吳豐年，謝素金，李海生，許鵬彬，林銳芝，黃銳浩，徐淡云，陳佳明，吳清韓，張福平，劉麗輝，黃劍堅(jiān)

(1 韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東潮州，521041；2 潮州市果樹(shù)研究所，廣東潮州，515726；3 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南寧，530007)

柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing)是世界柑桔生產(chǎn)中最嚴(yán)重的侵染性病害，植株一旦染病，果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)下降，葉片黃化、植株生長(zhǎng)衰退甚至死亡，經(jīng)濟(jì)壽命縮短，直接影響到全世界柑桔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。目前發(fā)現(xiàn)引起黃龍病的病原菌分為亞洲種“CandidatusLiberibacter asiaticus”、非洲種“Ca.L.africanus”和美洲種“Ca.L.americanus”[2]，其中亞洲種的分布最廣，且在我國(guó)只發(fā)現(xiàn)該種的存在[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)對(duì)柑桔黃龍病基因組中的原噬菌體區(qū)域來(lái)區(qū)分黃龍病菌株[4-5]，不同的亞洲種菌株可攜帶不同類型或多種組合類型的原噬菌體[5-6]。

黃龍病的自然傳播途徑主要通過(guò)媒介昆蟲(chóng)——柑桔木虱Diaphorinacitri的擴(kuò)散[7]。目前對(duì)該蟲(chóng)媒擴(kuò)散能力的看法并不一致。有研究表明，柑桔木虱獲菌和傳病能力較強(qiáng)，途徑多樣，如通過(guò)苗木和接穗、人為活動(dòng)或隨氣流長(zhǎng)距離遷移，距離甚至達(dá)到上千米，造成黃龍病的快速蔓延[8-11]。亦有研究表明，柑桔木虱由于其翅面較窄，主動(dòng)擴(kuò)散能力有限，距離短，若蟲(chóng)活動(dòng)能力更弱[12-15]。隨著分子生物技術(shù)和生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，可通過(guò)種群的分布規(guī)律構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，用于推測(cè)其擴(kuò)散規(guī)律[16]。Wu等[13]通過(guò)柑桔木虱線粒體基因組對(duì)我國(guó)23個(gè)柑桔產(chǎn)區(qū)的柑桔木虱樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)柑桔木虱存在多種群現(xiàn)象，呈地域式分布。

廣東潮汕地區(qū)具備種植柑桔的優(yōu)越自然環(huán)境，是我國(guó)重要的柑桔產(chǎn)區(qū)之一，主產(chǎn)蕉柑(潮州柑)Citrusnobilis‘Jiaogan’(C.reticulata‘Tankan’)，栽培歷史悠久[17]。然而，1936年調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的黃龍病發(fā)病情況已非常嚴(yán)重，是全世界最早發(fā)現(xiàn)黃龍病及其蟲(chóng)媒的地區(qū)之一[18-20]。潮汕地區(qū)的黃龍病及其蟲(chóng)媒樣品在該病害起源和擴(kuò)散研究中具有特殊的意義，但鮮有該地區(qū)蟲(chóng)媒的相關(guān)研究。目前關(guān)于該地區(qū)揭陽(yáng)、潮州及周邊一些省區(qū)柑桔木虱種群的研究報(bào)道，其柑桔木虱樣品均采自高黃龍病抗性的九里香[21]。本研究以潮汕地區(qū)的蕉柑果園為材料來(lái)源，研究不同蟲(chóng)媒管理水平對(duì)黃龍病發(fā)生情況和柑桔木虱種群數(shù)量的影響，驗(yàn)證黃龍病菌株與柑桔木虱種群的多態(tài)性并推斷其擴(kuò)散規(guī)律，為黃龍病的起源擴(kuò)散研究及防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蕉柑果園田間調(diào)查所調(diào)查的蕉柑果園選自潮州市饒平縣錢(qián)東鎮(zhèn)萬(wàn)山紅(潮州市果樹(shù)研究所)、三饒鎮(zhèn)馬崗村、樟溪鎮(zhèn)西嶺村、樟溪鎮(zhèn)烈火村、浮山鎮(zhèn)玉田村，饒平縣石壁村，揭陽(yáng)市砲臺(tái)鎮(zhèn)等。每個(gè)果園種植蕉柑數(shù)量200株以上，樹(shù)齡6～13年，土壤有機(jī)質(zhì)含量中等，自然排灌條件較好。根據(jù)蟲(chóng)媒防控情況，將果園管理分成以下3種水平：有針對(duì)蟲(chóng)媒的管理(每年根據(jù)柑桔病蟲(chóng)害發(fā)生情況按期噴藥，且兼治柑桔木虱4～6次)(圖1A)、無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒的管理(有定期噴施農(nóng)藥，但沒(méi)有專門(mén)進(jìn)行柑桔木虱的監(jiān)測(cè)和防治)(圖1B)和無(wú)管理(廢棄果園，無(wú)任何管理2年以上)(圖1C)。每種管理水平各選取代表性果園3個(gè)。

