張寧 ，謝姝鈺 ，常國欣，陳延 ，王巖，張靜，邱宏

（1.中國科學院上海藥物研究所糖類藥物研究中心，上海 201203；2.中國科學院大學藥學院，北京100049；3.南京中醫(yī)藥大學新中藥學院，江蘇 南京210023；4.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州510006；5.華南理工大學化學與化工學院，廣東省功能分子工程重點實驗室，廣東 廣州510640；6. 廣州中醫(yī)藥大學青蒿研究中心，廣東 廣州510405）

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）已被證實可以介導細胞間短程和遠程通訊[1-2]，參與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病等疾病的發(fā)生、發(fā)展，具有作為疾病診斷標志物、治療藥物、藥物靶標和藥物載體的潛能[3-6]。細胞可以通過多種生成途徑生成和釋放EVs，但囊泡一經(jīng)釋放，其生成途徑便難于追蹤[7]。目前，尚無有效的分離方法和明確的分子標志物可以區(qū)分不同生成途徑產(chǎn)生的囊泡，這使得難以比較和重復不同實驗室報道的EVs研究結果，也難以確定不同生成途徑形成的囊泡功能差異[8-9]。此外，EVs的命名尚無統(tǒng)一標準[9]。腫瘤EVs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中主要起兩方面的作用：一是促進腫瘤的生長；二是幫助建立促腫瘤轉移微環(huán)境，促進腫瘤轉移[10-11]。哺乳動物EVs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及診療方面的應用研究最為深入，細菌等微生物囊泡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸受到關注[10-11]。EVs作為治療藥物和藥物輸送載體，目前面臨最大的問題是如何重復大量的獲得[3]。食用植物和中草藥來源的囊泡可以通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，這些囊泡相對容易重復獲得，而且安全，它們的抗腫瘤作用機制和藥物遞送作用因而受到極大關注[12-13]。本文簡介哺乳動物EVs、細菌EVs和植物EVs的生成、定義、特征、制備、表征、攝取和體內分布與代謝，重點綜述這些囊泡在腫瘤靶向治療中的作用和應用及其工程化改造策略的研究進展、存在問題，展望EVs在腫瘤靶向治療中的應用前景。

1 細胞外囊泡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

1.1 細胞外囊泡的生成、定義和特征

EVs是一種由細胞產(chǎn)生的納米級顆粒，介導細胞之間的短程與長程通訊，參與不同生理和病理過程的調控[14]。1946年，Chargaff等[15]研究凝血時發(fā)現(xiàn)，高速離心所得的粒子樣沉淀物可以縮短血漿的凝血時間，首次觀察到了具有生物活性的EVs。Wolf[16]在1967年首次用電鏡表征了這些粒子樣沉淀的形態(tài)，并將其定義為“血小板塵?！?。隨著對EVs的了解逐漸深入，研究者根據(jù)EVs生成途徑的不同將EVs分為外泌體（exosome）、微囊泡（microvesicle）和凋亡小體（apoptotic body）。在細胞中，早期內體（early endosome）向內凹陷，包裹胞質溶膠（cytosol）中的許多物質，形成腔內囊泡（intraluminal vesicle），這時早期內體發(fā)展為晚期內體（late endosome）即多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）， 當 MVBs向 細胞質膜移動并與之融合時，釋放出的囊泡為外泌體，其粒徑一般為30 ~ 200 nm[17]；細胞質膜向外出芽直接從細胞質膜脫落產(chǎn)生的囊泡稱為微囊泡，其粒徑一般為100 ~ 1 000 nm[18]。與外泌體和微囊泡不同，凋亡小體是在細胞凋亡過程中形成，粒徑一般在1 000 ~ 5 000 nm[19]。目前的技術手段無法分離不同生成途徑產(chǎn)生的囊泡[20]。根據(jù)2018年國際細胞外囊泡協(xié)會的指南，通常將EVs按粒徑大小進行分類[21]，200 nm及以下的囊泡稱為小細胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs），是目前研究的主要囊泡類型；大于200 nm的囊泡稱為中/大細胞外囊泡（見圖1）。EVs主要由脂質、蛋白質、核酸和小分子代謝物組成。雖然不同來源的EVs蛋白質組成有所差異，但是哺乳動物來源的囊泡一般均表達腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101，TSG101），凋亡連接基因2作用蛋白X（apoptosis linked gene 2 interacting protein X，ALIX），四次跨膜蛋白（tetraspanin）家族CD9、CD63和CD81等蛋白質，這些蛋白質可作為EVs的生物化學特征標志物[7,22]。EVs也表達ATP酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）等多種酶、主要組織相容復合物（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ和 MHC-Ⅱ及熱休克蛋白[7,22]。

1.2 細胞外囊泡的分離、純化和表征

EVs的分離純化技術主要包括超速離心法（ultracentrifugation，UC）[23]、聚合物沉淀法（polymer precipitation）[24]、 切向流過濾 法（tangential flow filtration，TFF）[25]、非對稱場流（asymmetric flow field fractionation，AF4）[26]、尺寸凝膠排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）[27]、免疫親和層析（immunoaffinity chromatography）[28]。一般 UC所得的囊泡純度要高于SEC所得的囊泡純度，但是后者的囊泡產(chǎn)量更高[29]。TFF可以處理大量樣品，而且所得樣品的純度與UC所得樣品的純度接近?？傊鲜龇椒ň幸欢ň窒扌?，雖然可以分離出具有某些特性的EVs群體，但很難實現(xiàn)外泌體和微囊泡之間的完全分離。因此，EVs分離純化的具體條件在研究EVs的功能時非常重要。為方便不同實驗室結果的比較和促進EVs研究的標準化，目前有研究者提出以EV-TRACK這一系統(tǒng)報告EVs的分離純化具體參數(shù)和特征[8,30]。

1.3 細胞外囊泡的轉運、攝取和體內分布與代謝

EVs的釋放、轉運、攝取和體內生物分布與代謝是研究其生物學功能的基礎。在進行這些研究時，通常使用熒光分子或放射性同位素標記EVs[31]。EVs被供體細胞釋放后轉運至靶細胞，可以被靶細胞經(jīng)由網(wǎng)格蛋白[32]、小窖蛋白或脂筏介導的胞吞[33]，吞噬[34]和胞飲（巨胞飲、微胞飲等）等不同內吞機制攝取[35]；也可與細胞膜融合將其內含物釋放至靶細胞的胞質溶膠[36]。EVs進入細胞的途徑可以通過使用各種內吞途徑的特異性抑制劑或遺傳學方法確定[37]。EVs內吞一般通過其表面分子與靶細胞受體相互作用實現(xiàn)，如囊泡表面的末端唾液酸和受體細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，均為內吞的分子媒介[38-39]。EVs與靶細胞質膜的融合也需要通過囊泡與質膜上的配體-受體相互作用實現(xiàn)。比如，單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生的囊泡通過囊泡表面的P-選擇素糖蛋白配體，與血小板表面的P-選擇素結合啟動囊泡與細胞的融合[36]。EVs在被靶細胞攝取之后，多數(shù)進入內體和（或）溶酶體釋放其內含物，但這與細胞內的pH和脂質種類有關[40-41]。內體和（或）溶酶體pH的中性化和膽固醇增加能夠抑制囊泡與內體質膜的融合和內含物的釋放[40-41]。受體細胞攝取EVs的效率較低，1 h內自發(fā)性攝取率僅為1%，但攝取的囊泡30%會被釋放到胞質溶膠[42]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，EVs在內吞進入內體之后會通過晚期內體與核膜融合，將內含物釋放至核漿中，這一過程由RAB7、囊泡相關膜蛋白相關蛋白A（vesicular associated membrane protein associated protein，VAP-A）和氧化甾醇結合蛋白相關蛋白3（oxysterol binding protein related protein 3，ORP3）形成的復合物介導[43]。美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的藥物伊曲康唑（itraconzale）和小分子PRR851可以抑制這一過程（見圖1）[44]。

圖1 細胞外囊泡的生成、釋放、轉運、攝取和裝載貨物的釋放Figure1 Biogenesis, release, trafficking, uptake and cargo release of extracellular vesicles

