苗佳穎，陸偉

（復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

疫苗能為接種后的個(gè)體建立較為持久的免疫保護(hù)，它徹底消滅了天花和牛瘟，有效控制了非典型性肺炎、禽流感等死亡率高、又無(wú)特效治療藥物的傳染病，并逐漸成為腫瘤、代謝性疾病等慢性病最具潛力的防治手段。疫苗成本較低，適合大規(guī)模接種，為延長(zhǎng)人類(lèi)平均壽命做出了重大貢獻(xiàn)[1]。

傳統(tǒng)疫苗包括減毒疫苗、滅活疫苗以及亞單位疫苗，這類(lèi)疫苗維持了病原體的性狀和病原體表面蛋白，能有效地誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，但存在毒力恢復(fù)或滅活不完全的潛在安全問(wèn)題。隨著疫苗研究的不斷深入，通過(guò)DNA重組技術(shù)制成的基因工程疫苗以其易于取材的便捷性和進(jìn)一步提升的安全性、有效性而受到青睞，然而其相對(duì)較弱的免疫原性仍是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，合成工藝更為簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)更加持久的核酸疫苗逐漸成為研究熱點(diǎn)。DNA 疫苗、RNA疫苗屬于此類(lèi)疫苗，它們直接將編碼某種抗原的外源基因?qū)塍w內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞攝取、合成抗原后誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。其中，信使RNA（mRNA）疫苗表達(dá)機(jī)制更為安全和簡(jiǎn)單，沒(méi)有類(lèi)似DNA疫苗整合到宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)，可以在生物體內(nèi)自然降解，具有十分廣泛的應(yīng)用前景[2]。

mRNA疫苗以線性質(zhì)粒DNA（pDNA）或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增的DNA為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的抗原表達(dá)，在體內(nèi)能建立良好的耐受性并引起強(qiáng)效的免疫反應(yīng)。mRNA疫苗的生產(chǎn)無(wú)需動(dòng)物基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)，更加簡(jiǎn)單、快速、低成本[3]。mRNA直接在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯而不進(jìn)入細(xì)胞核，不會(huì)整合進(jìn)宿主基因組。mRNA本身具有佐劑作用，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。尤其是在新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）大流行的當(dāng)今，mRNA疫苗的研制周期比傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗更短，且序列更易修改，可以更好地應(yīng)對(duì)隨時(shí)可能變異的病毒株。目前，多項(xiàng)關(guān)于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的mRNA疫苗正在研發(fā)中。然而mRNA疫苗穩(wěn)定性較差，易被血清中的RNA水解酶降解，或被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而無(wú)法到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮作用。mRNA相對(duì)分子質(zhì)量較大且?guī)в胸?fù)電荷，難以通過(guò)磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)穿過(guò)細(xì)胞膜。因此，需要設(shè)計(jì)合適的遞送系統(tǒng)，以保證mRNA疫苗能順利進(jìn)入靶細(xì)胞，并有效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯[4]。

病毒載體遞送mRNA存在固有的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，有效荷載包裝能力有限且生產(chǎn)較為困難。相比較之下，非病毒載體能夠有效保護(hù)負(fù)載的mRNA不受外部環(huán)境或核酸酶的影響，其通常免疫原性較低，安全性更高，設(shè)計(jì)合成相對(duì)便捷且易于生產(chǎn)，可重復(fù)給藥，是用于遞送mRNA的理想載體。目前，已有110項(xiàng)國(guó)內(nèi)和248項(xiàng)國(guó)外的mRNA疫苗專(zhuān)利技術(shù)被報(bào)道或公開(kāi)。表1列出了目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的mRNA疫苗。本文將針對(duì)應(yīng)用于mRNA疫苗的非病毒載體遞送系統(tǒng)進(jìn)行介紹。

