王梅瑛

（青海省海西州中心血站 質管科，青海 海西 817099）

0 引言

核酸檢測方法具有比較好的靈敏性，能夠將病毒盡快檢出，在血液檢測工作中被推廣使用[1-2]。下文探索溶血、脂肪血和保存條件對于核酸測定結果所形成的影響狀況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月-2020年3月血清學HBsAg、抗-HCV、抗-HIV測定結果都是陰性和血液相關病毒的核酸測定結果都是陰性的血漿標本歸入項目指標分析樣本資料。

1.2 方法

針對全部標本采集核酸HCV-RNA測定結果是陽性的血漿，制作12～30倍檢出限濃度的對應核酸HCVRNA標本，收集血清學測定結果、血液相關病毒的核酸測定結果均為陰性的嚴重乳糜血漿標本以及紅細胞懸液標本。

將以上紅細胞懸液標本置于-60℃制備全溶血樣本，針對全溶血標本予以倍比稀釋處理得到不同血紅蛋白指標的溶血標本，試驗1A組血紅蛋白指標是8.00g/L，試驗1B組血紅蛋白指標是5.00g/L，試驗3B組血紅蛋白指標是3.00g/L，各個組別分別有5份標本，血紅蛋白指標檢測選用氰化高鐵血紅蛋白測定方式，運用全自動細胞分析儀實施測定。

將以上嚴重乳糜血漿標本用作脂肪血標本，針對脂肪血標本添加予以倍比稀釋處理得到不同甘油三酯指標的脂肪血標本，試驗2A組甘油三酯指標是7.93mmol/L，試驗2B組甘油三酯指標是3.80mmol/L，各個組別分別有5份標本，甘油三酯指標檢測選用甘油磷酸氧化酶測定方式，運用全自動生化分析儀實施測定。

將以上12～30倍檢出限濃度的對應核酸HCV RNA標本分別放于4℃溫度下存儲72h、4周及放于-20℃以下溫度下存儲72h、4周，分別用作試驗3A組、試驗3B組、試驗3C組、試驗3D組，各個組別分別有5份標本。

核酸HCV RNA指標選用全自動核酸提取以及擴增測定平臺予以檢測。

1.3 觀察指標

評定血紅蛋白指標、甘油三酯指標、存儲溫度、存儲時長對核酸檢測情況的干擾效果。

1.4 評定標準

核酸HCV-RNA陰性：標本未檢出Ct值；核酸HCV-RNA陽性：標本檢出Ct值[3]。

1.5 統(tǒng)計學分析

Ct值實行t檢驗，指標運用SPSS 23.0開展測定，P＜0.05，各項驗證結果顯示較大區(qū)別情況。

2 結果

2.1 血紅蛋白指標對核酸檢測情況的干擾效果

數值指標資料檢測后，試驗1A組Ct值對比于參照組涉及項目結果減小組間對比，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），試驗1B組、試驗1C組Ct值對比于參照組涉及項目結果差距不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 血紅蛋白指標對核酸檢測情況的干擾效果

2.2 甘油三酯指標對核酸檢測情況的干擾效果

數值指標資料檢測后，試驗2A組、試驗2B組Ct值對比于參照組涉及項目結果差距不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 甘油三酯指標對核酸檢測情況的干擾效果

2.3 存儲溫度、存儲時長對核酸檢測情況的干擾效果

數值指標資料檢測后，試驗3B組Ct值對比于參照組涉及項目結果加大組間對比，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），試驗3A組、試驗3C組、試驗3D組Ct值對比于參照組涉及項目結果差距不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 存儲溫度、存儲時長對核酸檢測情況的干擾效果

3 討論

當前，核酸檢測方式在血液病毒檢測中使用較為廣泛。不過，核酸檢測結果受到很多因素的影響，需要引起注意[4]。血液標本的收集、處置、存儲等不適宜，可能促使病毒核酸出現(xiàn)降解現(xiàn)象，進而影響核酸檢測結果[5]。

現(xiàn)階段臨床針對血液制品的檢測一般利用核酸檢測技術，能夠實現(xiàn)病毒變異檢測。同時，針對隱匿性感染有效檢出。實際工作當中，血液標本會受到溶血、脂肪血、保存溫度等不同因素影響，會引發(fā)核酸檢測結果產生誤差。核酸檢測技術為1995年自歐洲血漿生產公司引入，逐步在血制品行業(yè)當中大力推廣。近幾年，將核酸檢測技術引入到采供血機構當中實施血液篩查。2015年底，全國在供血機構逐步開展核酸檢測技術篩查工作，采供血機構篩查逐步引入核酸檢測技術的原因為核酸檢測技術具備靈敏度高的特點，能夠實現(xiàn)病毒窗口期縮短。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過核酸檢測技術能夠將乙肝病毒、艾滋病病毒、丙肝病毒的感染窗口期有效縮短。同時，采用核酸檢測技術能夠對于隱匿性感染及血清學漏檢的血液有效檢測。核酸檢測應用在血液篩查中較為普遍，臨床研究報道發(fā)現(xiàn)，美國從1999年利用核酸檢測技術，艾滋病的殘余風險低于百萬分之一，乙肝病毒的殘余風險逐步下降到1/20萬。日本應用的采供血機構應用時間較早，并能夠在血液篩查工作中有效實施。臨床報道發(fā)現(xiàn)，日本乙肝病毒核酸陽性率一般為1/5.2萬，丙肝病毒核酸檢測率約為1/34.8萬。艾滋病病毒為1/266.9萬，我國采供血機構已經將無償獻血者血液全部實施核酸檢測，大部分核酸檢測篩查血清學陽性標本經過鑒定能夠確定為HBV-DNA陽性，部分為采供血機構利用核酸檢測篩查，其中檢出能夠處于窗口期感染的艾滋病病毒及丙肝病毒核酸血液標本。

