林禹澎，黃鳳輝，徐雅娟，解生旭，姜英子※

（1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.葵花藥業(yè)集團（吉林）臨江有限公司，吉林 臨江 134600；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春 130012）

隨著世界人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）、高血脂癥等一系列難以治愈的疾病不斷困擾著老人們，有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，OP的發(fā)病率正呈逐年上升趨勢[1,2]，其嚴(yán)重影響了老人們的生活質(zhì)量和幸福指數(shù)[3,4]。OP是一種多發(fā)因素為病因的增齡性機體衰老性骨代謝疾病[5]，目前治療OP的手段以西藥為主，雖然可以在短期內(nèi)達到緩解OP的作用，但是其長期治療OP的效果以及治療期間的不良反應(yīng)仍具有不確定性。

從古到今，我國許多中醫(yī)名家將骨質(zhì)疏松稱為“骨痹”“骨瘺”，防治骨質(zhì)疏松的中藥材有骨碎補、補骨脂和淫羊藿等，防治骨質(zhì)疏松的經(jīng)典名方有左歸丸、右歸丸和六味地黃丸等，這些中藥材和經(jīng)典名方在辨證論治的基礎(chǔ)上應(yīng)用到臨床中均取得了良好的療效[6]。懷膝顆粒中骨碎補、山茱萸、懷牛膝、川芎和鹿茸作為骨傷科常用中藥，有補腎強骨的功效，常用于治療腎虛腰痛和風(fēng)濕痹痛等，其在治療骨質(zhì)疏松癥方面的運用已經(jīng)得到廣泛認可，為臨床治療骨質(zhì)疏松方劑中的常用藥物[7-11]。

本研究基于懷膝顆粒中成分的復(fù)雜性和多樣性，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討懷膝顆粒治療OP的化合物和靶點及其分子作用機制，為進一步研究懷膝顆粒治療OP作用機制的實驗及臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 懷膝顆粒所含化合物的收集與篩選

通過TCMSP（http://www.tcmspw.com/tcmsp.php）收集懷膝顆粒中骨碎補、山茱萸、牛膝和川芎4味藥的成分，并以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness,DL）≥0.18為限定條件對所收集到的化合物進行篩選。其中鹿茸未在此數(shù)據(jù)庫中收錄，故在中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http://www.organchem.csdb.cn）中查找相關(guān)化合物，并按上述條件篩選。

1.2 懷膝顆粒所含化合物作用靶點的預(yù)測及可視化

通過TCMSP對1.1中所篩選的化合物進行靶點預(yù)測，其中鹿茸是基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫中化合物的CAS（Chemical Abstracts Service）號通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得其分子結(jié)構(gòu)的，再通過Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測化合物作用靶點。通過uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）查詢所得靶點相對應(yīng)的人類基因名稱，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化。

1.3 OP發(fā)病靶點檢索及懷膝顆粒作用OP相關(guān)靶點的預(yù)測

將1.2所得靶點相對應(yīng)的人類基因名稱與通過檢索TTD（Therapeutic Target Database）數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd）、Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecar ds.org）和OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）所篩選出的骨質(zhì)疏松癥靶點進行比對，并利用Venny2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制懷膝顆粒相關(guān)活性成分靶點和骨質(zhì)疏松癥靶點的韋恩圖，獲得其交集，即為懷膝顆粒治療OP的作用靶點。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述得到的交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/Version 11.0），選擇研究物種為人類，得到蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。下載PPI（Protein Protein Interaction,PPI）蛋白網(wǎng)絡(luò)描述文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，用其軟件自帶network analysis功能進行分析得到網(wǎng)絡(luò)節(jié)點間的拓撲學(xué)關(guān)系，從而獲得靶點蛋白的相互作用關(guān)系圖。

1.5 GO功能富集分析

通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http://www.bioconductor.org）查詢交集靶點的基因ID，使用R語言通過GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫對靶點的分子功能（Molecular Function,MF）、細胞組分（Cellular Component,CC）以及生物過程（Biological Process,BP）3方面進行分析并對每項排名前10的數(shù)據(jù)進行氣泡圖的繪制。

1.6 KEGG通路富集分析

通過R語言對交集靶點的ID進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，對排名前10的數(shù)據(jù)進行氣泡圖的繪制，并通過Cytoscape 3.8.2軟件對KEGG富集分析中獲得的關(guān)鍵靶點和通路聯(lián)合有關(guān)化合物進行“活性成分 靶點 信號通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 化合物的篩選

經(jīng)過OB≥30%和DL≥0.18條件的篩選后，收集主要化學(xué)成分，得出骨碎補15個，山茱萸14個，牛膝17個，川芎6個，鹿茸2個，結(jié)果見表1。

