張晨晨，王佳卉，劉麗琴，王一承，周建男，胡小文，石勝友

(1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢，430070；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524091)

單果質(zhì)量是龍眼重要的果實(shí)品質(zhì)性狀之一，對(duì)龍眼單果質(zhì)量性狀進(jìn)行精確的遺傳解析，對(duì)于快速培育大果優(yōu)質(zhì)龍眼具有重要意義。龍眼單果質(zhì)量是多基因控制的數(shù)量性狀遺傳[1]，基于系譜的連鎖作圖是解析植物數(shù)量性狀遺傳機(jī)制的主要方法[2]。目前報(bào)道的龍眼遺傳圖譜均是由我國完成的。龍眼上構(gòu)建的多為父、母本單個(gè)連鎖遺傳圖譜[3-5]，僅有1個(gè)整合圖譜，總圖距為2 060.6 cM，標(biāo)記間的平均距離為4.5 cM，包含20個(gè)連鎖群，定位到6個(gè)與單果質(zhì)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)[1]。前人構(gòu)建圖譜所用的作圖群體規(guī)模較小(僅94株)，使用RAPD、SRAP、AFLP、ISSR等傳統(tǒng)分子標(biāo)記進(jìn)行圖譜構(gòu)建和QTL定位研究，此類標(biāo)記本身存在缺陷[6]，且連鎖群與實(shí)際染色體數(shù)目不對(duì)應(yīng)，致使圖譜精度不高，無法準(zhǔn)確、高效的鑒定QTL區(qū)段的候選基因。高密度遺傳圖譜與利用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記構(gòu)成的圖譜相比，具有高通量，定位區(qū)間小等優(yōu)勢(shì)，有利于精準(zhǔn)定位和候選基因挖掘的研究。本研究以龍眼優(yōu)質(zhì)品種“鳳梨朵”和大果主栽品種“大烏圓”為親本，雜交產(chǎn)生的200株雜交后代為作圖群體，基于RAD-seq技術(shù)開發(fā)SNP標(biāo)記構(gòu)建高密度遺傳圖譜，并對(duì)單果質(zhì)量性狀進(jìn)行定位研究，以期為未來龍眼單果質(zhì)量等重要性狀進(jìn)行精細(xì)定位、圖位克隆以及功能基因挖掘等研究提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以優(yōu)質(zhì)品種“鳳梨朵”為母本，大果品種“大烏圓”為父本雜交所獲得的200株F1(FD群體)及親本為作圖群體。于2002年雜交，實(shí)體材料均保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所龍眼種質(zhì)資源圃中。

采集龍眼自然轉(zhuǎn)綠葉片放于錫箔紙中，隨即置于液氮中，采集完畢后放于-80 ℃超低溫冰箱中保存，提取群體DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，使用Nanodrop ND 2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。

1.2 RAD文庫的構(gòu)建

RAD文庫構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[7]。父母本及FD群體的每個(gè)樣本取基因組DNA 1 μg用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，從而得到適合的marker密度，在酶切后的片段兩端加P1 Adapter，把DNA片段pooling隨機(jī)打斷到一定的片段，電泳回收200～400 bp的龍眼片段，末端平化后加A，加入局部為雙鏈分叉Y型DNA的P2 Adapter，PCR擴(kuò)增兩端分別含有P1和P2接頭的tag序列，Cluster制備，上機(jī)測(cè)序。

1.3 RAD序列的分析和SNP分子標(biāo)記的開發(fā)

將父母本和200個(gè)子代文庫測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾掉含有接頭序列的reads pair，單端測(cè)序read中N含量超過該條read長度比例的10%的paired reads，及單端測(cè)序read中含有低質(zhì)量(質(zhì)量值Q ≤5)堿基數(shù)超過該條read長度比例50%的paired reads。將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，參考基因組的大小為495 Mb。

1.4 龍眼高密度高精度遺傳圖譜的構(gòu)建

利用高質(zhì)量SNP標(biāo)記，構(gòu)建龍眼高密度高精度分子遺傳圖譜。使用Joinmap 4.1劃分連鎖群，對(duì)劃分好的連鎖群采用最大釋然法進(jìn)行排序，對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行校正，然后再使用回歸算法進(jìn)行排序，父本與母本圖譜完成后，使用mergemap進(jìn)行整合獲得整合圖譜。