EVs在體內的代謝分為2個過程：快速的分布期（distribution phase）與較長的肝和腎清除期（elimination phase）[45]。研究顯示，EVs經(jīng)小鼠尾靜脈注射24 h后在肝、脾、肺和胃腸道中潴留最多，EVs的供體細胞類型和給藥途徑的改變均會影響EVs的生物分布[45]。Smyth等[46]研究發(fā)現(xiàn)，標記的EVs、人工合成脂質體與由EVs衍生的脂質體體內生物分布和清除率類似。未進入受體細胞的EVs可以通過多種機制被降解清除，比如，巨噬細胞等免疫細胞和內皮細胞通過吞噬作用，攝取循環(huán)血液中的腫瘤EVs并將其降解[47-48]。生物來源或人工合成的EVs在肝臟中很容易被迅速清除，限制了囊泡在靶細胞、靶組織或靶器官中的積累，而聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾或使用肝攝取抑制劑可增加囊泡在體內的滯留時間[49]。EVs表達CD47和CD24等吞噬抑制分子，從而避免被吞噬降解[50]。表面表達CD47的受體信號調節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）的 EVs，可逃脫巨噬細胞的吞噬，從而提高生物穩(wěn)定性和在體內的循環(huán)時間[51]。

1.4 細胞外囊泡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是正常細胞經(jīng)歷一系列的轉化，突破正常的生存和增殖限制，變成腫瘤細胞并從原發(fā)部位轉移擴散的結果。腫瘤細胞的生存、生長和擴散依賴于腫瘤特征性功能的獲得，功能包括細胞基因組的不穩(wěn)定、促腫瘤炎癥反應誘導、非突變性的表觀遺傳重編程、死亡抵制、細胞增殖信號的持續(xù)維持、腫瘤抑制基因逃避、細胞復制化永生賦能、血管生成誘導和（或）血管的可及、侵襲與轉移激活、細胞代謝重編程和免疫監(jiān)控逃逸等[52-53]（見圖2）。除了腫瘤細胞自身的改變，腫瘤細胞這些功能的獲得也需要通過與腫瘤微環(huán)境的不同細胞如內皮細胞、周細胞（pericyte）、腫瘤浸潤免疫細胞和腫瘤相關成纖維細胞相互通訊以相互賦能和相互馴化[52-53]。

圖2 腫瘤的特征性功能Figure 2 Functional hallmarks of cancer

腫瘤細胞與其所處微環(huán)境細胞的相互賦能和相互馴化可以通過EVs的短程信息交流實現(xiàn)。2007年，L?tvall課題組研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肥大細胞系MC/9、原代骨髓肥大細胞和人源肥大細胞系HMC-1產(chǎn)生的小EVs（文中以外泌體exosome出現(xiàn)）中含有信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）等小核酸，但不含DNA；這些mRNA和miRNA在這些肥大細胞之間轉運，而且供體細胞的mRNA運送至受體細胞之后能夠被翻譯成蛋白質[54]。小EVs作為細胞間信息交流介質這一重要現(xiàn)象在不同的生物系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)。比如，2010年3個不同的課題組分別發(fā)現(xiàn)，miRNA可以通過小EVs運送至免疫細胞[55]、內皮細胞[56]和腫瘤細胞[57]；2008年表皮生長因子受體變體Ⅲ（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvⅢ）也被發(fā)現(xiàn)可以被分選進入膠質瘤細胞產(chǎn)生的囊泡（文中稱作微囊泡microvesicle），而且可以經(jīng)由囊泡在不同細胞之間傳送[57-58]；2012年，Wnt蛋白也被報道可以通過小EVs實現(xiàn)遠距離轉運[59]；2015年van Rheenen課題組以具有強轉移能力的MDA-MB-231和弱轉移能力的T47D移植瘤為模型發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231產(chǎn)生的小EVs（以前稱作外泌體exosome）能轉移至T47D細胞中，并改變T47D細胞行為，使其轉移能力增強[60]；同年Kalluri課題組研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤細胞產(chǎn)生的小EVs中均含有磷脂酰肌醇錨定蛋白聚糖glypican-1，通過原位移植瘤和轉基因小鼠胰腺瘤（Ptf1aCre/+LSL-KRasG12D/+TgfbrL/L，PKT）模型證實，小EVs中glypican-1可以作為胰腺癌的生物標志物，可區(qū)分胰腺癌與良性胰腺疾病和胰腺癌前體病變；而且作為標志物，glypican-1靈敏度顯著高于常用的胰腺癌生物標志物CA19-9[61]。小EVs是腫瘤細胞和其所處環(huán)境不同細胞相互賦能和相互馴化以獲得腫瘤特征性功能的物質媒介，也可以作為腫瘤診斷和預后的生物標志物[10,62]。

腫瘤細胞可以通過分泌小EVs抑制腫瘤免疫反應。腫瘤細胞能夠分泌表達程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）的小 EVs，通過和CD8+T細胞表面程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）結合，抑制CD8+T細胞的腫瘤細胞殺傷作用[63]。不同的腫瘤細胞分泌PD-L1的能力不一樣，前列腺癌細胞PC-3和DU145要顯著強于人源黑色素瘤細胞SK-MEL-28和前列腺癌細胞LNCaP，敲除PD-L1或小EVs生成的調控蛋白基因RAB27a均可抑制鼠源前列腺腫瘤細胞TRAMP-C2和結腸癌細胞WC38移植瘤的生長[63]。血漿和血漿來源的小EVs中的PD-L1水平，黑色素瘤患者要顯著高于健康人，而且接種黑色素瘤細胞的小鼠也要高于不接種黑色素瘤細胞的正常小鼠[64]。干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）處理能夠增加囊泡中PD-L1的表達；血漿和血漿來源的小EVs中的PD-L1水平，對PD-1抗體治療不響應的黑色素瘤患者高于對治療有響應的患者[64]。

腫瘤侵襲和轉移依賴在轉移目標位點建立促腫瘤轉移的微環(huán)境，原發(fā)部位的腫瘤細胞通過EVs轉送物質馴化轉移目標部位的內皮細胞、周細胞、免疫細胞和成纖維細胞等正常細胞，使這些細胞獲得腫瘤特征性功能。EVs的這一遠程信息交流作用已經(jīng)有廣泛研究。黑色素瘤細胞分泌的小EVs通過誘導骨髓前體細胞高表達MNNG HOS轉化基因蛋白（MNNG HOS transforming gene，MET），將其馴化成促進血管生成和促進黑色素瘤細胞轉移的表型CD45-c-KITlow/+TIE2+[65]。腫瘤分泌的小EVs可以促進血管生成相關基因的表達，促進血管/淋巴管內皮細胞生長、激活生長信號，促進腫瘤細胞與內皮細胞的黏附[66]。腫瘤分泌的小EVs也可以破壞血管屏障，促進腫瘤轉移，比如乳腺癌細胞小EVs攜帶的miR105通過抑制血管內皮細胞黏附分子ZO-1的表達，從而破環(huán)血管屏障，促進乳腺癌細胞的轉移[67]。由乳腺癌和肺癌患者的腦轉移灶活組織分泌產(chǎn)生的EVs，表達Wnt相關蛋白-細胞遷移誘導和透明質酸結合蛋白（cell migration-inducing and hyaluronan binding protein，CEMIP），該蛋白可以在腦組織幫助建立促炎的血管微環(huán)境，促進腫瘤細胞的腦轉移[68]。腫瘤細胞的EVs也可招募促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的巨噬細胞，在轉移靶組織建立促轉移微環(huán)境，比如胰腺癌EVs能夠表達巨噬細胞遷移抑制因子（migratory inhibitory factor，MIF），招募肝組織特異性巨噬細胞樣細胞Kupffer細胞，促進轉化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）的分泌，進而促使肝星狀細胞分泌纖維黏連蛋白（fibronectin），在肝建立促纖維化微環(huán)境，將巨噬細胞和中性粒細胞限制在肝，建立促腫瘤肝轉移的微環(huán)境[69]?；熞部梢源龠M腫瘤細胞分泌促轉移的EVs，通過建立促轉移微環(huán)境來促進腫瘤轉移，比如采用 10 mg · Kg-1紫杉醇（paclitaxel，PTX）治療小鼠乳腺腫瘤病毒-多瘤病毒中等T抗原（mouse mammary tumor virus-polyoma virus middle T antigen，MMTV-PyMT）自發(fā)性小鼠乳腺癌和4T1乳腺癌細胞小鼠移植瘤，結果發(fā)現(xiàn)PTX可以通過促進腫瘤細胞分泌含有膜聯(lián)蛋白A6（annexin A6，ANXA6）的EVs，從而促進肺部內皮細胞的激活，誘導C-C基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）的分泌和Ly6C+CCR2+單核細胞的擴增，促進促腫瘤肺轉移灶的建立和腫瘤轉移；接受PTX和阿霉素（doxorubicin，DOX）治療的乳腺癌患者血漿來源的囊泡中ANXA6表達也顯著增加[70]。腫瘤EVs上述作用的發(fā)揮需要這些囊泡能夠被特異性地轉運至相應的靶組織，這些腫瘤EVs表達的整合素分子是決定囊泡組織趨向性的關鍵分子，整合素 α6β4和 α6β1介導肺轉移，而 αvβ5介導腦轉移[71]。