2.2 作用靶點的預(yù)測及可視化

經(jīng)過多種方法，共預(yù)測到主要化學(xué)成分有關(guān)的作用靶點258個，通過Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥材 活性成分 靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1。其中綠色圓圈代表各個活性化合物，紅色的三角為共有化合物，藍色的方塊代表5味藥材，黃色的菱形代表相關(guān)作用靶點。

圖1 藥材 活性成分 靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Medicinal material active ingredient target network diagram

2.3 懷膝顆粒作用OP相關(guān)靶點的預(yù)測

經(jīng)過TTD、Genecards、OMIM 3個數(shù)據(jù)庫共檢索出OP相關(guān)靶點2 271個，通過Venny2.1將成分靶點與疾病靶點取交集，得到61個共同靶點，將這61個共同靶點視為懷膝顆粒治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點，見圖2。

圖2 成分靶點與疾病靶點交集的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection of component targets and disease targets

2.4 靶點蛋白的相互作用關(guān)系分析

將懷膝顆粒與骨質(zhì)疏松癥交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，獲得交集蛋白相互作用關(guān)系，去掉無連接的蛋白，再將獲得的蛋白相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件中利用其軟件自帶network analysis功能進行分析得到網(wǎng)絡(luò)節(jié)點間的拓撲學(xué)關(guān)系，從而獲得靶點蛋白的相互作用關(guān)系圖，見圖3。圖中圓形節(jié)點表示單個蛋白，節(jié)點之間的連線代表2個蛋白有相互作用關(guān)系。蛋白關(guān)系網(wǎng)中，線越粗，顏色越深，代表兩個蛋白之間的相互作用越強；節(jié)點越大，顏色越深，表明該蛋白在整個關(guān)系網(wǎng)中越重要。其中，雄激素受體、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6都是重要的蛋白，可能為懷膝顆粒治療OP的核心靶點。

圖3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of protein interaction

2.5 富集分析結(jié)果

通過R語言對交集靶點的ID進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，篩選富集程度排名前10的結(jié)果。氣泡越大，顏色越淺，則P值越小，結(jié)果越顯著。如圖4所示，在BP中富集顯著度較高的是對類固醇激素的反應(yīng)、腺體發(fā)育和對酮的反應(yīng)等；在CC中富集顯著度較高的是膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)域等；在MF中富集顯著度較高的是類固醇結(jié)合、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性和氧化還原酶活性等。由圖5可知，在KEGG中富集顯著度較高的是乙型肝炎信號通路、EB病毒感染信號通路、丙型肝炎信號通路等，表明懷膝顆?？赡芡ㄟ^作用于這些通路起到治療OP的作用。

圖4 GO富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

2.6 活性成分 核心靶點 通路網(wǎng)絡(luò)圖分析

如圖6所示，對前10條通路、61個與前10條通路有關(guān)系的靶點、38個與前10條通路有關(guān)系的活性成分進行了分析，藍色菱形代表目標(biāo)靶點，黃色正方形代表通路，紅色圓形代表懷膝顆粒中的活性化合物。由圖可知，木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）所調(diào)控的靶點較多，可能為懷膝顆粒治療OP的主要有效成分。

圖6 通路 有效成分 交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Pathway active component intersection target network diagram

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體上探索藥物與疾病的相關(guān)性，具有注重藥物與靶點間相互作用的特點，其整體性、系統(tǒng)性和與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點相吻合，是一門從系統(tǒng)層面揭示中藥對機體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用的新興學(xué)科[12]。中藥成分復(fù)雜，治療OP的機制不明確是一個巨大的挑戰(zhàn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起正好解決了這個問題，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用于中藥藥理研究，在分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的背景下研究中藥治療OP的作用機制是進一步推動OP防治工作發(fā)展的主要途徑[13]。肝腎虧虛與骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制有著密不可分的關(guān)系[14]。中醫(yī)認為，肝主筋，腎主骨；肝藏血，腎藏精，肝腎同源而精血互生。肝腎功能正常，則骨發(fā)育正常；肝腎功能異常，則可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[15]。

懷膝顆粒由骨碎補、山茱萸、懷牛膝、川芎和鹿茸5味中藥組成。該制劑對去勢大鼠具有增強骨密度、增加骨鈣含量的功效。懷膝顆粒治療OP的核心有效成分為木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）和-谷甾醇（-sitosterol）等。尚丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能促進成骨細胞MC3T3-E1的增殖；Lucía等[17]證實木犀草素能通過促進血清堿性磷酸酶（ALP）的合成進而有利于成骨細胞的分化；Kim等[18]證實木犀草素可抑制破骨細胞的分化和成熟破骨細胞的吸收活性；Yuan等[19]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨細胞的分化，改善了骨的生物力學(xué)性能，從而增加了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度；Konar等[20]通過研究證實了槲皮素對骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein-2,BMP-2）的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有顯著影響，表明槲皮素可作為治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的潛在治療藥物；Derakhshanian等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以顯著提高骨鈣素作為骨形成標(biāo)志物的作用，從而預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥；Zhang等[22]通過實驗證實了-谷甾醇可以抑制破骨細胞分化，從而治療骨質(zhì)疏松癥；Chauhan S等[23]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)木賊提取物對UMR-106細胞株具有明顯的促成骨細胞增殖作用，這是由于其提取物中含有-谷甾醇。

