何 冰，武愛龍，沈一躍，鄭佳明，吳建陽

(1 湛江幼兒師范?？茖W(xué)校，廣東湛江，524037；2 嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院，廣東湛江，524037)

乙烯是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，對果實成熟與衰老起關(guān)鍵作用[1]。植物體內(nèi)乙烯生物合成途徑為：在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下蛋氨酸轉(zhuǎn)變成腺苷蛋氨酸，接著在ACC合成酶 (ACS)作用下腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)變成ACC，最后在ACC氧化酶(ACO)催化下生成乙烯[2-4]，因此，ACS是乙烯合成路徑中的關(guān)鍵限速酶。

ACS由多基因家族編碼，目前，多種果樹已從基因組層面分離出ACS基因家族所有成員[5-7]，且與果實成熟相關(guān)的關(guān)鍵ACS基因也被闡明[8-9]。香蕉基因組測序早已完成[10-11]，借助于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫，本課題組共鑒定出12個ACS基因家族成員[12]，但鮮有從基因組層面系統(tǒng)研究ACS基因在香蕉果實成熟過程中的表達(dá)情況。本研究在香蕉采后，通過乙烯利、自然成熟和1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理，分析ACS基因家族成員表達(dá)，據(jù)此初步闡明調(diào)控香蕉采后成熟的關(guān)鍵ACS基因。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

巴西蕉MusaacuminateL.AAA group ‘Brazilian’，來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所香蕉園(廣東湛江)，采摘七八成熟果實，立即運回實驗室，每梳香蕉分成單個果指后，用清水洗凈，去除殘花，挑選均勻一致的無病蟲害、無機(jī)械傷的果實，清水洗凈，經(jīng)500 mg/L施保功處理3 min后晾干待用。

挑選成熟度一致的香蕉分成3份，一份自然成熟，一份用500 mg/L乙烯利處理，一份用500 mg/L 1-MCP處理18 h，處理后均用打孔聚乙烯包裝袋包裝，放置25 ℃室溫正常后熟，定期觀察和取樣分析。采摘當(dāng)天記為0 d并取樣，自然成熟的1、4、7、17 d取樣，乙烯利處理后1、4、7 d取樣，1-MCP處理后1、4、7、17、21 d取樣果肉(見圖1)，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫崛NA。

圖1 不同處理不同時間巴西香蕉果實比較

1.2 香蕉MaACS熒光定量表達(dá)分析

采用華越洋生物科技有限公司的產(chǎn)品，植物RNA提取試劑盒提取香蕉總 RNA。每個樣品取1 μL檢測RNA質(zhì)量和濃度后，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa 公司)合成cDNA鏈。選用NCBI上已登錄的香蕉MaActin片段為內(nèi)參，引物序列根據(jù)已登錄序列進(jìn)行設(shè)計，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果查找采后成熟過程中ACS表達(dá)量高且有差異的基因，共計4個，根據(jù)基因的ID號查找已測序香蕉基因組中選定的MaACS編碼序列，設(shè)計相應(yīng)的熒光定量引物。引物序列見表1。

表1 MaACS引物序列

實時定量PCR采用TaRaKa公司試劑盒，染料為SYBR Green，在RoChe Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL，PCR產(chǎn)物長度為200 bp左右。熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。每個反應(yīng)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利處理采后香蕉不同時間MaACS的實時熒光定量相對表達(dá)

從圖2可以看出，乙烯利處理后MaACS4、MaACS6、MaACS10在成熟過程中表達(dá)上調(diào)，其中處理后7 dMaACS10相對表達(dá)量最高，其次是MaACS4，處理后不同時間MaACS6表達(dá)量差異不明顯。而MaACS13在成熟過程的表達(dá)量在處理后4 d達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量急劇下降。

圖2 乙烯利處理采后香蕉不同時間香蕉MaACS的實時熒光定量相對表達(dá)

2.2 自然成熟香蕉采后不同時間MaACS的實時熒光定量相對表達(dá)

從圖3可以看出，自然成熟過程中MaACS4表達(dá)量在處理后0～7 d逐漸下調(diào)，17 d完全成熟的香蕉果實中表達(dá)量急劇上調(diào)。MaACS6表達(dá)量在處理后1 d達(dá)到峰值，隨后表達(dá)下調(diào)，17 d的表達(dá)量與0 d差異不明顯。MaACS10隨著果實成熟表達(dá)量上調(diào)，處理后17 d達(dá)到峰值。MaACS13在前面4個時間點表達(dá)量稍有增加，但處理后17 d表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖3 自然成熟香蕉采后不同時間MaACS的實時熒光定量相對表達(dá)

2.3 1-MCP處理采后香蕉不同時間MaACS的實時熒光定量相對表達(dá)

從圖4可以看出，1-MCP處理后MaACS4在0～1 d表達(dá)量稍有下降，4～17 d表達(dá)量上調(diào)，且表達(dá)量與0 d基本一致，21 d表達(dá)量急劇上調(diào)。MaACS6表達(dá)量在0～1 d快速下降，1～17 d顯著增加，21 d稍有下降。MaACS10表達(dá)量在0～4 d幾乎無變化，7～21 d顯著增加，并在21 d達(dá)到峰值。MaACS13在0～1 d表達(dá)量顯著下降，1～4 d表達(dá)量快速增加，4～17 d表達(dá)量稍有波動，21 d表達(dá)量急劇下調(diào)。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同處理對香蕉ACS基因家族成員表達(dá)的影響