2 不同來源細胞外囊泡在腫瘤靶向治療中的作用及應用

EVs屬于納米粒，納米粒可以通過高滲透長滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）實現(xiàn)腫瘤組織的被動靶向[72]；同時也可以通過在EVs表面裝載靶向性分子實現(xiàn)主動靶向。下文就哺乳動物產(chǎn)生的EVs、細菌囊泡和植物囊泡在腫瘤靶向治療中的作用及應用做一介紹。

2.1 哺乳動物細胞外囊泡在腫瘤靶向治療中的作用與應用

腫瘤細胞和其所處微環(huán)境的其他細胞可相互賦能和相互馴化，因此無論是腫瘤細胞來源的EVs還是非腫瘤細胞來源的EVs均可促進或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在腫瘤治療中，需要充分發(fā)揮EVs對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的抑制作用，通過工程化修飾提高其腫瘤治療的靶向性、有效性和安全性。多項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血液中小EVs水平較健康人群高[73-75]，小EVs水平越高，患者的預后越差；干預EVs的生成、釋放與攝取可以作為腫瘤靶向治療的新策略[76]。

哺乳動物EVs的腫瘤治療作用研究源于Raposo等[77]發(fā)現(xiàn)，B細胞產(chǎn)生的EVs含有與抗原多肽分子結合的MHC-Ⅱ，能誘導抗原特異性、MHC-Ⅱ限制性的T細胞效應。這一發(fā)現(xiàn)催生了基于EVs的腫瘤免疫靶向治療研究。樹突狀細胞是機體內主要的一種抗原呈遞細胞，其產(chǎn)生的EVs表達MHC分子，同時也表達T細胞共刺激因子。腫瘤抗原處理的樹突狀細胞分泌的EVs能夠誘導殺傷性T細胞殺死腫瘤細胞[78]。天然的樹突狀EVs可以通過工程化改造而提高療效和靶向性。研究顯示，利用小鼠未成熟樹突狀細胞（imature dendritic cells，imDCs）獲得表面表達內化RGD（internalizing Arg-Gly-Glu，iRGD）肽（序列為CRGDK/RGPD/EC）的囊泡，這些囊泡可靶向表達整合素αvβ3的癌細胞[79]。由抗原致敏的樹突狀細胞釋放的小EVs可以增強癌癥的免疫應答[80]。其他免疫細胞如巨噬細胞和自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）來源的囊泡也可以激活免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤生長[81]。最近研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞來源的小EVs也可以通過誘導HGC27細胞凋亡，抑制胃癌細胞HGC27裸鼠移植瘤的生長[82]。

除了免疫細胞之外，其他非腫瘤來源的EVs自身或通過工程化改造也可以抑制腫瘤的生長。KRasG12DsiRNA/shRNA人源包皮成纖維細胞（human foreskin fibroblast）產(chǎn)生的小EVs能夠有效地抑制胰腺癌細胞的生長；因表達“別吃我”的信號分子CD47，這些囊泡可以逃避血液中單核細胞以巨胞飲形式內吞清除，增長體內循環(huán)時間[83]。骨髓來源的間充質干細胞可生產(chǎn)包載KRasG12DsiRNA的GMP級囊泡，這些囊泡能夠靶向胰腺癌細胞的小鼠移植瘤，抑制腫瘤的生長[84]。

鑒于帶有與其親代細胞一樣的抗原，腫瘤細胞EVs可以作為疫苗，通過激活免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長。但腫瘤細胞EVs除了包含腫瘤抗原外，通常還含有特定的免疫調節(jié)蛋白如PD-L1[85]、Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）[86-88]、腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）[88]和 TGF-β[89]，這些蛋白質可以抑制機體的免疫應答反應，可能削弱腫瘤細胞EVs的免疫力，因此腫瘤細胞EVs不宜直接作為疫苗。但可以將腫瘤細胞EVs與樹突狀細胞等免疫呈遞細胞孵育，然后以激活的免疫呈遞細胞用于免疫治療，比如在體外經(jīng)腫瘤細胞EVs處理的樹突狀細胞，在體內能誘導CD8+T細胞依賴的抗腫瘤作用[90]。目前，腫瘤EVs在腫瘤治療中多數(shù)需要經(jīng)過工程化改造以增強其功能，比如在囊泡中加入促凋亡的分子FasL[91]或TRAIL[92-93]；或加入具有免疫調節(jié)作用的細胞因子或化學趨向因子IL-18（interleukin-18，IL-18）和IL-2等[94-95]；腫瘤EVs也常作為化療藥物的載體，以增強腫瘤抑制作用，降低化療藥物毒性，增強藥物在腫瘤組織的滲透性和滯留時間[96-98]。

2.2 細菌囊泡在腫瘤靶向治療中的作用與應用

早在1965年，營養(yǎng)缺陷型的大腸埃希菌（E.coli）就被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生非細胞溶解所形成的球狀膜泡[99]，隨后在霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中也發(fā)現(xiàn)了細菌外囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）[100]。大腸埃希菌和霍亂弧菌均為革蘭陰性菌，革蘭陽性菌很長一段時間被認為不能產(chǎn)生囊泡，直到2009年才從金黃色葡萄球菌（Streptococcus aureus）和枯草牙孢桿菌（Bacillus subtilis）中分離得到囊泡[101]。OMVs是細菌在生長過程中外膜向外突起形成的球形納米囊泡，粒徑大小為10 ~ 300 nm，主要由磷脂、蛋白質、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和細胞周質等組成。雖然OMVs在60多年前已被發(fā)現(xiàn)，但它們一直被認為是細菌的代謝垃圾；后來臨床研究發(fā)現(xiàn)，急性腦膜炎患者腦脊液中也存在OMVs[102]。研究發(fā)現(xiàn)，細菌還可產(chǎn)生外內膜囊泡（outer inner membrane vesicles，OIMVs）、細胞質囊泡（cytoplasmic membrane vesicles，CMVs）和管狀膜樣結構（tubeshaped membranous structure，TSMSs）[103-104]。最近研究發(fā)現(xiàn)，人體循環(huán)血液中也有細菌來源的EVs，這些囊泡可能是不同組織定植細菌介導跨器官信息交流的重要分子媒介[105]。