在懷膝顆?；钚猿煞帧琴|(zhì)疏松對應(yīng)的共同靶點蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中，AR、IL-6和TNF是重要的核心蛋白。其中AR在睪酮代替治療降低男性骨質(zhì)疏松癥和骨折風(fēng)險的過程中起著重要的作用[24]。AR通過減少骨硬化素以增強Wnt/-catenin信號通路，從而促進骨形成[25]，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。上調(diào)AR的調(diào)節(jié)劑對老年男性甚至女性的骨質(zhì)疏松有良好的治療作用[26]。IL-6和TNF為炎癥因子，可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷，引起破骨細胞骨吸收增強，導(dǎo)致骨重建失衡[27,28]。IL-6作用于成骨細胞的基質(zhì)細胞，通過刺激破骨細胞形成，增強破骨細胞活性，促進骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的形成[29]。人巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）在破骨細胞前體分化為成熟的破骨細胞的過程中發(fā)揮重要作用，TNF可直接或間接促進M-CSF的產(chǎn)生，加速骨吸收，并使成骨細胞的凋亡加快，減慢骨合成[30]；TNF也在造成骨質(zhì)疏松性疼痛中發(fā)揮了重要作用[31]。

由GO富集分析可知，在CC、BP和MF 3個方面，顯著性最高的分別為膜區(qū)域、對類固醇激素的反應(yīng)及類固醇結(jié)合。糖皮質(zhì)激素是類固醇激素的一種，糖皮質(zhì)激素會減少成骨細胞和骨細胞的壽命和活動，并減少骨骼的血管分布，從而引起骨質(zhì)流失，造成骨質(zhì)疏松[32]。Whittier[33]發(fā)現(xiàn)長期使用糖皮質(zhì)激素的患者通過代替療法后，骨密度會明顯提高。

根據(jù)KEGG通路分析提示懷膝顆粒治療OP的相關(guān)通路涉及乙型肝炎信號通路、丙型肝炎信號通路和C型凝集素受體信號通路。Chen等[34]通過抽樣分析健康保險數(shù)據(jù)庫的HBV患者數(shù)據(jù)，評估了乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染與骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)，證實了HBV感染會增加患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。Chen等[35]通過多元線性回歸模型對肝臟病毒感染與骨礦物質(zhì)密度（Bone Mineral Density,BMD）之間的關(guān)聯(lián)進行檢查，發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染與男性BMD降低顯著相關(guān)。Huang等[36]也通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)HBV患者的BMD低于健康受試者，從而增加了患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。丙型肝炎病毒（Hepatitis CVirus,HCV）感染是絕經(jīng)后婦女骨量減少或骨質(zhì)疏松的獨立危險因素，預(yù)防HCV感染可能有助于降低絕經(jīng)后婦女骨折風(fēng)險[37]。Wijarnpreecha等[38]通過meta分析，證實了HCV感染患者患骨質(zhì)疏松的機率明顯高于健康人群。Olmos-Martínez等[39]通過對慢性HCV患者進行研究，發(fā)現(xiàn)他們的BMD和骨小梁評分（TBS）顯著低于健康人群。Yue等[40]通過研究發(fā)現(xiàn)Clec11a是一種C型凝集素結(jié)構(gòu)域蛋白，它通過促進間充質(zhì)祖細胞分化為成熟的成骨細胞來防止骨質(zhì)疏松。Chan等[41]通過培育敲除Clec11a基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)失去Clec11a基因的小鼠在發(fā)育過程中，骨骼體積僅為正常小鼠的一半，且形成骨小梁的能力大大降低。

綜上所述，懷膝顆粒治療OP具有多靶點、多途徑和多通路的特點，也體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)的辨證論治與整體觀念，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物與疾病的相互關(guān)系能有效的揭示懷膝顆粒治療OP的可能機制。結(jié)果表明，懷膝顆粒中的活性成分木犀草素、槲皮素和-谷甾醇等可能通過作用于AR、IL-6和TNF等關(guān)鍵靶點，在膜區(qū)域上抑制類固醇結(jié)合并調(diào)控乙型肝炎信號通路、丙型肝炎信號通路和C型凝集素受體信號通路等發(fā)揮其臨床功效，達到治療OP的目的。由于本研究主要基于數(shù)據(jù)庫信息的提取，雖然使用多個數(shù)據(jù)庫進行綜合分析，但仍可能與懷膝顆粒發(fā)揮作用的實際過程存在一定的區(qū)別，下一步需要通過動物模型實驗和細胞生物學(xué)實驗進行驗證。