圖1 有針對(duì)蟲(chóng)媒的管理(A)、無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒的管理(B)和無(wú)管理果園(C)代表植株的生長(zhǎng)情況

2020年8—12月，根據(jù)黃龍病的田間癥狀，對(duì)各果園的發(fā)病情況進(jìn)行初步診斷。每個(gè)果園采用5點(diǎn)(東西南北中)取樣法，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)選擇9株長(zhǎng)勢(shì)相近的植株，每個(gè)果園調(diào)查45株，3種水平9個(gè)果園總共調(diào)查405株。參照文獻(xiàn)[22]提出的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將黃龍病分為0級(jí)(無(wú)發(fā)病，全樹(shù)無(wú)病狀)、1級(jí)(輕度發(fā)病，癥狀枝占全樹(shù)的1/3以下)、2級(jí)(中度發(fā)病，癥狀枝占全樹(shù)的1/3～2/3)和3級(jí)(重度發(fā)病，癥狀枝在2/3以上至全樹(shù)死亡)。選取60個(gè)(每個(gè)果園挑選6～7個(gè))帶病葉片樣品，冷藏保存，供后續(xù)分子檢測(cè)用。

在病害調(diào)查過(guò)程中，同時(shí)對(duì)柑桔木虱進(jìn)行調(diào)查。柑桔木虱卵、若蟲(chóng)及成蟲(chóng)的調(diào)查均采用新梢調(diào)查法，每株樹(shù)選4個(gè)不同方位，每個(gè)方位選擇3個(gè)嫩梢，分別統(tǒng)計(jì)各蟲(chóng)態(tài)的數(shù)量。樣品分裝后，保存在75%的酒精中，供后續(xù)分子檢測(cè)用。

1.2 帶病葉片樣品及柑桔木虱樣品的黃龍病病原檢測(cè)和菌株分析通過(guò)E.Z.N.A.? Plant DNA試劑盒(OMEGA Company，Norcross Georgia，USA)提取葉片樣品DNA，稱取0.1 g成熟葉片基部中脈，剪碎研磨后提取。通過(guò)DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen，Shanghai，China)提取柑桔木虱DNA，每個(gè)果園隨機(jī)挑選20頭柑桔木虱成蟲(chóng)或高齡若蟲(chóng)，單頭進(jìn)行分子檢測(cè)(若數(shù)量少于20頭的則全部檢測(cè))。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物探針[23]及Wu等[11]的判斷依據(jù)確定柑桔木虱帶菌情況，得出陽(yáng)性柑桔木虱樣品拷貝數(shù)，通過(guò)NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific公司)檢測(cè)儀對(duì)DNA樣品進(jìn)行核酸濃度檢測(cè)，計(jì)算出相對(duì)菌濃度(單位：copies/ng)。

