是小分子量糖醇物質(zhì)的積累，目前已知的抗寒性物質(zhì)有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇、海藻糖、葡萄糖、果糖以及氨基酸和脂肪酸類等[13]，某些昆蟲還可以同時(shí)運(yùn)用兩種策略，必要時(shí)在這兩種策略間進(jìn)行轉(zhuǎn)換[14]。大多數(shù)越冬昆蟲中會(huì)由幾種抗寒物質(zhì)共同構(gòu)成一個(gè)抗凍保護(hù)物質(zhì)系統(tǒng)[15,16]，蜜蜂的越冬能力很大程度上取決于其抗寒性[17]，通過減少體內(nèi)自由水含量、積累抗寒物質(zhì)等生理狀態(tài)的改變來增強(qiáng)其耐寒能力[18]，有研究認(rèn)為其體內(nèi)可能存在“葡萄糖 甘油 氨基酸”的抗寒物質(zhì)系統(tǒng)[19]。

本試驗(yàn)選取越冬時(shí)期最冷時(shí)段（當(dāng)年12月至翌年2月）長白山中蜂和意大利蜜蜂種群的SOD、CAT和POD活性及總氨基酸（T-AA）、糖原（Glycogen）、葡萄糖（Glucose）和甘油（Glycerol）的含量進(jìn)行測定，以非耐寒蜂種的意大利蜜蜂為對(duì)照，從保護(hù)酶系活性以及耐寒生理指標(biāo)兩個(gè)方面明確長白山中蜂越冬耐寒的生理機(jī)制，以期為后續(xù)抗寒新品系的選育、蜂群安全越冬策略以及抗寒性狀的評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)蜂群

試驗(yàn)于2019年12月至2020年2月，在吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所試驗(yàn)蜂場進(jìn)行（吉林省吉林市）。所用中華蜜蜂蜂群為純種長白山中蜂，由吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所國家級(jí)中蜂（長白山中蜂）保護(hù)區(qū)提供；所用意大利蜜蜂蜂群為松丹2號(hào)，由吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所蜜蜂遺傳資源基因保護(hù)中心提供。選取活框飼養(yǎng)的健康無病、無自然分蜂的長白山中蜂和意大利蜜蜂各3群作為試驗(yàn)蜂群，在越冬前補(bǔ)喂越冬飼料，各蜂種保持群勢相當(dāng)，于自然條件下室外越冬。

1.2 樣品采集

在蜂群越冬前標(biāo)記兩個(gè)蜂種新出房的工蜂，選取蜜蜂越冬期的最冷時(shí)段，即當(dāng)年的12月至翌年的2月，吉林地區(qū)戶外的最高和最低溫度均為零攝氏度以下。每間隔15 d（當(dāng)月的10日和25日）進(jìn)行一次樣品采集，置于﹣80℃超低溫冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3 主要試劑和儀器

超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒，以及總氨基酸、糖原（Glycogen）、葡萄糖和甘油含量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

Ultrospec 7000紫外可見分光光度計(jì)（英國柏楉有限公司）；Thermo Scientific Sorvall Stratos低溫高速離心機(jī)。

2 方法

2.1 保護(hù)酶系的酶活性測定

嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，根據(jù)公式計(jì)算得出越冬時(shí)期每個(gè)時(shí)段樣品體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活力值。測定時(shí)每組樣品做3個(gè)平行處理，所有待測樣本為同一批次。

2.2 耐寒生理指標(biāo)的測定

嚴(yán)格按照總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量的試劑盒說明書操作，根據(jù)公式計(jì)算得出越冬時(shí)期每個(gè)時(shí)段樣品體內(nèi)的總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油的含量值。測定時(shí)每組樣品做3個(gè)平行處理，所有待測樣本為同一批次。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，采用數(shù)據(jù)分析中的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05表示差異顯著），隨后采用Tukey's HSD進(jìn)行多重檢驗(yàn)；應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖表制作。

3 結(jié)果與分析

3.1 越冬期體內(nèi)保護(hù)酶系活性變化分析

3.1.1 超氧化物歧化酶活性 在越冬期的每個(gè)最冷時(shí)間段，長白山中蜂的SOD活性對(duì)比意大利蜜蜂均明顯較高，且兩個(gè)蜂種的各時(shí)間點(diǎn)酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖1。

圖1 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的SOD活性變化Fig.1 The change of SOD activity ofduring the overwintering period