表1 臨床試驗(yàn)階段的mRNA疫苗Table 1 mRNA vaccines under clinical trials

1 脂質(zhì)載體

磷脂分子的頭部親水、尾部疏水，其成分與細(xì)胞膜類(lèi)似，具有良好的生物相容性和可延展性。含有陽(yáng)離子或可電離類(lèi)脂材料的脂質(zhì)混合物在水中或酸性環(huán)境中形成帶正電荷的封閉囊泡，可將帶負(fù)電荷的mRNA分子包裹其中，保護(hù)mRNA免受核酸酶降解，且包封率較高。載有mRNA的脂質(zhì)載體被細(xì)胞攝取后，進(jìn)入細(xì)胞中酸性膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)（內(nèi)體）。此時(shí)，帶正電荷的脂質(zhì)與內(nèi)體膜上帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，這種結(jié)合擾亂了內(nèi)體膜結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)膜融合和內(nèi)體破壞，從而導(dǎo)致被包載的mRNA逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而到核糖體進(jìn)行翻譯[9]。通過(guò)對(duì)脂質(zhì)載體進(jìn)行修飾，還能增強(qiáng)其穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)靶向遞送。

1.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體

陽(yáng)離子脂質(zhì)體是應(yīng)用最早的脂質(zhì)載體。1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）是脂質(zhì)體中常含有的成分。由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體存在一定的毒性且循環(huán)半衰期較短，可能會(huì)與帶負(fù)電荷的胞內(nèi)或胞外成分非特異性結(jié)合，通常要對(duì)其進(jìn)行一定的修飾，以提高mRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的穩(wěn)定性，減輕毒性并延長(zhǎng)作用時(shí)間。

Zhang等[10]利用具有跨膜結(jié)構(gòu)和免疫佐劑功能的膽固醇修飾陽(yáng)離子肽DP7，并對(duì)DOTAP脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，構(gòu)建了mRNA遞送系統(tǒng)DOTAP/DP7-C。該系統(tǒng)能提高向樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）遞送編碼個(gè)體化新抗原的mRNA的效率，并能增強(qiáng)DC的活性，具有載體和免疫佐劑的雙重功能。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，DOTAP/DP7-C/LL2新抗原編碼mRNA復(fù)合物經(jīng)皮下注射能明顯抑制小鼠荷LL2原位腫瘤和皮下腫瘤生長(zhǎng)，并刺激抗原特異性淋巴細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生。Liu等[11]用甘露糖修飾的脂質(zhì)/磷酸鈣（LCP）納米粒將編碼腫瘤相關(guān)抗原MUC1的mRNA遞送至淋巴結(jié)DC，在三陰性乳腺癌（TNBC）原位模型中評(píng)估了攜帶mRNA的納米粒免疫后的治療效果。LCP包含磷酸鈣核心和由DOTAP、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）與DSPE-PEG-甘露糖組成的不對(duì)稱(chēng)脂質(zhì)雙層，mRNA分子被濃縮并包裹在磷酸鈣核心中。亞細(xì)胞分布表明，LCP可以有效地轉(zhuǎn)染淋巴結(jié)DC，并將負(fù)載的mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，有利于所遞送的編碼MUC1的mRNA表達(dá)。體內(nèi)研究表明，該疫苗遞送系統(tǒng)可以誘導(dǎo)出針對(duì)4T1 TNBC細(xì)胞的強(qiáng)烈的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)。

通過(guò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和優(yōu)化，還能改善陽(yáng)離子脂質(zhì)體在DC中的抗原表達(dá)或?qū)崿F(xiàn)靶向定位。Wang等[12]以不同相對(duì)分子質(zhì)量PEG（PEG100、PEG1000和PEG2000）為連接物，合成甘露糖-膽固醇結(jié)合物（MPn-CHs），用薄膜分散法制備成DC靶向脂質(zhì)體（MPn-LPs），并通過(guò)簡(jiǎn)單的自組裝制備成攜帶mRNA的MPn-LPX。攝取研究表明，MP1000-LPX可以通過(guò)過(guò)度表達(dá)DC表面甘露糖受體（CD206）來(lái)增強(qiáng)mRNA的表達(dá)，它具有體積小、近球形、在血清中穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)，有望成為mRNA疫苗的DC靶向遞送系統(tǒng)。