為了分析該地區(qū)黃龍病的菌株，通過(guò)常規(guī)PCR引物擴(kuò)增OI1/OI2c[2]擴(kuò)增以上葉片樣品和濃度較高(擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct<30)的柑桔木虱樣品的16S rDNA區(qū)域。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)全式金生物(TransGen Biotech)PCR純化試劑盒進(jìn)行純化和回收。將純化產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果截取引物擴(kuò)增區(qū)域，并與GenBank黃龍病菌亞洲種(基因庫(kù)序列號(hào)DQ157273)、非洲種(L22533)和美洲種(AY742824)的16S rDNA相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。此外，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增確定所有樣品的原噬菌體類型，所用特異引物和反應(yīng)條件均參考Zheng等[5-6]的研究。

1.3 柑桔木虱種群多態(tài)性分析從蕉柑果園采集到的柑桔木虱DNA樣品中挑選質(zhì)量較高的樣品，用illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit(GE Healthcare Inc.，Waukesha，WI，USA)進(jìn)行放大，放大產(chǎn)物通過(guò)Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA)進(jìn)行測(cè)序。使用采自廣東廣州的柑桔木虱線粒體全基因組(NC_030214)為參考基因組，用CLC Genomics Workbench v.11(CLC Bio，Denmark)軟件進(jìn)行映射(mapping)和拼接，獲得潮汕地區(qū)蕉柑果園的柑桔木虱線粒體全基因組的代表。隨機(jī)選取30頭潮汕地區(qū)蕉柑果園采集到的柑桔木虱的DNA，對(duì)于高變異基因(cox2、atp8、nad3、nad1和rrnL)區(qū)域進(jìn)行再次驗(yàn)證，確?；蚪M是否具有一致性，檢測(cè)方法參考Wu等[16]的研究。

從Genbank中下載來(lái)自我國(guó)的柑桔木虱線粒體基因組(23個(gè))，以及作為外群體的美國(guó)加州和佛羅里達(dá)州的樣品基因組[16]，截取以上5個(gè)高變異基因序列，利用MEGA v.6.0軟件進(jìn)行組合和比對(duì)，通過(guò)最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)之前，使用ModelTest估計(jì)對(duì)比序列的最優(yōu)替代模型，其中“HKY+G”為最優(yōu)。分支中的節(jié)點(diǎn)支持通過(guò)自展分析(bootstrap analysis)計(jì)算，設(shè)500次重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析基于數(shù)據(jù)重復(fù)數(shù)量和預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)分布模式，兩組數(shù)據(jù)間的顯著性比較采用Wilcoxon Mann-Whitney檢驗(yàn)(α=0.05)，多組數(shù)據(jù)通過(guò)Tukey′s studentized range test進(jìn)行多重比較(α=0.05)。統(tǒng)計(jì)過(guò)程由SAS v.9.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同管理果園黃龍病發(fā)病情況調(diào)查分析結(jié)果看出，3種蟲(chóng)媒管理水平之間各級(jí)病株率差異均達(dá)顯著水平。有針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園，無(wú)發(fā)病株率(0級(jí)病株率)最高，占94.07%；有癥狀株率最低，占5.93%，病級(jí)均為1級(jí)。無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園，無(wú)發(fā)病株率和有癥狀株率分別為57.04%和42.96%，發(fā)病程度不一致，病級(jí)包括1級(jí)(13.33%)、2級(jí)(21.48%)和3級(jí)(8.15%)。無(wú)管理果園100.00%出現(xiàn)黃化癥狀，且病級(jí)是2級(jí)(10.37 %)和3級(jí)(89.63 %)(見(jiàn)表1)。