2.2.1 細菌囊泡的生成與制備 細菌囊泡主要通過膜起泡（membrane blebbing）和內溶素引起的細胞死亡（endolysin-triggered cell death）2種途徑生成[103]。鐵限制、假單胞菌奎諾酮信號（Pseudomonaquinolone signal，PQS）、疏水性分子和抗生素可以促進外膜起泡；而抗生素、DNA損害物質和肽聚糖（peptidoglycan，PG）降解酶則通過引起驟增性細胞裂解（explosive cell lysis）或引發(fā)出泡性細胞死亡，從而促進囊泡產(chǎn)生[103]（見圖3）。LPS、脂蛋白（lipoprotein，Lpp）和磷脂均參與了囊泡生成的調控，其中LPS的電荷和結構主要與OMVs的生成和蛋白質組成有關。LPS是革蘭陰性細菌的基本結構單元，也是細胞表面發(fā)現(xiàn)的含量最豐富的抗原，在大腸埃希菌和沙門氏菌屬（Salmonella）的外膜，LPS占比高達75%。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）在過表達具有催化活性的脂質A糖鏈3-O-位脫?；窹agL（PhoP/PhoQ induced lipase）后，OMVs生產(chǎn)增多，產(chǎn)量是其野生型菌株的4倍[106]；但另一項報道發(fā)現(xiàn)敲除pagL后，囊泡生成沒有顯著改變，分別敲除pagC和pagP后，囊泡生成分別減少至原來的13.9%和23.0%[107]。在大腸埃希菌中，負責外膜外側磷脂聚集的新脂蛋白Ⅰ（new lipoproteinⅠ，NlpⅠ）和外膜脂非對稱維持蛋白E（maintenance of OM lipid asymmetry E，mlaE） 同時被敲除（ΔmlaEΔNlpⅠ）后，OMVs的生成較野生菌株高約30倍[108]。囊泡釋放的外膜部位幾乎沒有脂蛋白鍵，而附著于肽聚糖層的脂蛋白數(shù)量減少會促使細菌OMVs形成[109]。細菌鞭毛蛋白也能調控OMVs釋放，鞭毛合成缺失的細胞OMVs生成減少[110]。

圖3 細菌囊泡及其生成機制Figure 3 Bacterial EVs and the underlying mechanism of biogenesis

細菌EVs一般通過結合差速離心、過濾和梯度離心分離純化，值得注意的是，離心參數(shù)和過濾濾膜孔徑均可影響其純化效果[111]。綜合運用不同原理的分離純化方法，比如采用超濾、分子排阻色譜和密度梯度離心相結合的方法進行分離富集可以增加細菌EVs的產(chǎn)量并提高純度[112]。

2.2.2 細菌囊泡介導的腫瘤治療 腸道菌等細菌能夠促進或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細菌囊泡在這一過程中起重要作用，但目前研究較少[113-114]。細菌囊泡可以促進細菌生存，運送細菌毒素、抗生素耐受蛋白和信號分子等物質并介導跨界信息交流[115]；細菌囊泡遞送毒素的同時也會激活宿主免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生強烈的炎癥反應，一方面可以促使腫瘤的免疫清除，另一方面也會對靶組織產(chǎn)生免疫毒性。

大腸埃希菌K-12 W3110E. coli是廣泛用于細菌囊泡研究的菌株。研究發(fā)現(xiàn)，該大腸埃希菌脂質-A合成酶敲除株ΔmsbBK-12 W3110E. coli產(chǎn)生的囊泡能夠選擇性地靶向小鼠結腸癌CT-26移植瘤，并在瘤組織潴留；這些囊泡可刺激T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，激活機體先天免疫系統(tǒng)并抑制腫瘤生長，從腫瘤接種后第7天開始靜脈給藥，每次5 μg，3天1次，給藥4次即可清除結腸腫瘤，更重要的是這些小鼠再次接種腫瘤細胞不能形成移植瘤，提示囊泡治療產(chǎn)生了免疫記憶；該囊泡也能抑制小鼠WC38結腸癌細胞移植瘤的生長、抑制小鼠乳腺癌細胞4T1和黑色素瘤細胞B16BL6的肺轉移[116]。大腸埃希菌K-12 W3110E. coli和腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）的囊泡靜脈給藥，每次5 μg，3天1次，給藥4次也可清除小鼠結腸癌細胞CT-26的移植瘤[116]。革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌及其脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）缺失突變株和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）產(chǎn)生的囊泡也能抑制CT-26移植瘤的生長[116]。細菌囊泡也可以作為免疫佐劑。比如，大腸埃希菌K-12 W3110E. coli囊泡以溶菌素和高pH處理，可降解其中脂質-A，減輕毒性，處理后作為免疫佐劑與黑色素瘤EVs共同免疫黑色素瘤細胞B16F10移植瘤荷瘤小鼠，可以激發(fā)Th-1型T細胞免疫并誘導抗腫瘤EVs IgG抗體產(chǎn)生，殺傷腫瘤細胞，大腸埃希菌囊泡效果比經(jīng)典佐劑要好，而且能夠增強PD-1抗體的療效，實驗過程中也未觀察到系統(tǒng)毒性[117]。大腸埃希菌BL21來源的囊泡能特異性地靶向乳腺癌細胞4T1小鼠移植瘤組織并能夠促使腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞由M2向M1轉化，但是其靜脈注射后容易被抗體依賴的途徑清除，同時也會產(chǎn)生免疫毒性；采用磷酸鈣覆蓋囊泡表面的方法可以克服囊泡靜脈注射給藥引發(fā)的抗體依賴性清除和免疫毒性，增強腫瘤治療效果[118]。

益生菌副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）PC-H1能夠產(chǎn)生粒徑約200 nm的囊泡LpEV，結腸癌細胞能攝取這些囊泡。LpEV在體外可以抑制結腸癌細胞HCT116、SW1116和SW620遷移和侵襲，還可通過激活PDK1/AKT/Bcl2通路誘導結腸癌細胞凋亡。將結腸癌細胞HCT116（1.5h106個細胞）單獨或與LpEV（40 μg）同時接種到BALB/c裸鼠，結果顯示LpEV能顯著抑制結腸癌細胞HCT116小鼠移植瘤生長[119]。

2.3 植物細胞外囊泡在腫瘤靶向治療中的作用與應用

植物EVs的可能來源包括胞外陽性細胞器（exocyst-positive organelle，EXPO） 、多 囊 泡 體（multivesicular body，MVB）[120]、液泡（vacuole）和自噬小體（autophagosome）（見圖4）[121]。來源于非原質體液（anoplastic fluid）的囊泡稱為植物EVs，由組織破碎（tissue rupture）液所得的囊泡稱作植物納米囊泡（plant derived nanovesicles，PDNVs）[122]。不同植物中囊泡的粒徑不同，即使同一植物中也存在不同粒徑的囊泡。擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉片質外體汁液（apoplastic fluid）離心制備囊泡，分別得到直徑為150 nm和10 ~ 17 nm 的杯狀EVs[123]；從本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片質外體汁液中分離提取的囊泡直徑介于30 ~ 220 nm之間，平均為（117f9）nm[124]；而從向日葵（Helianthus annuusL.）種子離心制備所得囊泡直徑在30 ~ 150 nm之間，形狀為杯狀[125]。多組學分析結果發(fā)現(xiàn)，植物來源的囊泡主要含有小核酸、蛋白質、脂質（主要是磷脂酸、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺）和小分子代謝物[126]。在植物中EVs可以在細胞間運輸多種物質，促進植物的生長發(fā)育，參與免疫信號傳遞過程中的蛋白質運輸和特定RNA的選擇性裝載，建立和穩(wěn)固植物細胞與細菌等微生物的共生關系[127]。

圖4 植物細胞外囊泡生成機制Figure 4 Underlying mechanism of plant EVs biogenesis

植物EVs作為一種植物活性成分，本身可以通過多種機制抑制腫瘤的生長；同時也可以作為藥物載體遞送腫瘤治療藥物。植物EVs抑制腫瘤生長可以通過誘導腫瘤細胞凋亡和激活宿主免疫系統(tǒng)等作用實現(xiàn)。

2.3.1 免疫調節(jié)作用 人參（Panax ginsengCA Mey）來源的新型EVs樣納米粒（ginseng derived nanoparticles，GDNPs）能夠顯著促進M2（CD11b+F4/80+CD206+）向M1（CD11b+F4/80+CD86+）表型的極化并產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），導致小鼠黑色素瘤細胞凋亡增加，顯著抑制荷瘤小鼠黑色素瘤的生長，增加腫瘤組織中M1巨噬細胞；GDNPs誘導的巨噬細胞極化很大程度上取決于Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）和髓樣分化抗原88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信號。GDNPs還促進M1巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-12 和 IL-6等炎癥因子[128]；也促進極化的M1巨噬細胞分泌CCL5和CXCL9，誘導T細胞朝腫瘤組織募集，增強PD-1抗體的療效[129]。因此，GDNPs可能作為癌癥免疫治療的一類新型納米藥物。