1.2 陽(yáng)離子納米乳

陽(yáng)離子納米乳（CNE）將納米乳液與陽(yáng)離子脂質(zhì)結(jié)合使用，具有保護(hù)和高效遞送核酸的能力。Brito等[13]制成了一種陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP和乳劑佐劑MF59乳化而成的陽(yáng)離子納米乳，由含有緩沖液和吐溫80的水相與含有山梨醇酐三油酸酯（Span 85）、DOTAP和角鯊烯的油相混合而成。該CNE遞送的自擴(kuò)增mRNA通過(guò)招募免疫細(xì)胞增強(qiáng)了局部免疫，在肌肉中實(shí)現(xiàn)與病毒載體相似的蛋白表達(dá)位置與表達(dá)量，在多種動(dòng)物模型中具有良好的耐受性和免疫原性。Bogers等[14]用CNE向恒河猴遞送編碼C族包膜糖蛋白的自擴(kuò)增RNA人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）疫苗，首次在非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中證明了用CNE配制的自擴(kuò)增RNA HIV疫苗是安全的，且具有免疫原性，可引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Samsa等[15]使用CNE遞送系統(tǒng)配制了2種委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）自擴(kuò)增RNA疫苗，分別是攜帶TC-83的RNA基因組的Vee SAM減毒活疫苗LAV-CNE和遞送缺少衣殼基因的TC-83基因組的不可逆減毒Vee SAM疫苗IAV-CNE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用LAV-CNE免疫的小鼠可產(chǎn)生與TC-83相似的免疫反應(yīng)，可以100%保護(hù)氣溶膠VEEV攻擊。IAVCNE也具有免疫原性，對(duì)VEEV攻擊具有明顯的保護(hù)作用，為開(kāi)發(fā)以CNE為載體遞送VEEV等病毒的自擴(kuò)增RNA疫苗提供了概念驗(yàn)證。Luisi等[16]使用CNE制備的自放大mRNA遞送平臺(tái)開(kāi)發(fā)寨卡病毒（ZIKV）候選疫苗，所制備的疫苗在小鼠和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中均能誘導(dǎo)出針對(duì)ZIKV的中和抗體反應(yīng)，其中一種候選疫苗對(duì)非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的ZIKV感染提供了完全保護(hù)。

1.3 脂質(zhì)納米粒

脂質(zhì)納米粒（LNPs）通常由可電離脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和膽固醇幾個(gè)部分組成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。帶負(fù)電荷的mRNA與酸性pH下帶正電荷的可電離脂質(zhì)結(jié)合，位于整個(gè)LNPs結(jié)構(gòu)的核心。PEG脂質(zhì)位于LNPs結(jié)構(gòu)的表面，能夠延長(zhǎng)LNPs的循環(huán)半衰期，增強(qiáng)粒子的穩(wěn)定性。輔助脂質(zhì)能夠支持脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)并促進(jìn)粒子與細(xì)胞的結(jié)合。膽固醇則通常填充于脂質(zhì)間隙，起到穩(wěn)定LNPs結(jié)構(gòu)的作用。包載mRNA的LNPs進(jìn)入人體的生理環(huán)境后，可電離脂質(zhì)變成接近中性。當(dāng)LNPs被內(nèi)吞進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)體后，由于內(nèi)體環(huán)境呈酸性，可電離脂質(zhì)重新帶有正電荷，可以與帶負(fù)電荷的內(nèi)體膜融合，促進(jìn)納米粒的內(nèi)體逃逸，將粒子釋放到細(xì)胞質(zhì)中[17]。最后，可電離脂質(zhì)在近中性的胞漿中釋放mRNA，以利于其進(jìn)一步到核糖體進(jìn)行翻譯（見(jiàn)圖2）。LNPs與其他載體相比具有許多優(yōu)勢(shì)：合成可控、組成成分容易調(diào)整以提高遞送效率和降低毒性，可以加入佐劑或免疫細(xì)胞靶向配體等免疫增強(qiáng)劑以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[18]。

圖1 脂質(zhì)納米粒包載mRNA結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic illustration of the structure of mRNA encapsulated LNP

圖2 脂質(zhì)納米粒遞送mRNA入胞及轉(zhuǎn)染過(guò)程示意圖Figure 2 Schematic illustration of the endocytic pathway of mRNA delivered by LNP and the transfection process