3.1.2 過氧化氫酶活性 在越冬期的最冷時(shí)間段，兩個(gè)蜂種的CAT活性變化趨勢基本一致，長白山中蜂在每個(gè)時(shí)段的CAT活性均明顯高于意大利蜂，且兩個(gè)蜂種的各時(shí)間點(diǎn)酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖2。

圖2 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的CAT活性變化Fig.2 The change of CAT activity ofandduring the overwintering period

3.1.3 POD活性 在越冬期的最冷時(shí)間段，除2020年1月10日和2020年2月10日的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，長白山中蜂的POD活性均高于意大利蜜蜂，且兩個(gè)蜂種的各時(shí)間點(diǎn)酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖3。

圖3 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的POD活性變化Fig.3 The change of POD activityduring the overwintering period

3.2 越冬期體內(nèi)生理指標(biāo)變化分析

3.2.1 總氨基酸含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個(gè)最冷時(shí)段體內(nèi)的總氨基酸含量差異顯著，且兩蜂種間存在差異（P＜0.05）。通過比較兩蜂種在同一時(shí)間點(diǎn)的總氨基酸含量可發(fā)現(xiàn)，長白山中蜂體內(nèi)的總氨基酸含量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖4。

圖4 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的T-AA含量變化Fig.4 The change of total amino acid content of during the overwintering period

3.2.2 糖原含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個(gè)最冷時(shí)段體內(nèi)的糖原含量差異顯著，且兩蜂種間存在差異（P＜0.05）。通過比較兩蜂種在同一時(shí)間點(diǎn)的糖原含量可發(fā)現(xiàn)，長白山中蜂體內(nèi)糖原的含量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖5。

圖5 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的糖原含量變化Fig.5 The change of the glycogen content ofduring the overwintering period

3.2.3 葡萄糖含量 長白山中蜂在越冬期的各個(gè)最冷時(shí)段體內(nèi)的葡萄糖含量存在顯著的起伏變化（P＜0.05），意大利蜜蜂則總體呈下降趨勢，且不同蜂種間存在一定差異。通過比較兩蜂種在同一時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖含量可發(fā)現(xiàn)，除12月份的兩個(gè)時(shí)間段，其他時(shí)間點(diǎn)的長白山中蜂體內(nèi)葡萄糖含量顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖6。

圖6 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的葡萄糖含量變化Fig.6 The change of glucose content ofandduring the overwintering period

3.2.4 甘油含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個(gè)最冷時(shí)段體內(nèi)的甘油含量存在顯著的變化（P＜0.05），且不同蜂種間存在一定差異。通過比較兩蜂種在同一時(shí)間點(diǎn)的甘油含量可發(fā)現(xiàn)，除2020年1月10日和2020年2月25日兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其他時(shí)段的長白山中蜂體內(nèi)甘油含量顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖7。

圖7 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的甘油含量變化Fig.7 The change of the glycerol content ofduring the overwintering period

4 討論

長白山陸地生態(tài)系統(tǒng)呈多重景觀格局，季節(jié)性寒冷是長白山區(qū)重要的限制性生態(tài)因子之一。長白山中蜂是長白山生態(tài)系統(tǒng)中寶貴的種質(zhì)遺傳資源[20]，是長期適應(yīng)冬季寒冷，無霜期短等嚴(yán)酷生態(tài)環(huán)境具有強(qiáng)大適應(yīng)性的特殊種群、了解它在越冬期的抗寒適應(yīng)性生理機(jī)制對(duì)于種群的保護(hù)利用十分必要。