2.3.2 細胞增殖和凋亡調控作用 采用差速離心和葡萄糖梯度離心所得天冬囊泡（Asparagus cochinchinensisnanovesicles，ACNVs）含有脂質、核酸和蛋白質，能通過誘導細胞凋亡抑制肝癌細胞增殖，而對正常肝細胞的損傷較??；可能因為植物EVs不表達CD47等“別吃我”信號，這些囊泡在體內被快速清除，PEG修飾能夠顯著降低囊泡的清除速率[130]；ACNVs和PEG修飾的ACNVs在200 mg · kg-1劑量下均能顯著抑制HepG2裸鼠移植瘤的生長，但PEG修飾的ACNVs效果優(yōu)于ACNVs，給藥組腫瘤組織中脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）著色顯著高于對照組，說明囊泡主要通過誘導細胞凋亡發(fā)揮作用；與對照組相比，給予PEG修飾的ACNVs的小鼠體質量無明顯變化，而給予未修飾ACNVs的小鼠體質量顯著降低，但ACNVs對心、肝、脾、肺和腎組織均無明顯的急性毒性[130]。

從朝鮮樹參（Dendropanax morbifera）、赤松（Pinus densiflora）、北美香柏（Thuja occidentalis）和日本扁柏（Chamaecyparis obtusa）樹干汁液分離得到了DM-EVs、PD-EVs、TO-EVs和CO-EVs。乳腺癌細胞MDA-MB-231 和MCF7主要通過小窖蛋白介導的內吞作用攝取這些囊泡，而正常乳腺細胞MCF10A則通過網(wǎng)格蛋白和小窖蛋白介導的胞吞途徑、小泡飲和吞噬作用攝取這些囊泡。DM-EVs和PD-EVs對乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231和MCF7、皮膚腫瘤細胞A431均有細胞毒作用，而對正常乳腺細胞MCF10A和正常皮膚細胞HNF的細胞毒作用相對較弱，且DM-EVs作用強于PD-EVs，TO-EVs和COEVs 無顯著作用；DM-EVs和PD-EVs單獨使用作用不如順鉑，但二者聯(lián)用的效果強于順鉑，而且比順鉑具備更好的腫瘤細胞偏好性殺傷作用[131]。

從甜橙（C. sinensis）、苦橙（C. aurantium）、檸檬（C. limon）和葡萄柚（C. paradisi）分離出的微米級（MVs）和納米級囊泡（NVs）可特異性抑制乳腺癌細胞MCF7、人黑色素瘤細胞A375和肺腺癌細胞A549的增殖，對人正常皮膚角質形成細胞HaCat的生長沒有影響；葡萄柚囊泡能夠抑制G0/G1和G2/M細胞周期的轉變，促進細胞周期抑制劑p21的上調，降低Cyclin B1的蛋白表達和G2/M檢查點關鍵調節(jié)因子Cyclin B2的轉錄水平；葡萄柚囊泡還通過激活多聚ADP-核糖聚合酶-1（poly-ADP-Ribose polymerase-1，PARP-1）而引發(fā)A375細胞凋亡，抑制AKT和細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路的傳導，從而降低細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和組織蛋白酶（cathepsins）的表達，進而抑制腫瘤細胞遷移[132]。肺癌、結腸癌和白血病細胞經(jīng)檸檬囊泡（limon derived extracellular vesicles，LDEVs）處理后，促凋亡分子Bad和Bax的mRNA水平增加，而促生存分子如生存素（survivin）和Bcl-xL的表達降低；LDEVs在體內激活TRAIL介導的細胞凋亡，抑制參與血管生成的細胞因子分泌，如血管內皮生長因子-A （vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）、IL-6和IL-8，強烈地抑制腫瘤的生長[133]。LDEVs的抗腫瘤作用部分是通過抑制脂質代謝通路關鍵酶乙酰輔酶 A 羧 化 酶 （acetyl-CoA carboxylase，ACACA）的表達實現(xiàn)；沉默ACACA可以抑制細胞生長和誘導細胞凋亡，該作用是通過抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號傳導和促進Bad介導的細胞凋亡實現(xiàn)；LDEVs只抑制結腸腺瘤細胞SW480、慢性髓系淋巴瘤細胞LAMA84和多發(fā)性骨髓瘤細胞MM1的生長，但不抑制人骨髓基質細胞HS-5的生長，因為LDEVs只抑制這些腫瘤細胞中ACACA 的表達，但不影響HS-5中ACACA的表達[134]。LDEVs以濃度依賴的方式抑制胃癌細胞AGS、BGC-823和SGC-7901的生長，很可能通過誘導ROS生成，上調生長阻滯DNA損傷可誘導蛋白45a（growth arrest and DNA damage inducible alpha，GADD45a）的表達，使胃癌細胞周期阻滯于S期并誘導胃癌細胞凋亡；體內實驗也表明，SGC-7901小鼠移植瘤的體質量明顯減輕，而且系統(tǒng)毒性較小[135]。

苦瓜 EVs（bitter melon extracellualr vesicles，BMEVs）可以抑制口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細胞CAL-27和WSU-HN6的生長，這一作用是通過誘導腫瘤細胞S期細胞周期停滯和細胞凋亡實現(xiàn)；腫瘤細胞凋亡的誘導依賴于ROS的產(chǎn)生和JUN蛋白的上調；BMEVs顯著下調了NOD樣受體家族含pyrin結構域3炎癥小體（NOD-like receptor family，pyrin containing domain 3，NLRP3）的表達，這一作用與BMEV中所含RNA部分片段有關；5-氟尿嘧啶（5-fuorouracil，5-FU）廣泛用于癌癥治療，但5-FU介導的NLRP3激活使得OSCC細胞對5-FU產(chǎn)生耐藥性；BMEVs在體內和體外均與5-FU發(fā)揮協(xié)同作用，克服細胞對5-FU的耐藥，抑制OSCC細胞生長，這一作用與BMEVs抑制NLRP3的表達有關[136]。

2.3.3 腫瘤炎癥反應抑制作用 大蒜囊泡（garlic derived vesicles，GDVs）能被肝癌細胞HepG2攝取，用胰蛋白酶降解其表面蛋白質后，肝癌細胞HepG2對GDVs的攝取顯著減少；甘露糖特異性結合蛋白Ⅱ凝集素和CD98之間的直接相互作用在細胞對GDVs的攝取過程中起重要作用；阻斷CD98受體可顯著降低HepG2細胞對GDVs的攝??；在HepG2細胞中，GDVs通過LPS誘導的促炎因子IFN-γ和IL-6表達，發(fā)揮抗炎作用[137]。炎癥反應可以促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移[138]，因此GDVs有可能用于腫瘤治療。

2.3.4 抗腫瘤轉移作用 在3D微流體模型中，朝鮮樹參（Dendropanax morbifera）樹干汁液來源的囊泡DM-EVs可抑制腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）的生長，但對正常成纖維細胞的生長抑制作用較弱；此外，DM-EVs與黑色素瘤B16BL6-EVs同時給藥、B16BL6-EVs預處理后DM-EVs多次給藥或DM-EVs預處理后加入B16BL6-EVs，DM-EVs在 1 μg · ml-1或 10 μg · ml-1時，腫瘤相關成纖維細胞的生長均被顯著抑制；這些作用可能與DM-EVs引起整合素和膠原蛋白等細胞外基質蛋白表達下調有關[139]。

3 細胞外囊泡的工程化改造

EVs具有良好的生物相容性，可以通過多種機制抑制腫瘤生長，但在實際應用中發(fā)現(xiàn)，EVs作為腫瘤靶向治療藥物或藥物載體仍存在穩(wěn)定性差、靶向性低和易被代謝清除等問題[140]。為此，研究者對EVs進行工程化改造以彌補天然EVs在靶向性、有效性和代謝清除等方面的不足；改造既可以在囊泡內腔也可以在囊泡表面進行，但通常在囊泡內腔和囊泡表面2個層面同時進行（見圖5）。