Pardi等[19]將螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA結(jié)合到組成為可電離脂質(zhì)/磷脂酰膽堿/膽固醇/PEG脂質(zhì)物質(zhì)的量比為 50∶10∶38.5∶1.5（mol/mol）的 LNPs中，其中mRNA與總脂質(zhì)質(zhì)量比為小于0.05（wt/wt），得到直徑為小于80 nm的mRNA-LNPs復(fù)合物。將制備成的 mRNA-LNPs以 0.005 ~ 0.250 mg · kg-1的劑量通過(guò)6種不同途徑注射到小鼠中，體內(nèi)成像檢測(cè)到了高水平的蛋白質(zhì)翻譯，證明了mRNA-LNPs復(fù)合物可以在體內(nèi)不同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)。Liang等[20]用可電離脂質(zhì)/飽和磷脂/膽固醇/PEG脂質(zhì)/6，9，12-十八碳三稀酸（GLA）物質(zhì)的量比為50∶9.83∶38.5∶1.5∶0.17（mol/mol）的LNPs包裹了2種修飾的非復(fù)制型流感H10血凝素（HA） mRNA疫苗，肌肉或皮內(nèi)注射恒河猴后，誘導(dǎo)了保護(hù)性的HA抑制滴度和H10特異性的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，證明了LNPs遞送的mRNA疫苗可以產(chǎn)生強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答。

用于腫瘤免疫治療的mRNA疫苗遞送研究是腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Oberli等[21]報(bào)道了一種用于遞送mRNA疫苗的LNPs制劑，以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。使用該疫苗對(duì)DC、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，并在侵襲性B16F10黑色素瘤模型中測(cè)試了該疫苗的有效性。含有編碼腫瘤相關(guān)抗原gp100和trp2的mRNA的LNP單次免疫后，能夠活化CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)獲得性免疫殺死黑色素瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的總體生存時(shí)間，并且該疫苗加入佐劑脂多糖（LPS）可進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

Miao等[22]開(kāi)發(fā)了一個(gè)可電離類(lèi)脂材料的組合庫(kù)，用以確定能促進(jìn)體內(nèi)mRNA傳遞并提供有效和特異性免疫激活的mRNA遞送載體。通過(guò)三維多組分反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)最好的脂類(lèi)均具有共同的結(jié)構(gòu)：不飽和脂尾、二氫咪唑接頭和環(huán)胺頭基。這些制劑并非通過(guò)激活Toll樣受體，而是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)干擾素基因刺激物（STING）途徑誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞成熟，從而導(dǎo)致系統(tǒng)細(xì)胞因子的有限表達(dá)和增強(qiáng)抗腫瘤效果。其中，首選的制劑誘導(dǎo)了強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，并能夠抑制黑色素瘤和人乳頭狀瘤病毒E7腫瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。

此外，LNPs也被廣泛應(yīng)用于遞送針對(duì)流感病毒、狂犬病病毒、HIV、巨細(xì)胞病毒（CMV）等的mRNA疫苗[23]。Lutz等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，單次肌肉注射由LNPs遞送的編碼狂犬病病毒或流感病毒抗原的mRNA疫苗，可以誘導(dǎo)保護(hù)性抗體滴度，在長(zhǎng)達(dá)1年的觀察期間，免疫反應(yīng)可得到增強(qiáng)并保持穩(wěn)定。Pardi等[24]用LNPs包裹編碼2013年ZIKV爆發(fā)菌株的前膜和包膜糖蛋白的核苷修飾的mRNA，進(jìn)行單次低劑量皮內(nèi)免疫后，在小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中引發(fā)了有效和持久的中和抗體反應(yīng)。其中，LNPs的脂質(zhì)組成為可電離脂質(zhì)/磷脂酰膽堿/膽固醇/PEG脂質(zhì)，其物質(zhì)的量比為50∶10∶38.5∶1.5（mol/mol），mRNA與總脂的質(zhì)量比為0.05（wt/wt）。注射劑量為30 μg時(shí)，可在免疫后2周或5個(gè)月保護(hù)小鼠免受ZIKV攻擊，50 μg的單次免疫則可在5周內(nèi)保護(hù)非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，表明了核苷修飾的mRNA-LNPs能誘導(dǎo)快速持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

