徐大釗 林育林 馬茹 李曌 閆風(fēng)彩 趙鑫 陳佳梅 李雁

腹膜假黏液瘤（pseudomyxoma peritonei，PMP）是一種以黏蛋白持續(xù)分泌為主要臨床病理特征的惡性腫瘤綜合征[1]。鳥苷酸結(jié)合蛋白α亞基基因（guanine nucleotide binding protein alpha stimulating，GNAS）突變?yōu)镻MP中的高頻突變[2]，導(dǎo)致鳥苷酸結(jié)合蛋白α亞基[guanine nucleotide binding protein G（s） subunit alpha，Gsα]中三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性降低，使GTP與Gsα蛋白持續(xù)結(jié)合，激活環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）信號(hào)傳導(dǎo)通路，激活黏蛋白2（Mucin2，MUC2）基因，致黏液持續(xù)分泌。本研究探討Gsα蛋白表達(dá)與PMP臨床病理特征的相關(guān)性，探索PMP診療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

納入首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床病理信息完整的65例PMP患者，臨床病理資料包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、既往治療史、卡氏（Karnofsky performance status score，KPS）評(píng)分、腫瘤標(biāo)志物；PCI評(píng)分、CC評(píng)分、腹水量；組織病理分級(jí)、Ki-67、p53、黏蛋白家族（MUC1、MUC2、MUC5AC、MUC6）；生存狀態(tài)、總生存期。

1.2 方法

1.2.1 HE染色和免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 10%中性甲醛液固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色（DAKO全自動(dòng)HE染色機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司）。免疫組織化學(xué)采用4 μm切片脫石蠟，在分級(jí)系列的乙醇中再水化，并在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中微波處理10 min，使用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，使用標(biāo)準(zhǔn)方案在自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)（DAKO全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司）中處理組織。免疫組織化學(xué)抗體：MUC-1（克隆號(hào)EP85，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司），MUC-2（克隆號(hào)Ccp58，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司），MUC-5AC（克隆號(hào)EP362，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司），MUC-6（克隆號(hào)MRQ-20，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司），GNAS抗體（克隆號(hào)OTI7A6，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），Ki-67（克隆號(hào)UMAB107，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司，），p53（克隆號(hào)DO7，購(gòu)自美國(guó)OriGene公司）。所有抗體在室溫下孵育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺顯色，并用Mayer蘇木精對(duì)比染色。按照說明書設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定 PMP組織病理分級(jí)：按照腹膜表面腫瘤國(guó)際聯(lián)盟（Peritoneal Surface Oncology Group International，PSOGI）（2016）標(biāo)準(zhǔn)[3]分4類：1）無細(xì)胞性黏液；2）腹膜低級(jí)別黏液癌；3）腹膜高級(jí)別黏液癌；4）腹膜高級(jí)別黏液癌伴印戒細(xì)胞。

1.2.3 基于IPP 6.0的Gsα蛋白半定量評(píng)估 圖像采集：首先，由一位高年資病理醫(yī)師選擇每例患者最具診斷代表性的1張Gsα蛋白IHC切片。Gsα蛋白以胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色或深棕色顆粒定義為陽(yáng)性（+）。其次，在低倍鏡（×100）下選擇腫瘤細(xì)胞最密集的熱點(diǎn)區(qū)；最后，于熱點(diǎn)區(qū)高倍鏡下（×400），逆時(shí)針選擇右上、左上、左下、右下、中央5個(gè)視野。所有圖片均經(jīng)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)處理（包括背景顏色、標(biāo)尺、測(cè)量參數(shù)）[4]后采用IPP 半定量評(píng)估。

染色強(qiáng)度的IPP半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：勾畫每一個(gè)視野中獨(dú)立癌巢的邊界；以平均光密度值（mean integrated optical density，mIOD）描述Gsα蛋白染色強(qiáng)度，計(jì)算mIOD值（癌巢陽(yáng)性IOD值/癌巢陽(yáng)性面積）。收集每張切片5個(gè)視野mIOD值，取平均值，根據(jù)其四分位數(shù)（25%、50%、75%）分為4個(gè)區(qū)間，規(guī)定＜25%者為1分；25%～50%者2分；50%～75%者3分；≥75%者4分[5]。

染色范圍的IPP半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：以染色陽(yáng)性面積比（positive area ratio，PAR）描述Gsα蛋白染色范圍：計(jì)算PAR（癌巢陽(yáng)性面積/癌巢面積）。收集每張切片5個(gè)視野PAR值，取平均值，根據(jù)其四分位數(shù)（25%、50%、75%）分為4個(gè)區(qū)間，規(guī)定＜ 25%者為1分；25%～50%者2分；50%～75%者3分；≥75%者4分[5]。

Gsα蛋白染色特征的IPP半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：采用染色強(qiáng)度+范圍的綜合評(píng)分，根據(jù)mIOD值和PAR值的總分（2～8分，中位5分），規(guī)定≥5分為高表達(dá)，＜5分為低表達(dá)。