圖5 細胞外囊泡工程化改造的策略和方法Figure 5 Strategy and method for EVs engineering

3.1 細胞外囊泡內腔貨物包載

EVs貨物的包載可以通過操控囊泡內含物的細胞分選系統(tǒng)載入[141-144]，也可以在EVs生成釋放后將貨物載入分離純化的囊泡，因此，EVs貨物包載既可以直接通過物理化學技術包載到EVs，也可以間接地通過親代細胞遺傳工程修飾將特定的分子包載到EVs。

3.1.1 基于親代細胞的細胞外囊泡貨物包載 通過遺傳工程修飾，利用親代細胞中EVs貨物的分選途徑，將目標分子包載入EVs，轉染和（或）轉導是一種常用的包載方法。質粒和病毒是在靶細胞中表達目標分子的常用分子生物學工具（見圖6）。在轉染質?；蜣D導病毒后，產(chǎn)生EVs的親代細胞可以表達相應的核酸和蛋白質等分子。比如，筆者團隊利用過表達血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的HEK293細胞生產(chǎn)了表達ACE2的EVs[145]。囊泡也可以作為蛋白質的輸送載體。在親代細胞中以光響應可切割多肽作為連接子，表達凋亡蛋白（apoptin）與EVs膜蛋白質CD9的融合蛋白，細胞生成的囊泡能包載該融合蛋白，光照后凋亡蛋白即被釋放[146]。為了測試骨髓基質細胞（marrow stromal cells，MSCs）EVs是否可以用作輸送抗腫瘤miRNA的載體，Katakowski等[147]用miR-146b表達質粒轉染MSC，并收集MSC釋放的EVs，發(fā)現(xiàn)獲得的EVs可顯著降低膠質瘤細胞的異種移植瘤生長速度。脂肪來源的間充質干細胞和腫瘤細胞等不同細胞經(jīng)轉染或轉導表達miRNA的表達載體后，均能產(chǎn)生帶有相應miRNA的EVs。比如脂肪間充質干細胞在轉染表達miR-122的質粒后，能夠生成表達miR-122的EVs，而且瘤內注射該囊泡能夠增強肝癌細胞對索那非尼的響應[148]。細胞在轉染寡核苷酸之后產(chǎn)生的EVs也攜帶轉染入細胞的寡核苷酸，比如乳腺癌細胞4T1、肝癌細胞HepG2和卵巢癌細胞SKBR3在經(jīng)脂質體lipofectamine 2000轉染Cy5-anti-miR-21后產(chǎn)生的EVs載有Cy5-anti-miR-21，而且這些囊泡還能夠抵抗癌細胞對DOX的耐藥性[149]。目前，有多種基因工程方法被用來增加核酸在囊泡內的富集[150]，比如將囊泡標志物分子基因與RNA結合蛋白基因連接在一起表達融合蛋白，可以將RNA分子富集在囊泡[151]。小分子化合物與親代細胞孵育產(chǎn)生的EVs也可以包載小分子化合物如DOX[152]。

圖6 基于親代細胞遺傳修飾的細胞外囊泡貨物包載Figure 6 EVs cargo encapsulation based on genetic engineering in the parental cells

3.1.2 基于物理化學技術的細胞外囊泡貨物包載 物理化學方法包括共孵育、電轉、化學轉染、超聲、擠壓、凍融循環(huán)、去污劑破膜和低滲透析等，其中共孵育、電轉、化學轉染和超聲是常用的方法。

共孵育是常用的小分子貨物包載方法，通過將靶分子與囊泡孵育，利用EVs膜兩側的靶分子濃度梯度，促使靶分子滲透進入囊泡[153]。EVs是脂質包裹的中空腔結構，表面是疏水性的，一些脂溶性的分子可以通過相似相溶的原理與EVs共孵育后包載入囊泡，EVs的載藥效率主要取決于藥物分子的疏水性。比如，疏水性的姜黃素與小鼠淋巴瘤細胞EL4產(chǎn)生的EVs共孵育被裝入囊泡，可提高其溶解性和穩(wěn)定性，體內給藥后能夠提高姜黃素的生物利用度[153]。從甘藍（cabex）和紅甘藍（rabex）中提取的納米囊泡能夠促進哺乳動物細胞（HaCaT和HDF）的增殖而不會引起細胞毒性；DOX與紅甘藍納米囊泡共孵育可將DOX包載到囊泡中，且所得囊泡能有效抑制結腸癌細胞增殖[154]。

電轉技術是通過對懸浮在緩沖液中的EVs施加電場，使EVs膜產(chǎn)生瞬時孔隙，隨后促進藥物或核酸通過孔隙擴散到EVs內部，將相關分子包載到EVs內，載藥過程結束后，囊泡膜的完整性恢復[155]。DNA經(jīng)由電轉在EVs的包載率與DNA大小和囊泡的粒徑有關，1 000 bp以上的DNA包載率僅為250 bp的DNA包載率的1/10，可能原因包括電擊產(chǎn)生的臨時膜孔徑太小和大DNA擴散速度慢等，因此電轉技術多用于EVs的siRNA或miRNA包載[156]。電轉的效率可能跟囊泡的來源有關，因此不同來源的囊泡電轉條件需要摸索優(yōu)化[157]。電轉可能導致RNA和EVs聚集，從而降低EVs的負載能力[158]；在電轉緩沖液加入膜穩(wěn)定劑如海藻糖（trehalose），可以降低電轉引起的EVs集聚[159-160]。電轉技術不僅可以用于囊泡的核酸包載，也可用于小分子的包載[161]。小分子包載效率與囊泡數(shù)量、小分子濃度有關，比如囊泡的數(shù)量和DOX的濃度均與DOX囊泡的包載率呈正相關[162]。

化學轉染是直接將貨物包載入EVs的常用方法。脂質體轉染是一種重復性好、簡便有效的貨物裝載方法[163]；但脂質體轉染也存在轉染效率低的缺點[164]。脂質體常用于將核酸包載至EVs[165]，比如，通過脂質體轉染，加載有miR-184的甘藍囊泡能有效抑制腫瘤的生長[154]。CaCl2與DNA等核酸結合，可促進核酸與細胞質膜結合；熱激（heat shock）通過改變膜流動性，促進核酸進入細胞。有研究結合CaCl2轉染和熱激將核酸分子包載到囊泡中，例如將miR-15a與0.1mol·L-1CaCl2冰上孵育30 min，42 ℃熱激60 s，然后再于冰上孵育5 min可以將miR-15a高效地包載到EVs[166]。

超聲處理可將PTX等小分子和蛋白質等多種分子包載到EVs中。大麻二醇通過超聲可以包載入人臍帶間充質干細胞產(chǎn)生的EVs中，這種囊泡可以抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞移植瘤的生長[167]。RAW264.7細胞產(chǎn)生的EVs通過超聲可以有效地包載過氧化氫酶（catalase），包載效率要高于共孵育法和凍融法，與擠壓法相當[168]。研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理的EVs粒徑、膜完整性和細胞內吞均受影響[169]。RAW264.7細胞來源的EVs在經(jīng)超聲包載PTX之后粒徑變大、zeta電位升高，包載效率要高于電轉和共孵育法[169]。然而，也有研究未見超聲對囊泡性狀的改變，例如人源脂肪組織干細胞分泌的EVs通過超聲能夠有效包載小分子酪氨酸激酶抑制劑，包載效率比共孵育法高4倍，且不會引起囊泡聚集[170]。這些差異可能跟所用的囊泡來源不同有關。

3.2 細胞外囊泡膜表面工程化改造

EVs是一種脂膜結構，膜上嵌合了不同的蛋白質，囊泡表面也以糖脂、糖蛋白質等糖復合物的形式表達不同的糖鏈，故可通過遺傳學操作以及生物偶聯(lián)技術將熒光探針、靶向肽及藥物分子、納米抗體和適配體等生物活性分子與脂質、蛋白質和糖鏈偶聯(lián)并表達在EVs膜表面[171]。EVs膜工程化改造包括基于親代細胞遺傳修飾、代謝工程的EVs膜表面分子展示及基于物理化學技術的EVs膜表面分子展示。