SARS-CoV-2的出現(xiàn)使應(yīng)用mRNA疫苗預(yù)防傳染病成為了研究焦點(diǎn)，LNPs-mRNA在其中得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。2種獲得了美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）緊急使用授權(quán)的新型冠狀病毒肺炎mRNA疫苗均采用LNPs作為載體。其中，輝瑞生物技術(shù)公司的BNT162b2，其LNPs載體成分包含膽固醇、2-PEG2000-N，N-二十四烷基乙酰胺、[（4-羥基丁基）氮雜二烷基]雙（己烷-6，1-二基）雙（2-己基癸酸酯）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）。Moderna公司的mRNA-1273，其LNPs載體成分包含膽固醇、鞘磷脂-102（SM-102）、二肉豆蔻酰甘油-PEG2000和DSPC。這2種疫苗在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中的有效率分別高達(dá)95%和94.5%，體現(xiàn)了以LNPs為載體的mRNA疫苗的高效性和在預(yù)防感染性疾病中的巨大潛力[25]。

2 聚合物

與陽(yáng)離子脂質(zhì)體類(lèi)似，帶有正電荷的陽(yáng)離子聚合物也可以與mRNA疫苗通過(guò)電荷相互作用形成復(fù)合物。相較于生產(chǎn)過(guò)程需要自組裝、擠壓和絡(luò)合的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，陽(yáng)離子聚合物僅需要與mRNA疫苗進(jìn)行混合，生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，具有結(jié)構(gòu)可控，功能多樣的優(yōu)點(diǎn)，且穩(wěn)定性更好[25]。聚乙烯亞胺（PEI） 是早期廣泛用于mRNA疫苗遞送的聚合物，常對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化以提高轉(zhuǎn)染效率。聚酰胺胺（PAMAM）、聚丙烯亞胺（PPI）等樹(shù)枝狀大分子也被用于mRNA疫苗遞送。然而，聚合物遞送系統(tǒng)的生物相容性、細(xì)胞毒性和生物降解性問(wèn)題需要進(jìn)一步解決，以提高其安全性、有效性和體內(nèi)穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)這些陽(yáng)離子聚合物進(jìn)行修飾并靶向特定細(xì)胞，可以減輕細(xì)胞毒性，改善體內(nèi)外釋放性能。一些研究也采用聚乳酸（PLA）、聚β-氨基酯（PBAE）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）等聚酯，或殼聚糖和葡聚糖等天然聚合物衍生物，以獲得更好的生物降解性[26-27]。

Karpenko等[28]以聚葡萄糖素-亞精胺結(jié)合物（PGS）作為載體，遞送編碼SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)合域的mRNA（mRNA-RBD），免疫小鼠后產(chǎn)生了具有中和活性的特異性抗體。Chahal等[29]開(kāi)發(fā)了一種樹(shù)枝狀大分子納米顆粒疫苗載體用于遞送含有編碼抗原蛋白的mRNA，該疫苗可由多個(gè)表達(dá)抗原的復(fù)制子組成，能夠激發(fā)CD8+T細(xì)胞和抗體反應(yīng)，對(duì)包括H1N1流感病毒、弓形蟲(chóng)和埃博拉病毒在內(nèi)的致命性病原體產(chǎn)生保護(hù)性免疫。Li等[30]將環(huán)糊精（CD）與PEI600或PEI2k偶聯(lián)，制備了不同CD/PEI比的CD-PEI聚合物（CP）。通過(guò)評(píng)估淋巴結(jié)遷移和免疫應(yīng)答，分析了CP600、CP2k和PEI25k作為鼻腔內(nèi)mRNA疫苗載體的遞送效果，發(fā)現(xiàn)CP2k/mRNA體外轉(zhuǎn)染效率較高，向淋巴結(jié)遷移和刺激DC在體內(nèi)成熟的能力比PEI25k/mRNA更強(qiáng)，并能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且其局部和全身毒性低于PEI25k/mRNA，證明了CD-PEI2k/mRNA納米復(fù)合物具有向淋巴結(jié)高效輸送疫苗的潛力。