1.5 龍眼單果質(zhì)量QTL定位

6月中下旬果實(shí)成熟時(shí)，從植株樹冠外圍選取生長發(fā)育正常并有代表性的果實(shí)，每植株選取果實(shí)10個(gè)，用電子天平稱重，取平均值，精確到0.1 g，對(duì)單果質(zhì)量進(jìn)行QTL分析，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，獲得龍眼單果質(zhì)量的QTL位點(diǎn)數(shù)量、位置等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果分析及龍眼SNP標(biāo)記的開發(fā)

利用RAD-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)“鳳梨朵”ד大烏圓”200株雜交后代及父母本進(jìn)行測(cè)序，202個(gè)樣本中總測(cè)序量為232.3 Gb，平均每個(gè)個(gè)體的原始數(shù)據(jù)的堿基數(shù)量為1.15 Gb，堿基序列為150 bp。母本“鳳梨朵”和父本“大烏圓”的標(biāo)準(zhǔn)文庫分別含有原始數(shù)據(jù)的堿基數(shù)量3.08 Gb和3.21 Gb，鳥嘌呤胞嘧啶(GC)含量分別為35%和34.54%。經(jīng)過過濾和篩選，“鳳梨朵”和“大烏圓”分別保留高質(zhì)量堿基數(shù)量3.04 Gb和3.14 Gb ，數(shù)據(jù)的有效利用率分別能夠達(dá)到98.64%和97.88%(見表1)。

表1 龍眼樣本測(cè)序結(jié)果和父母本遺傳信息

經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，獲得SNP位點(diǎn)698 615個(gè)，包括lm×ll標(biāo)記301 235個(gè)，占比43.12%，nn×np標(biāo)記184 735個(gè)，占比26.44%，hk×hk標(biāo)記123 178個(gè)，占比17.63%。在完整性過濾，卡方檢驗(yàn)后，對(duì)30 844個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)一步分析。在這些標(biāo)記中，18 663個(gè)雜合SNPs存在于“鳳梨朵”lm×ll中，11 942個(gè)雜合SNPs存在于“大烏圓”nn×np中，239個(gè)雜合SNPs存在于雙親hk×hk中(見表2)。

在使用Joinmap 4.0測(cè)試標(biāo)記分離率時(shí)，22 830個(gè)標(biāo)記被排除在進(jìn)一步分析之外，最后保留SNP標(biāo)記8 014個(gè)，由4 722個(gè)lm×ll標(biāo)記、3 095個(gè)nn×np標(biāo)記和197個(gè)hk×hk標(biāo)記組成，用于連鎖測(cè)定后的遺傳圖譜構(gòu)建。

2.2 龍眼高密度SNP遺傳圖譜構(gòu)建

利用檢測(cè)到的8 014個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)構(gòu)建遺傳圖譜。構(gòu)圖時(shí)，分群LOD閾值設(shè)置為6.0，采用回歸算法和Kosambi’s函數(shù)計(jì)算遺傳距離。母本“鳳梨朵”被劃為15個(gè)連鎖群，總遺傳距離為2 768.79 cM，平均遺傳距離為0.56 cM，包含SNP標(biāo)記3 292個(gè)(見表1和圖1)；父本“大烏圓”被劃分為15個(gè)連鎖群，總遺傳距離為2 633.46 cM，平均遺傳距離為0.8 cM，包含SNP標(biāo)記4 919個(gè)(見表1和圖2)。使用MergeMap軟件對(duì)父母本連鎖群進(jìn)行整合，成功構(gòu)建了由15個(gè)連鎖群組成的龍眼高密度遺傳圖譜(見圖3)，該圖譜總的遺傳距離為2 873.39 cM，每個(gè)連鎖群的長度為113.93～442.99 cM，該圖譜中長度最大的連鎖群為LG5，長度最小的連鎖群為LG12；該連鎖群中共含有8 014個(gè)上圖標(biāo)記，每個(gè)連鎖群的上圖標(biāo)記數(shù)量為312～1 075個(gè)不等，15個(gè)連鎖群中上圖標(biāo)記數(shù)量最多的為LG5，上圖標(biāo)記數(shù)量最少的為LG12；該連鎖群的平均遺傳距離為0.36 cM，每個(gè)連鎖群的平均遺傳圖距為0.27～0.41 cM，標(biāo)記距離最小的連鎖群為LG8，標(biāo)記距離較大的連鎖群為LG2、LG3和LG5。該圖譜是目前龍眼上密度最高的龍眼遺傳圖譜。