3.2.1 基于親代細胞的細胞外囊泡膜表面分子展示EVs表面加入靶向肽等功能性分子可以增強囊泡的靶向性，常見的辦法是將靶向性分子替換EVs表面高豐度的跨膜蛋白的胞外區(qū)表達融合蛋白。溶酶體相關膜蛋白2b（lysosome associated membrane protein 2b，Lamp2b）和四次跨膜蛋白家族成員CD9、CD63、CD81是常見的EVs膜蛋白，這些分子的胞內區(qū)常用做構建融合蛋白的骨架。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）等腫瘤細胞高表達的受體酪氨酸激酶的配體是常用的構建具有腫瘤靶向融合蛋白的分子。利用自源性樹突細胞表達序列為YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG的腦靶向肽RVG（rabies viral glycoprotein）與Lamp2b的融合蛋白Lamp2b-RVG，序列為ASSLNIA的肌肉組織靶向肽（muscle specific peptide，MSP）與Lamp2b的融合蛋白Lamp2b-MSP，生成分別表達Lamp2b-RVG和Lamp2b-MSP的囊泡，這些囊泡可以分別特異性地進入神經(jīng)細胞Neuro2A和肌肉細胞C2C12，這些囊泡載入siRNA后，可以有效地敲低受體細胞中的靶基因表達；通過電轉載入GAPDH的siRNA后，Lamp2b-RVG囊泡可以在多個腦區(qū)敲低GAPDH的表達，但未見Lamp2b-MSP囊泡在肌肉組織的蓄積[172]。EGFR是一種在腫瘤細胞表面高表達的跨膜糖蛋白[173-174]。通過對供體HEK293細胞進行遺傳操作，將能與EGFR結合的GE11肽（YHWYGYTPQNVI）與PDGFR跨膜區(qū)以融合蛋白形式表達在囊泡表面，可靶向EGFR高表達的乳腺癌細胞[165]。糖基化是一種廣泛的蛋白質翻譯后修飾方式，在Lamp2b-靶向肽融合蛋白上多處引入糖基化位點，以防止肽的降解和增加融合蛋白在細胞與囊泡的表達，由此所得的囊泡對神經(jīng)母細胞瘤細胞的靶向能力增強[175]。乳糖黏蛋白（lactadherin）的C1C2結構域能夠與磷脂酰絲氨酸特異性結合，靶向肽等功能性分子也常通過與C1C2結構域融合形成融合蛋白以實現(xiàn)在囊泡表面的表達[176]。衰變加速因子（decay accelerating factor）來源的磷脂酰肌醇錨定信號肽與EGFR的抗體EGa1或R2結合，也可以將抗體展示在囊泡膜表面[177]。改造細菌囊泡膜整合蛋白毒素，將具有腫瘤靶向性的抗體、配體（ligand）或親合體（affibody）替換毒素的胞外區(qū)，也可以將靶向性的多肽比如整合素αvβ3靶向肽RGD等偶聯(lián)至囊泡表面，從而實現(xiàn)囊泡的腫瘤靶向[178]。溶細胞素A是大腸埃希菌囊泡表面含量最高的毒力蛋白，是常用于構建腫瘤靶向融合分子的靶蛋白。HER2的親合體[179]和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）[180]均可用于和溶細胞素A構建融合蛋白，實現(xiàn)細菌囊泡的腫瘤靶向。

盡管靶向肽等功能性分子借助膜融合蛋白技術成功實現(xiàn)了在EVs膜表面的展示，但這一方法仍需改進以克服如下不足：1）復雜、耗時，通常較難操作；2）融合蛋白可能會在EVs生成與分泌過程中降解，而不是分選到EVs中，并且重組蛋白與EVs膜蛋白的融合可能損害這些膜蛋白的功能；3）靶向配體容易降解；4）大多數(shù)干細胞和原代細胞并不適合基因工程方法，因為它們通常難以進行轉染。

不適合遺傳修飾展示的分子可以通過代謝標記的方式實現(xiàn)展示。代謝標記通常是將特定的標簽分子通過細胞代謝整合到EVs的表面，這些分子包括脂質、氨基酸和糖類物質等。目前，脂質的代謝標記主要基于磷酸脂。疊氮修飾的膽堿通過脂質合成途徑可生成疊氮化的磷酸酰膽堿，而磷脂（包括磷脂酰膽堿）是細胞質膜和EVs膜的主要成分，因而可以整合到EVs膜上；通過生物正交反應（bioorthogonal reaction）可以將靶向分子或貨物展示在膜上[181]。氨基酸的代謝標記主要通過在膜蛋白中引入可以進行生物正交反應的非天然氨基酸，例如在間充質干細胞中6-疊氮-L-去甲亮氨酸可以通過甲胺酰tRNA合成酶L274G突變體（methionyl tRNA synthetase，MetRSL274G）整合入膜蛋白質，L-疊氮高丙氨酸也可整合入膜蛋白質[182]。單糖的代謝標記主要利用唾液酸生物合成途徑在細胞膜表面末端唾液酸中加入生物正交反應基團，用于連接靶向性配體或治療性藥物等分子，疊氮修飾的全乙酰基甘露糖胺是常用的代謝標記底物[183]。例如，經(jīng)代謝標記整合到EVs膜表面的末端唾液酸，通過其帶有的疊氮，可與PEG化的透明質酸發(fā)生反應，這一修飾可以增強所得囊泡對CD44高表達的風濕性關節(jié)炎組織的主動靶向能力[184]。這些策略同樣適用構建靶向腫瘤的囊泡。

3.2.2 基于物理化學技術的細胞外囊泡膜表面分子展示 生物正交反應是細胞和EVs表面修飾的常用化學方法[185-186]。生物正交反應一般均是具有反應高效、選擇性好和反應模塊化特點的點擊化學（click chemistry）反應。銅催化的疊氮炔環(huán)加成和張力催化的疊氮炔環(huán)加成是在EVs表面進行生物偶聯(lián)的常用點擊化學方法。銅催化的疊氮炔環(huán)加成是點擊化學的一個代表性反應，該反應耗時短、特異性高，并且在水溶性緩沖液中有較好的相容性。該法修飾對囊泡的結構與功能影響小，例如不改變囊泡的大小，不影響囊泡與受體細胞的結合[186]。但銅離子往往容易對EVs造成損害，因此，張力催化的疊氮炔環(huán)加成比銅催化的疊氮炔環(huán)加成更多地被用于將EVs與靶向肽進行偶聯(lián)[187]。氨基和巰基借助酰胺化等生物正交偶聯(lián)反應也可將熒光探針、同位素造像劑和靶向肽修飾到EVs膜表面[39]。除了生物正交反應，酶促反應也用于將EVs表面分子與靶向肽等目標分子通過共價鍵連接。有研究利用轉肽酶Sortase A和蛋白連接酶OaAEP1，可將EGFR靶向肽和EGFR納米抗體以共價鍵形式偶聯(lián)到EVs上，無需對供體細胞進行任何遺傳修飾[188]。

靶向性配體等功能性分子也可以利用疏水性分子通過相似相溶的原理，嵌入EVs脂質雙層結構，錨定在EVs膜表面。例如，將EGFR的納米抗體R2或EGa1和PEG分別與磷脂綴合，形成的復合物可以通過磷脂錨定在EVs膜表面，這一修飾不影響囊泡形態(tài)、粒徑分布和囊泡蛋白質組成，但可以增強EVs對EGFR高表達的腫瘤細胞的靶向性，同時延長囊泡在血液中的循環(huán)時間[189]。不對稱siRNA（hydrophobically modified siRNA，hsiRNAs）在經(jīng)過膽固醇等疏水性脂質修飾后，可以通過脂質錨定在囊泡表面，或通過脂質介導的融合進入囊泡，siRNA的包載效率主要同脂質與siRNA的連接方式和所用連接子類型有關[190]。siRNA的疏水性決定了siRNA-EVs復合物的負載效率和沉默活性[191]，這種修飾不影響囊泡的大小和完整性[192]。為克服囊泡表面遺傳修飾的缺陷和不足，研究人員設計了一種稱作DNA拴纜的分子，將拴纜DNA與膽固醇連接形成DNA拴纜-膽固醇分子，在室溫下與囊泡渦旋5 min，即可通過膽固醇將拴纜DNA錨定在囊泡表面；通過與DNA拴纜互補配對的DNA，可以將熒光分子、活性分子和靶向分子展示在囊泡表面[193]。