表1 3種蟲(chóng)媒管理水平下蕉柑果園的黃龍病發(fā)病情況

2.2 不同管理果園柑桔木虱種群數(shù)量和帶菌情況調(diào)查分析結(jié)果看出，3種蟲(chóng)媒管理水平下的柑桔木虱各蟲(chóng)態(tài)數(shù)量(卵：F=6.209，p=0.034 6；若蟲(chóng)：F=17.343，p=0.003 2；成蟲(chóng)：F=96.666，p=0.000 1)及總數(shù)量(F=14.203，p=0.005 3)差異均達(dá)到顯著性(見(jiàn)圖2)。有針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園，柑桔木虱卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)及總數(shù)均最低，其中卵和若蟲(chóng)的數(shù)量為0；無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園，柑桔木虱成蟲(chóng)較少，但卵和若蟲(chóng)數(shù)量最多，平均每果園分別達(dá)到93.33粒和40頭，造成總量最多；無(wú)管理果園，柑桔木虱成蟲(chóng)數(shù)量最多，平均每果園達(dá)到68頭，而卵和若蟲(chóng)數(shù)量反而較少。此外，3種管理水平下的柑桔木虱雌蟲(chóng)比例沒(méi)有明顯差異，分別為60%(3/5，有針對(duì)蟲(chóng)媒的管理)，57.69%(15/26，無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒的管理)和53.43%(109/204，無(wú)管理)。

對(duì)柑桔木虱成蟲(chóng)和部分若蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明，3種蟲(chóng)媒管理水平下的柑桔木虱帶菌率(F=187.60，p=0.000 1)和陽(yáng)性樣品帶菌量(F=5.08，p=0.009 7)均存在顯著性差異。其中，有針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園均未檢測(cè)出黃龍病菌；無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒管理的果園，柑桔木虱帶菌率為10.00%，帶菌量達(dá)135.50 copies/ng；無(wú)管理果園，柑桔木虱帶菌率最高，達(dá)到76.67%，且陽(yáng)性樣品菌濃度也最高，達(dá)到421.12 copies/ng(見(jiàn)圖3)。

2.3 潮汕蕉柑園黃龍病菌株類型通過(guò)序列比對(duì)結(jié)果表明，潮汕地區(qū)蕉柑植株與柑桔木虱所攜帶黃龍病菌的擴(kuò)增片段序列，與GenBank中黃龍病菌亞洲種、非洲種和美洲種的16S rDNA片段序列的同源性分別為100%、98.62%和94.65%。因此，從分子水平上證明潮汕地區(qū)蕉柑上黃龍病菌均為亞洲種。

進(jìn)一步對(duì)采集到的112個(gè)帶菌樣品(60個(gè)蕉柑葉片樣品+52個(gè)柑桔木虱樣品)的原噬菌體菌株類型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所有柑桔葉片和媒介昆蟲(chóng)樣品均攜帶原噬菌體Type 2類型的菌株，且都沒(méi)有檢測(cè)到Type 1和Type 3類型的菌株存在。

2.4 潮汕蕉柑園柑桔木虱種群類型從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可看出，潮汕地區(qū)蕉柑果園內(nèi)所采集到的柑桔木虱，其線粒體基因組的5個(gè)高變異基因序列，與先前報(bào)道的潮州市、揭陽(yáng)市、臺(tái)灣和福建等省市九里香寄主上采集到的柑桔木虱線粒體基因序列完全一致，屬同一類型，且隨機(jī)挑選各個(gè)果園的柑桔木虱20頭，發(fā)現(xiàn)該高變區(qū)域的序列相似性達(dá)到100%。說(shuō)明，該地區(qū)蕉柑果園的柑桔木虱種群依然比較單一，沒(méi)有外來(lái)種群入侵的現(xiàn)象(見(jiàn)圖4)。

注：每種管理水平選3個(gè)果園。各蟲(chóng)態(tài)不同管理水平之間的差異通過(guò)Tukey′s studentized range test(α=0.05)進(jìn)行驗(yàn)證，相同字母表示差異沒(méi)有顯著性。圖2 3種蟲(chóng)媒管理水平下平均各蕉柑果園柑桔木虱各蟲(chóng)態(tài)數(shù)量