傳統(tǒng)血清學篩查能夠最大程度地幫助患者降低經輸血、血液制品引發(fā)的感染病毒風險，但尚未全部消除?，F(xiàn)階段，臨床針對血液制品當中的可傳染性病毒篩查明顯具備更高標準要求，能夠全面推動核酸檢測技術發(fā)展，然而，實際核酸檢測技術工作中，許多標本因素仍然能夠對核酸檢測技術產生一定影響，例如脂肪血、溶血等。如紅細胞產生破碎后其中會大量釋放Hb，其中核酸檢測試劑屬于抑制物，當中的細胞破碎后RNA酶會逐步釋放RNA，會對核酸檢測技術的靈敏度產生較大影響。日常工作中的標本溶血存在較多原因，其中部分標本留取過程中的外部機械會產生較多作用，使血液當中的紅細胞破裂，如其中的標本留取不暢、留取速度過快等原因。部分劇烈震蕩同樣會產生標本溶血，血液標本會在運輸過程中發(fā)生顛簸。

標本溶血當中具備一個不可忽視的因素即為脂肪血。伴隨臨床醫(yī)療技術不斷發(fā)展，人們生活水平顯著提高，由于攝入油脂類過多會導致采供血機構中少部分無償捐獻的血液進行分離后其中的上層血漿并非透亮，血漿外觀會表現(xiàn)出渾濁乳白色。臨床報道顯示，高脂血標本能夠通過熒光屏蔽、吸收對于檢測結果產生干擾，血脂因素會引發(fā)熒光淬滅，引發(fā)患者產生熒光信號強度降低。同時，利用的不同檢測試劑、系統(tǒng)中的實驗室檢測條件會導致檢測結果略有不同，因此，脂肪血因素是否會對于患者的實驗室核酸檢測技術造成影響應進一步驗證。

檢測過程中，標本的質量（例如，凝血標本、溶血標本、運輸、保存條件等）會對檢測結果準確性產生直接影響。國外臨床研究報道發(fā)現(xiàn)，利用煮沸裂解法實施標準處理，對于DNA純化法出得的濃度低于兩個數量級，同時，標本檢測過程中的核酸降解同樣為影響核酸檢測結果的重要因素。例如，細胞破碎過程中，其細胞內的核糖核酸酶會大量釋放RNA酶，降解對核酸試劑檢測靈敏度產生影響，進而構成原始HCV、HIV，主要為雙股正鏈RNA及單股正鏈RNA，容易受到RNA降解酶的影響。對標本的保存研究中發(fā)現(xiàn)，標本的不良保存會引發(fā)病毒核酸檢測陽性率降低，針對標本實施定量分析，發(fā)現(xiàn)HCV-RNA可在4℃下保存五周以上，如標本處理、采集不當會引發(fā)病毒降解，對核酸檢測技術的靈敏度產生影響，不利于輸血安全。因此，核酸試劑廠家說明書中提出標本處理的有效指導意見，每個實驗室標本在運輸、采集及儲存過程中條件存在差異，獲得的標本質量存在不同。因此，核酸檢測技術的標本正確采集和保存處理關鍵環(huán)節(jié)可確保該地區(qū)的高質量、高效實現(xiàn)核酸檢測技術工作指導，能夠降低HBV、HIV、HCV經血液傳播風險。因此，在選擇適宜的紅細胞制備溶血樣本考量標準主要為血清學檢測陰性、上清外觀透亮、病毒核酸檢測為陰性；高濃度脂肪血標本主要考量的標準為外觀透亮、存在單一核酸病毒陽性、病毒濃度適宜。

這次調查所得指標樣本內容中，血紅蛋白指標8.00g/L的溶血標本Ct值降低，而血紅蛋白指標是5.00g/L、3.00g/L的溶血標本Ct值無明顯改變。血紅蛋白能夠影響Taq酶的生物活性，對聚合酶鏈式反應檢測結果帶來干擾。本文表明，甘油三酯指標是7.93mmol/L、3.80mmol/L的脂肪血標本Ct值無明顯改變[6]。高濃度甘油三酯對核酸檢測結果無顯著影響，故高血脂標本原則上能夠接收。該文得到的指標內容顯示，4℃溫度下存儲4周的標本Ct值升高，而4℃溫度下存儲72h及-20℃以下溫度下存儲72h、4周的標本Ct值無明顯改變。實施核酸檢測時需收集血液72h內盡早予以測定，規(guī)避核酸降解，若難以盡快檢測，需將血漿存儲于-20℃以下溫度暫時保存[7-8]。

綜上所述，溶血、脂肪血、不同保存條件都有可能會影響核酸測定結果，建議溶血標本中血紅蛋白指標在8.00g/L以上則需重新采集標本，脂肪血標本中甘油三酯指標需維持7.93mmol/L以下才可接收，采集標本72h內盡快實行核酸測定，針對不能盡快送去核酸檢測的標本需分離血漿放于-20℃以下溫度下存儲。