3 脂質(zhì)/聚合物雜化納米粒

脂質(zhì)/聚合物雜化納米粒（LPHNs）是由脂質(zhì)殼和聚合物內(nèi)芯組成的納米結(jié)構(gòu)，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80%。裝載mRNA疫苗的LPHNs可以通過(guò)細(xì)胞屏障，并實(shí)現(xiàn)有效的內(nèi)體釋放和高效的蛋白質(zhì)翻譯，具有穩(wěn)定、持久、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)[31]。Ayad等[32]用DSPC/DOTAP類(lèi)脂膜（15 mol/85 mol）包裹聚乳酸（PLA）納米粒，用以遞送mRNA疫苗，在體外轉(zhuǎn)染HeLa和DC2.4細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中獲得了比單純脂質(zhì)體更高的轉(zhuǎn)染效率，說(shuō)明在脂質(zhì)膜內(nèi)包裹固體聚合物顆粒核心可以使載體與mRNA的結(jié)合更牢固，使它們?cè)谶f送過(guò)程中不容易丟失mRNA。

Yasar等[33]制備并優(yōu)化了PLGA包覆陽(yáng)離子脂質(zhì)1，2-雙十八烯氧基-3-甲基銨丙烷的納米粒子（LPN），通過(guò)實(shí)時(shí)細(xì)胞攝取和報(bào)告基因表達(dá)的實(shí)時(shí)細(xì)胞成像，評(píng)價(jià)了與mRNA復(fù)合的該脂質(zhì)-聚合物雜化系統(tǒng)轉(zhuǎn)染DC的效率。與一種早期開(kāi)發(fā)的基于聚合物的遞送系統(tǒng)殼聚糖-PLGA納米粒進(jìn)行比較，當(dāng)2種納米粒的細(xì)胞攝取和毒性相當(dāng)時(shí)，LPN攜帶的mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)效率（約80%）顯著高于殼聚糖-PLGA納米粒（僅為約5%）。Siewert等[34]將不同比例的陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP和魚(yú)精蛋白組裝起來(lái)，制備成雜化納米粒作為mRNA的載體。其中，魚(yú)精蛋白含有大量的陽(yáng)離子L-精氨酸，能結(jié)合mRNA并保護(hù)其免受核酸酶降解，DOTAP是用于mRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)。與單獨(dú)使用脂質(zhì)/mRNA和聚合物/mRNA顆粒相比，使用不同的組裝路線、采用不同的DOTAP/魚(yú)精蛋白比例的雜化系統(tǒng)具有更高的轉(zhuǎn)染率。通過(guò)熒光素酶活性測(cè)定法和小鼠體內(nèi)生物發(fā)光顯像法對(duì)制劑的結(jié)構(gòu)特征和生物活性進(jìn)行研究，表明該制劑具有較高的生物活性。Le Moignic等[35]用α-D-三吡喃甘露糖苷（triMN）修飾脂質(zhì)-聚合物-RNA復(fù)合物（LPR），將其在小鼠皮內(nèi)注射2 d后，triMN-LPR誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的局部炎癥反應(yīng)，隨后在注射部位周?chē)囊髁馨徒Y(jié)中募集和激活了DC。編碼E7抗原的mRNA triMN-LPR免疫小鼠后，可檢測(cè)到大量的E7特異性T細(xì)胞，證明了triMN-LPR能引起有效的刺激性免疫反應(yīng)。

4 細(xì)胞穿膜肽

用于核酸遞送的多肽因包含賴(lài)氨酸和精氨酸殘基而帶正電荷，稱(chēng)為陽(yáng)離子細(xì)胞穿膜肽（CPPs），能與帶負(fù)電荷的mRNA通過(guò)靜電作用結(jié)合形成納米復(fù)合物，并有效被細(xì)胞攝取。該納米復(fù)合物被細(xì)胞攝取的可能機(jī)制為CPPs促進(jìn)細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的糖胺聚糖的聚集，并觸發(fā)微吞胞作用。CPPs具有較低的電荷密度和優(yōu)異的穿越細(xì)胞膜能力，已被廣泛用于遞送藥物、蛋白質(zhì)、pDNA和siRNA，在遞送mRNA方面也有許多探索性研究被報(bào)道。但目前只有少數(shù)多肽有效，需要開(kāi)發(fā)新的有效化合物以擴(kuò)大肽遞送系統(tǒng)的材料庫(kù)[36-37]。