昆蟲耐寒性體現(xiàn)出對(duì)環(huán)境適應(yīng)的能力，與生態(tài)環(huán)境的季節(jié)性變化、遺傳因素、營養(yǎng)狀況和暴露低溫的時(shí)間長短等因素相關(guān)，是種群能否成功越冬與翌年繁殖的重要前提[21]，機(jī)體內(nèi)保護(hù)酶系的活性變化可作為昆蟲抗逆能力的重要指標(biāo)[22]。根據(jù)吉林地區(qū)2019年12月至2020年2月冬季氣候資料（中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)：http://data.cma.cn），最高氣溫和最低氣溫均在0℃以下，為越冬蜂群經(jīng)歷的最冷氣候階段，自然條件下室外越冬種群的耐寒性試驗(yàn)結(jié)果更能代表兩個(gè)蜂種真實(shí)的耐寒性水平。本研究結(jié)果表明，在越冬期最寒冷的3個(gè)月時(shí)間段內(nèi)長白山中蜂體內(nèi)的SOD和CAT的活性顯著高于意大利蜜蜂，總體的POD活性表現(xiàn)也高于意大利蜜蜂，且整體的酶活力值并無明顯下降，說明越冬期長白山中蜂的保護(hù)酶系統(tǒng)可能存在一定的抗氧化應(yīng)激防御機(jī)制，在冬季低溫的不利環(huán)境下協(xié)同發(fā)揮增效作用，幫助蜜蜂個(gè)體在越冬期間增強(qiáng)耐寒性，且整體表現(xiàn)優(yōu)于意大利蜜蜂。與夏振宇等[23]發(fā)現(xiàn)中國北方越冬期的中華蜜蜂體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)防御能力趨強(qiáng)，對(duì)低溫脅迫存在耐寒響應(yīng)生理機(jī)制的研究結(jié)果一致。

越冬昆蟲要經(jīng)歷漫長的越冬期，不僅需要消耗一定的能量物質(zhì)來維持正常代謝，同時(shí)需要自身一系列生理生化反應(yīng)以應(yīng)對(duì)低溫不利環(huán)境，糖原和脂肪是越冬前重要的能量儲(chǔ)備物質(zhì)[24]，在越冬階段或低溫脅迫刺激下還會(huì)在體內(nèi)大量積累低分子糖、醇類物質(zhì)作為抗凍保護(hù)物質(zhì)以增強(qiáng)昆蟲耐寒性[25-27]，這些化合物具有避免昆蟲結(jié)冰、融化和提高長時(shí)間冷暴露條件下的存活率的作用，能夠客觀反映昆蟲的耐寒性生理響應(yīng)機(jī)制，它們可作為越冬昆蟲的耐寒性指標(biāo)[28]。本研究的結(jié)果表明，長白山中蜂在越冬期最冷時(shí)段體內(nèi)的總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量有明顯的波動(dòng)變化，說明面對(duì)外界低溫存在一定的生理應(yīng)答機(jī)制，蜜蜂個(gè)體抵御冬季低溫不僅是單一物質(zhì)積累而是多元抗凍保護(hù)物質(zhì)互相協(xié)調(diào)共同作用的復(fù)雜過程，其中總氨基酸、葡萄糖和甘油的含量總體上要顯著高于意大利蜜蜂，它們可能是長白山中蜂越冬期關(guān)鍵的抗凍保護(hù)物質(zhì)。Xu等[19]對(duì)20日齡的中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂進(jìn)行0℃、10℃和25℃持續(xù)4 h的溫度處理發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下中華蜜蜂通過轉(zhuǎn)化氨基酸為能量來抵御寒冷，有17種氨基酸參與機(jī)體的抗寒機(jī)制，而意大利蜜蜂只有15種。糖類物質(zhì)和甘油是昆蟲的主要抗寒保護(hù)劑，誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐寒性小分子化合物，與結(jié)合水結(jié)合增加體液濃度從而降低過冷卻點(diǎn)，也可以與酶等物質(zhì)相互作用來保護(hù)昆蟲[29]，且它們存在相互轉(zhuǎn)換的關(guān)系，二化螟越冬幼蟲體內(nèi)的葡萄糖和糖原在越冬期間會(huì)向甘油進(jìn)行轉(zhuǎn)化[30]。

長白山中蜂在長期適應(yīng)性進(jìn)化過程中通過越冬耐寒鍛煉提高了對(duì)低溫和亞低溫的耐受性，獲得了抵御冬季寒冷溫度的多種耐逆性機(jī)制，包括越冬期間抗凍保護(hù)物質(zhì)在其體內(nèi)的生物合成、積累、代謝以及保護(hù)酶系的防御調(diào)控，以增強(qiáng)種群的耐寒性。本試驗(yàn)結(jié)果加強(qiáng)了對(duì)長白山中蜂種群耐寒性狀的綜合理解，為明確種群的抗寒能力和耐寒策略提供科學(xué)依據(jù)，其中抗氧化酶、氨基酸、葡萄糖和甘油之間在調(diào)節(jié)機(jī)體耐寒功能的分子研究需要更進(jìn)一步地展開。