注：圖A中每種管理水平選用3個(gè)果園(重復(fù))，不同管理水平之間的木虱帶菌率通過(guò)Tukey′s studentized range test多重比較(p<0.05)進(jìn)行驗(yàn)證，相同小寫(xiě)字母者表示數(shù)量沒(méi)有顯著性差異。圖B中每組數(shù)據(jù)的重復(fù)數(shù)為每種管理水平果園檢測(cè)到的陽(yáng)性樣品個(gè)數(shù)。帶菌量：每ng昆蟲(chóng)DNA中黃龍病菌16S rDNA基因的拷貝數(shù)；N/A：無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)；**：無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒管理與無(wú)管理果園陽(yáng)性樣品相對(duì)菌濃度差異極顯著(p<0.01，Wilcoxon Mann-Whitney檢驗(yàn))。圖3 3種蟲(chóng)媒管理水平蕉柑果園柑桔木虱帶菌率(A)及陽(yáng)性樣品相對(duì)帶菌濃度(B)

注：節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示最大似然法分析得到的后驗(yàn)概率。下劃線標(biāo)記樣品為本研究所用樣品，其余序列為目前GenBank已公開(kāi)的中國(guó)柑桔木虱線粒體基因組序列，美國(guó)的兩樣品作為外群體，采集地點(diǎn)后面為發(fā)現(xiàn)柑桔木虱的寄主植物及GenBank序列號(hào)。圖4 基于5個(gè)高變異線粒體基因(cox2、atp8、nad3、nad1和rrnL)構(gòu)建的潮汕地區(qū)蕉柑果園柑桔木虱系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，潮汕地區(qū)無(wú)管理蕉柑果園黃龍病較嚴(yán)重，所有植株均黃化，嫩梢較少；柑桔木虱成蟲(chóng)主要集中在無(wú)管理果園，而柑桔木虱卵和若蟲(chóng)數(shù)量在無(wú)針對(duì)蟲(chóng)媒管理的蕉柑果園中反而更多。說(shuō)明，這兩種不同管理水平果園之間柑桔木虱種群存在轉(zhuǎn)移的可能性較高。Wu等[24]發(fā)現(xiàn)，因趨黃性，柑桔木虱成蟲(chóng)更容易趨向于黃化的黃龍病樹(shù)，再加上無(wú)任何防控措施，其他果園的柑桔木虱成蟲(chóng)可以更頻繁地轉(zhuǎn)移到黃龍病樹(shù)較多的無(wú)管理果園中。因此，不同的蟲(chóng)媒管理水平會(huì)促使柑桔木虱種群的轉(zhuǎn)移，而較好的蟲(chóng)媒管理可有效防止外果園柑桔木虱的入侵，減輕黃龍病的發(fā)病和蔓延。

據(jù)目前報(bào)道，我國(guó)各省(區(qū))黃龍病菌株具有3個(gè)類型，其中廣東、江西、廣西、福建的黃龍病菌株為I組，浙江和湖南的菌株為II組，云南和海南的菌株為III組[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，潮汕地區(qū)黃龍病樣品(菌株)只含有Type 2單一類型的原噬菌體，該菌株類型與Zheng等[6]及李嘉慧等[25]報(bào)道的內(nèi)容相符合，均屬于I組，說(shuō)明主要為害該地區(qū)的黃龍病菌株仍與先前發(fā)現(xiàn)的一致。

在黃龍病蔓延過(guò)程中，蟲(chóng)媒傳播是最主要的自然途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，潮汕地區(qū)蕉柑果園中的柑桔木虱種群所有樣品，與該起源地及鄰近九里香寄主上的柑桔木虱樣品完全一致，且仍然保持單一種群類型。表明，作為我國(guó)黃龍病和柑桔木虱起源地之一的潮汕地區(qū)，當(dāng)?shù)馗探勰臼上x(chóng)的擴(kuò)散可能是黃龍病擴(kuò)散和爆發(fā)的主要原因。