Bell等[38]報(bào)道了截?cái)圄~(yú)精蛋白與名為Xentry的短CPP融合后，可以將編碼報(bào)告基因的mRNAs轉(zhuǎn)染到人類(lèi)細(xì)胞中。Udhayakumar等[37]利用一種含有兩親性RALA基序的細(xì)胞穿透肽將抗原編碼mRNA遞送至免疫細(xì)胞。RALA一端帶正電的精氨酸殘基，另一端帶中性亮氨酸殘基，可以將mRNA濃縮成納米復(fù)合物，并顯示酸性pH依賴(lài)的膜破壞特性。RALA-mRNA納米復(fù)合物可使mRNA從內(nèi)體逃逸，進(jìn)而在DC胞漿內(nèi)表達(dá)，并可以促進(jìn)體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞增殖。RALA介導(dǎo)的mRNA疫苗免疫原性高且易于生產(chǎn)，其效力優(yōu)于由陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTAP和融合脂質(zhì)DOPE組成的mRNA制劑。缺乏RALA基序的富含精氨酸的多肽與mRNA復(fù)合能力減弱，不具備體外轉(zhuǎn)染DC和體內(nèi)引起T細(xì)胞免疫的能力。Coolen等[39]用兩親性陽(yáng)離子肽（RALA、LAH4或 LAH4-L1）與mRNA形成復(fù)合物，并將該復(fù)合物吸附到聚乳酸納米顆粒（PLA-NPs）上，形成的PLA-NP/陽(yáng)離子肽/mRNA 納米復(fù)合物可以通過(guò)吞噬作用和網(wǎng)格蛋白依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用被DC攝取，并在體外誘導(dǎo)DC中目的蛋白的高表達(dá)。

5 新型載體材料

除上述載體外，也有一些新型材料被用于mRNA疫苗遞送研究，如無(wú)機(jī)納米材料、水凝膠、病毒樣顆粒等。與傳統(tǒng)材料相比，這些新型材料在提升mRNA疫苗翻譯的效率和強(qiáng)度、體內(nèi)靶向定位、長(zhǎng)效緩釋等方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。Zhang等[40]開(kāi)發(fā)了一種基于介孔二氧化硅納米粒的mRNA（MSN-mRNA）皮下給藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)由裸mRNA和咪唑-羥吲哚RNA激活蛋白激酶（PKR）抑制劑C16的皮下儲(chǔ)庫(kù)組成，在體外和體內(nèi)具有很強(qiáng)的促進(jìn)mRNA翻譯的能力。皮下注射MSN-mRNA可顯著提高裸露mRNA在體內(nèi)的翻譯和表達(dá)動(dòng)力學(xué)。將編碼卵清蛋白和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的裸露mRNA和C16@MSNs組成的MSN-mRNA疫苗配方應(yīng)用于小鼠T淋巴瘤E.G7-OVA模型，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的抑瘤作用。Yin等[41]報(bào)道了一種由氧化石墨烯（GO）和PEI組成的可注射水凝膠，用于包載編碼模式抗原卵清蛋白的mRNA（mOVA）和佐劑（R848）。該水凝膠不僅可以包裹和保護(hù)mRNA不被降解，還具有淋巴結(jié)靶向能力。這種可轉(zhuǎn)化水凝膠能顯著增加抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，該制劑可以在血清中產(chǎn)生抗原特異性抗體，從而預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。凝膠中的mOVA在體內(nèi)注射30 d后仍可檢測(cè)到，一次注射即可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明該水凝膠是一種長(zhǎng)期緩釋的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)。Li等[42]用MS2噬菌體衣殼包裝mRNA疫苗，制備成了重組噬菌體MS2病毒樣顆粒（VLP），用于前列腺癌（PCA）的免疫治療。VLP中包裝的mRNA在被巨噬細(xì)胞吞噬12 h后即可翻譯成蛋白質(zhì)，能夠克服自身耐受性，激活DC，誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是CTL反應(yīng)，可以在不上調(diào)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的情況下平衡Ⅰ型輔助性T細(xì)胞/Ⅱ型輔助性T細(xì)胞（Th1/Th2）應(yīng)答，可完全保護(hù)小鼠免受PCA的侵襲，具有強(qiáng)大的腫瘤抑制作用。