3.3 貨物包載策略與細胞外囊泡膜表面分子展示技術聯(lián)用

為同時增強EVs的靶向性和減毒增效，多數(shù)研究傾向于將貨物包載和EVs膜表面分子展示結合在一起。

通過蔗糖梯度分離所得食用生姜30%蔗糖級分囊泡和45%蔗糖級分囊泡中的脂質47%為磷脂酸，15%為雙半乳糖二酰甘油，27%為單半乳糖二酰甘油。提取分離這些生姜囊泡脂質，采用裝備200 nm聚碳酸酯膜的脂質體擠壓儀制備空載的合成囊泡，所得的合成囊泡能夠有效包載DOX，而且能夠通過吞噬作用被細胞攝取，囊泡經(jīng)由葉酸（folic acid，F(xiàn)A）修飾后可被結腸癌細胞CT-26高效地攝取，在體內主動特異性靶向CT-26移植瘤并有效地抑制腫瘤生長；FA納米載體在酸性環(huán)境下可更加快速地釋放這種藥物，從而降低DOX的嚴重副作用[194]。將與P-選擇素具有高親和力的巖藻依聚糖作為外涂層；生物相容性好的陽離子聚合物ε-多聚賴氨酸（ε-poly-lysine，ε-PLL）作為中間層；包裹載有DOX的生姜衍生脂質載體，成功構建了疊層生姜衍生脂質載體（layer-by-layer ginger lipid vectors，LbL-GDLV），這使得LbL-GDLV通過與腫瘤細胞P-選擇素結合實現(xiàn)腫瘤的主動靶向；在Luc-HT-29和HCT-116異種移植瘤模型中，負載DOX的LbLGDLVs可顯著抑制腫瘤生長，顯示出比游離DOX更好的治療效果；更重要的是，LbL-GDLVs具有良好的生物相容性，顯著減輕了游離DOX的心臟毒性，避免了結腸腫瘤細胞對游離DOX的耐藥性[195]。為了增強生姜源囊泡（ginger derived exosome like nanovesicles，GDENs）與KB口腔腫瘤細胞的結合，將尾部接有膽固醇和頭部接有FA的三路結（three way junction，3WJ）結構域的proHead RNA分子通過膽固醇插入囊泡表面；包載生存素（survivin）siRNA后形成的FA-3WJ/GDEN/siRNA囊泡能夠有效敲低細胞中生存素的表達，效果與脂質體轉染相當；靜脈給藥后該囊泡還能在體內有效抑制人源口腔表皮癌細胞KB裸鼠移植瘤的生長[196]。

葡萄柚囊泡衍生脂質制成的納米載體（grapefruit-derived nanovectors，GNVs）可有效地遞送不同物質，包括信號轉導與激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）小分子抑制劑JSI-124、PTX等化療藥物、生物素化增強型黃色熒光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）的 DNA表達載體、熒光素酶的DNA表達載體、熒光素酶siRNA和生物素化蛋白質（如生物素化的CD4抗體或CD8抗體）。裝載JSI-124的GNVs可以顯著抑制STAT3的激活，有效抑制小鼠膠質瘤細胞GL26的移植瘤生長，并且顯著延長小鼠的存活時間[197]。GNVs經(jīng)FA修飾可實現(xiàn)對腫瘤的主動靶向，在小鼠結腸癌細胞CT26移植瘤模型和人結腸癌細胞SW620的SCID小鼠移植瘤模型中，GNVs-FA在腫瘤組織中的分布分別比GNVs多1 300倍和1 600倍[197]。通過肝素的羧基結合靶向膠質瘤αvβ3的cRGD肽，載入己二酸二肼-阿霉素構建肝素納米粒子（doxoruicin nanoparticles，DNs），再將葡萄柚EVs通過葡萄柚EVs表面高豐度的磷脂酰乙醇胺，和肝素納米粒上的肝素自由羧基反應，制備酸敏感的仿生阿霉素膠質瘤靶向囊泡（EV-DNs）；所得囊泡能夠通過受體介導的轉胞吞作用和膜融合穿越血腦屏障，并深層次穿透到腦腫瘤組織內部，顯著增強藥物在腦腫瘤部位的富集，抑制腫瘤的生長，提升原位腦膠質瘤小鼠的生存期[198]。

細菌囊泡用于腫瘤靶向治療，通常需要做兩方面的處理：一是減毒，二是囊泡表面修飾以提高囊泡對腫瘤細胞和組織的靶向性。去除細菌囊泡表面的毒素有很多方法，遺傳學改造是廣泛應用的一種。例如大腸埃希菌K-12 W3110E. coli的毒性主要與LPS中脂質A（lipid A）有關，可以通過敲除其中脂質A合成酶基因msbB，減低其產(chǎn)生的囊泡的毒性[179]。因此，ΔmsbBK-12 W3110E. coli菌株廣泛被用于制備工程化的細菌囊泡。除了ΔmsbBK-12 W3110E. coli菌株，鳥苷5'-二磷酸-3'-二磷酸合成缺陷的鼠傷寒沙門菌等其他減毒細菌也被用于生產(chǎn)藥物遞送的細菌囊泡[199]。細菌囊泡減毒也可以通過使用溶菌酶降解囊泡表面的內毒素，或采用內毒素去除試劑盒去除內毒素；表達人TRAIL片段（氨基酸序列114 ~ 281）的大腸埃希菌囊泡采用溶菌酶去除內毒素，然后在膜表面通過棕櫚酸接上αvβ3整合素靶向配體RGD（G）或RGP（P），并將光敏劑（photosensitizer）吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），通過融合效應及ICG與RGD或RGP的電荷相互作用，加載到不同囊泡表面，分別形成ICGRGD-OMVs（I-G-OMVs）和 ICG-RGP-OMVs（I-POMVs），同時制備ICG-OMVs；在近紅外光的刺激下，I-P-OMVs能誘導針對B16F10黑色素瘤細胞C57BL/6小鼠移植瘤的光熱光動學反應，引起播散性的腫瘤細胞凋亡[178]。

4 結語與展望

哺乳動物EVs、細菌EVs和植物EVs均已被證實具有抗腫瘤作用且可作為抗腫瘤藥物遞送載體，而且作用機制多樣，幾乎可以調節(jié)所有的腫瘤特征性功能[200]。EVs在臨床中的應用受到了廣泛的關注，但是EVs作為一種新型治療手段，還有許多問題亟待解決：1）藥物質量的穩(wěn)定可控是藥物安全性和有效性的保證，目前尚無EVs大量生產(chǎn)方法，仍缺乏確定的特征性標志物。目前迫切需要將EVs分離純化的流程和藥效評價的流程標準化，使得不同實驗室的結果、同一實驗室不同批次結果具有可比性。2）EVs生成、內含物裝載、轉運與攝取和內含物在靶細胞的釋放機制等仍處于探索期，這些機制研究的進展可以幫助制備安全性更好、療效更顯著、毒副作用更小的EVs診療藥物。3）因多數(shù)植物和細菌的基因組序列未知，極大地限制了基于鳥槍法（Shotgun）的蛋白質組學技術在植物囊泡和細菌囊泡蛋白質內含物鑒定方面的應用，進而阻礙這些囊泡作用的物質基礎和作用機制研究，也阻滯了這些囊泡蛋白質類特征標志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定，所以需要發(fā)展新的特別是從頭測序的蛋白質組學技術用于這些囊泡蛋白質的鑒定。4）EVs的長期安全性和有效性仍需更多的試驗進行評價。目前雖然有超過300項的臨床試驗在評價EVs的各種治療作用，但是尚無基于EVs的治療藥物被各國藥物監(jiān)管機構批準用于臨床實踐，未來需要更多的研究去評價EVs對腫瘤等疾病的治療效果和安全性，為EVs診療藥物的臨床應用鋪平道路。