香蕉富含蛋白質(zhì)、維生素、淀粉和糖等營養(yǎng)物質(zhì)，是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物[13]，目前，超過150個國家都在種植香蕉，每年可以生產(chǎn)1.05億t[14]。中國是繼印度之后第二大香蕉生產(chǎn)大國，廣東、海南、云南是中國生產(chǎn)香蕉的3個主要省份[15]。香蕉屬于呼吸躍變型果實，外源乙烯處理可以促進(jìn)內(nèi)源乙烯的生成，進(jìn)而促進(jìn)果實成熟與衰老[16-17]。1-MCP是一種乙烯受體抑制劑，通過與乙烯受體不可逆結(jié)合來阻斷乙烯生成，進(jìn)而延緩成熟衰老[18]。

Yuan等利用外源乙烯處理梨果實，發(fā)現(xiàn)13個ACS基因中有4個ACS基因受外源乙烯處理誘導(dǎo)表達(dá)[19]；利用外源乙烯處理番茄果實研究表明，在番茄8個ACS基因中，LEACS1A和LEACS6表達(dá)量下降，LEACS2表達(dá)量增加，LEACS4未檢測到表達(dá)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯處理可以促進(jìn)香蕉成熟，在此過程中，ACS基因家族成員表達(dá)量呈現(xiàn)3種不同趨勢。第一種為MaACS4和MaACS10，前期表達(dá)量較低且變化不大，后期顯著增加；第二種為MaACS6，先降低后增加；第三種為MaACS13，先降低后增加再降低。盡管ACS基因家族成員表現(xiàn)出3種表達(dá)趨勢，但只有MaACS10的表達(dá)倍數(shù)發(fā)生千倍的變化。

番茄果實在自然成熟過程中，8個ACS基因中，LEACS1A表達(dá)量先增加后降低，LEACS2和LEACS4表達(dá)量增加，LEACS6表達(dá)量下降，另外4個ACS基因未檢測到表達(dá)[20]。李中有4個ACS基因，“Early Golden”和“Shiro”品種自然成熟過程中PsACS4和PsACS5分別表現(xiàn)出受乙烯正調(diào)控和負(fù)調(diào)控[21]。本研究表明，香蕉在自然成熟過程中，ACS基因家族成員表達(dá)量呈現(xiàn)2種不同趨勢。MaACS4和MaACS10前期表達(dá)量較低且變化不大，后期顯著增加，屬于一種類型；另一種為前期先增加后期降低，MaACS6和MaACS13即屬于該類型。盡管ACS基因家族成員表現(xiàn)出2種表達(dá)趨勢，但只有MaACS10的表達(dá)倍數(shù)發(fā)生千倍的變化。

利用1-MCP處理梨果實，發(fā)現(xiàn)13個ACS中有2個基因受1-MCP處理誘導(dǎo)表達(dá)[19]；利用1-MCP處理李果實研究表明，李4個ACS基因中，PsACS3表達(dá)量不受影響，果肉中PsACS1和PsACS4的表達(dá)量受到嚴(yán)重抑制[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理可以延緩香蕉成熟，在此過程中，ACS基因家族成員表達(dá)量呈現(xiàn)2種不同趨勢。MaACS4和MaACS10前期表達(dá)量較低且變化不大，后期顯著增加，為一種類型；另一種為先降低后增加再降低，MaACS6和MaACS13屬于這種。盡管ACS基因家族成員表現(xiàn)出2種表達(dá)趨勢，但只有MaACS10的表達(dá)倍數(shù)發(fā)生千倍的變化。

3.2 調(diào)控香蕉成熟的關(guān)鍵ACS基因

對蘋果的研究表明，MdACS1和MdACS3a對調(diào)控果實發(fā)育成熟具有重要作用[22-23]；番茄中，LeACS1a、LeACS2、LeACS4和LeACS6基因與果實發(fā)育成熟密切相關(guān)[24]；CmACS1、CmACS7和CmACS11對調(diào)控果實成熟發(fā)揮著重要作用[25-27]；DKACS1基因影響著柿果的成熟過程[28]；RiACS1與樹莓果實成熟密切相關(guān)[29]。本研究表明，MaACS4在乙烯利、自然成熟和1-MCP處理后的表達(dá)趨勢一致，均為前期變化不大，成熟時快速增加，但最終上調(diào)倍數(shù)小于10。乙烯利和1-MCP處理后，MaACS6表達(dá)量先下降后增加，自然成熟則先增加后下降。3種處理的MaACS10表達(dá)量前期比較低且變化不大，但在成熟時急劇增加并達(dá)到峰值，最終上調(diào)倍數(shù)達(dá)到約1 700倍。乙烯利和1-MCP處理后，MaACS13表達(dá)量先下降后增加再下降，自然成熟的前期變化不大，但成熟時顯著下降。由于在4個ACS基因家族成員中，只有MaACS10在3個不同處理中的表達(dá)趨勢一致，且最終表達(dá)量上調(diào)約1 700倍，推測MaACS10是調(diào)控香蕉成熟的關(guān)鍵基因。