圖2 父本“大烏圓”龍眼遺傳連鎖圖譜

圖3 龍眼高密度SNP遺傳圖譜

2.3 單果質(zhì)量性狀表型分析

“鳳梨朵”單果質(zhì)量為9.15 g，“大烏圓”單果質(zhì)量為15.27 g，F(xiàn)D群體單果質(zhì)量最大值15.89 g，最小值4.68 g，平均(9.76±2.35)g，變異系數(shù)24.11%，偏度-0.52，峰度-0.04。FD群體的平均單果質(zhì)量在母父本之間，表現(xiàn)為中親優(yōu)勢(shì)。單果質(zhì)量性狀偏度和峰值的絕對(duì)值都小于1，符合正態(tài)分布規(guī)律，可用于單果質(zhì)量的QTL定位。

2.4 單果質(zhì)量QTL定位

本研究采用MapQTL 6.0中的區(qū)間映射(IM)模型進(jìn)行QTL分析。基于200個(gè)的單果質(zhì)量表型數(shù)據(jù)，結(jié)合SNP高密度遺傳圖譜進(jìn)行QTL作圖。結(jié)果可以看出，總共定位到QTL位點(diǎn)65個(gè)，分布于7個(gè)連鎖群上，即LG1、LG3、LG4、LG5、LG8、LG10和LG14，其中，LG3和LG5上各檢測(cè)出QTL位點(diǎn)1個(gè)，LG1、LG4、LG8、LG14、LG10上分別檢測(cè)出QTL位點(diǎn)11、3、4、5和40個(gè)(見圖4和表3)。

表3 單果質(zhì)量在“鳳梨朵”ד大烏圓”F1代中的QTL定位

圖4 “鳳梨朵”ד大烏圓”龍眼F1代單果質(zhì)量QTL定位

3 結(jié)論與討論

遺傳圖譜作為闡明數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)的重要工具，其密度對(duì)QTL位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)定位至關(guān)重要[8]。研究表明，作圖群體的大小會(huì)對(duì)遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位的準(zhǔn)確性等造成一定的影響，且隨著作圖群體的增大，其準(zhǔn)確性也隨之上升[9]。當(dāng)作圖群體的規(guī)模超過200時(shí)，群體規(guī)模對(duì)遺傳圖譜構(gòu)建和QTL分析準(zhǔn)確性的影響較小[9-10]。此外，以現(xiàn)有的遺傳圖譜的間距(≥4.5 cM)實(shí)現(xiàn)圖位克隆的難度較大[3]。因此，構(gòu)建圖譜群體數(shù)量大，密度高的龍眼高密度遺傳圖譜，對(duì)于實(shí)現(xiàn)龍眼目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)定位和分子標(biāo)記輔助育種至關(guān)重要。

注：LG1—LG15表示15個(gè)連鎖群。圖1至圖3同。圖1 母本“鳳梨朵”龍眼遺傳連鎖圖譜

簡化基因組測(cè)序技術(shù)在一定程度上增加了分子標(biāo)記的數(shù)量和遺傳圖譜的密度，對(duì)于分析目標(biāo)性狀的遺傳機(jī)制是有效的[11]。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于非模式生物[12-13]，如棗樹[14]，茶樹[15]，木本竹[16]，鵝掌秋[17]，杜鵑花[18]，煙草[19]等。王中堂[20]利用GBS技術(shù)，成功地完成棗高密度遺傳圖譜構(gòu)建，并定位到與6個(gè)葉片表型性狀、1個(gè)針刺性狀和 10個(gè)果實(shí)性狀相關(guān)的235個(gè)QTL位點(diǎn)；孫磊[21]基于群體基因組重測(cè)序，開發(fā)大量SNP位點(diǎn)，構(gòu)建了總圖距為1 442.638 cM，平均遺傳距離為0.928 cM的葡萄高密度遺傳圖譜，成功定位到與葡萄果實(shí)顏色和花色苷合成調(diào)控相關(guān)的10個(gè)QTL位點(diǎn)。本研究利用開發(fā)的SNP標(biāo)記，成功構(gòu)建了總圖距為2 873.39 cM，平均遺傳距離為0.36 cM的遺傳圖譜，與之前[1]構(gòu)建的遺傳圖譜相比，我們構(gòu)建的遺傳圖譜密度高，平均遺傳距離更小，可用于龍眼單果質(zhì)量等重要數(shù)量性狀精細(xì)定位、圖位克隆以及功能基因挖掘等。