6 傳統(tǒng)載體材料的局限性

雖然已有許多研究報(bào)道用于mRNA疫苗遞送的脂質(zhì)、聚合物、肽類(lèi)等載體，但這些材料仍然存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。如一些陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚合物與mRNA的結(jié)合過(guò)于緊密，導(dǎo)致mRNA釋放困難。LNPs中脂質(zhì)的不飽和度、各組分的比例等需要更加精確的設(shè)計(jì)以提升遞送效率。PEI等聚合物大分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，聚合度較難控制，組成高分子鏈單元的相對(duì)分子質(zhì)量和排列變異性大，不同合成批次之間差異較大。一些聚合物在體內(nèi)具有較大毒性。遞送載體的穩(wěn)定性和包封率也需要進(jìn)一步提升。另一方面，人和動(dòng)物模型的免疫系統(tǒng)存在差異，盡管有些材料在動(dòng)物研究中能引起有效的免疫反應(yīng)，但這些材料能否在人體內(nèi)獲得與動(dòng)物體內(nèi)相同的免疫效果，是否會(huì)出現(xiàn)新的毒副作用仍有待考察。

mRNA疫苗遞送要求以更全面的研究思路設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新型遞送載體材料和遞送系統(tǒng)。要對(duì)載體介導(dǎo)的遞送過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)研究，掌握規(guī)律，設(shè)計(jì)和優(yōu)化以增強(qiáng)內(nèi)體逃逸，提高轉(zhuǎn)染效率為目的的新載體，促進(jìn)保護(hù)性免疫反應(yīng)。掌握疫苗靶向遞送機(jī)制和規(guī)律，設(shè)計(jì)和優(yōu)化載體表面修飾方法，提高mRNA的靶向遞送效率，增強(qiáng)免疫效力，減輕毒副作用。根據(jù)有效荷載的不同對(duì)mRNA和遞送材料的組裝進(jìn)行優(yōu)化，以高度可控且可重復(fù)性的方式對(duì)組分進(jìn)行裝載。對(duì)比不同的遞送技術(shù)平臺(tái)，為設(shè)計(jì)滿足不同mRNA疫苗免疫需求的最佳遞送載體以及預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫應(yīng)答提供有價(jià)值的指導(dǎo)。最后，需要在人體試驗(yàn)中綜合評(píng)價(jià)給藥途徑、載藥劑量、給藥頻率等以確定免疫反應(yīng)的最佳參數(shù)，并在保證疫苗效力的同時(shí)優(yōu)化載體的安全性[36]。

7 結(jié)語(yǔ)與展望

mRNA疫苗是一種治療和預(yù)防傳染病、防治癌癥的新型疫苗。mRNA疫苗需要在載體的幫助下有效地發(fā)揮作用。mRNA疫苗遞送系統(tǒng)需要達(dá)到以下幾個(gè)要求：包埋效率高且能保護(hù)mRNA不被水解酶降解；能將疫苗遞送至靶細(xì)胞，并高效地釋放mRNA至細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯；毒性小，不使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)或毒副作用。以脂質(zhì)納米粒為代表的非病毒載體遞送系統(tǒng)，可以有效負(fù)載mRNA并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)特異性抗體，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，在應(yīng)對(duì)COVID-19感染中顯示出良好的臨床效果。同時(shí)，通過(guò)緊急授權(quán)使用后的臨床結(jié)果也證實(shí)了以脂質(zhì)納米粒作為載體遞送mRNA疫苗具有較高的安全性。但mRNA疫苗極其不穩(wěn)定，在室溫下很快降解失效，需要超低溫保存，儲(chǔ)存條件苛刻。因此，mRNA疫苗的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題仍有待解決。總之，研制能夠靶向定位、穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性小、易于儲(chǔ)存的新型非病毒載體，是未來(lái)mRNA疫苗遞送研究的目標(biāo)，同時(shí)也具有很好的臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用價(jià)值。