1.2.4 隨訪 包括生存狀態(tài)和總生存期?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為臨床發(fā)病日期至疾病相關(guān)死亡日或隨訪截止日期，末次統(tǒng)一電話隨訪或門診隨訪日期為2021年12月31日，隨訪率為100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法；二分類變量的多因素相關(guān)性分析采用Logistic回歸；生存分析采用Kaplan-Meier生存函數(shù)、Log-rank檢驗(yàn)、Cox回歸模型；采用單因素和多因素分析方法篩選影響生存的獨(dú)立預(yù)后因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 65例PMP主要臨床病理特征

65例患者中位年齡56（29～75）歲，男性24例（36.9%），女性41例（63.1%），KPS評(píng)分中位90（70～100）分，BMI中位22.8（15.2～34.4）kg/m2。術(shù)中腹水量中位600（0～10 000）mL，PCI評(píng)分中位30（3～39）分，術(shù)后CC評(píng)分中位1（0～3）分。低級(jí)別PMP 35例（53.8%），高級(jí)別或高級(jí)別伴印戒細(xì)胞PMP 30例（46.2%），脈管瘤栓4例（6.2%），神經(jīng)侵犯3例（4.6%），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例（6.2%）。

2.2 Gsα蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究

2.2.1 Gsα蛋白定位和定性表達(dá) Gsα蛋白在PMP組織中表達(dá)部位主要集中在胞膜/胞漿，呈棕色或深棕色顆粒狀或彌漫型表達(dá)，而黏蛋白和細(xì)胞核不著色。

2.2.2 Gsα蛋白半定量表達(dá)分析 1）染色強(qiáng)度評(píng)分結(jié)果：根據(jù)IPP 6.0軟件分析，染色強(qiáng)度中位mIOD值為207.82（120.29～296.93）。按照四分位數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，mIOD值120.29～178.61為1分，有16例（24.6%），染色特征為棕黃色顆粒狀分布（圖1A）；mIOD值178.61～207.82為2分，有16例（24.6%），染色特征為棕紅色，彌漫型分布（圖1B）；mIOD值207.82～250.07為3分，有17例（26.2%），染色特征為深棕色彌漫型密集不均分布（圖1C）；mIOD值250.07～296.93為4分，有16例（24.6%），染色特征為棕褐色彌漫型密集一致分布（圖1D）。

圖1 基于mIOD值的Gsα蛋白表達(dá)強(qiáng)度特征 （IHC× 400）

2）染色范圍評(píng)分結(jié)果：根據(jù)IPP 6.0軟件分析，染色范圍中位PAR值為0.63（0.41～0.86）。按照四分位數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，PAR值0.41～0.57為1分，有16例（24.6%），特征：胞漿內(nèi)較多黏液，染色陽(yáng)性范圍最?。▓D2A）；PAR值0.57 ～ 0.63為2分，有17例（26.2%），特征：胞漿內(nèi)黏液減少，染色陽(yáng)性范圍有所增大（圖2B）；PAR值0.63～0.71為3分，有15例（23.1%），特征：胞漿內(nèi)較少黏液，染色陽(yáng)性范圍明顯增大（圖2C）；PAR值0.71～0.86為4分，有17例（26.2%），特征：胞漿內(nèi)最少黏液，染色陽(yáng)性范圍最大（圖2D）。

圖2 基于PAR值的Gsα蛋白表達(dá)范圍特征 （IHC× 400）

3）Gsα蛋白表達(dá)綜合評(píng)分結(jié)果：將上述強(qiáng)度評(píng)分加范圍評(píng)分，得到Gsα蛋白表達(dá)的綜合評(píng)分（表1）。其中Gsα蛋白高表達(dá)（≥ 5分）35例（53.8%），低表達(dá)（＜5分）30例（46.2%）。在Gsα蛋白表達(dá)綜合評(píng)分（2～8）范圍，高級(jí)別或高級(jí)別伴印戒細(xì)胞的組織病理分級(jí)所占比重分別為33.3%、36.4%、25.0%、33.3%、66.7%、66.7%、80.0%（圖3）。伴隨Gsα蛋白綜合評(píng)分的增高，高級(jí)別或高級(jí)別伴印戒細(xì)胞的組織病理分級(jí)所占比重有增高趨勢(shì)。

圖3 基于IPP 6.0軟件測(cè)算Gsα蛋白表達(dá)與組織病理分級(jí)的相關(guān)性

表1 Gsα蛋白表達(dá)綜合評(píng)分結(jié)果

2.3 Gsα蛋白表達(dá)與PMP臨床病理特征的相關(guān)性分析

單因素分析顯示，Gsα蛋白高表達(dá)與下列5個(gè)臨床病理指標(biāo)呈正相關(guān)：術(shù)前腫瘤標(biāo)志物（χ2=3.68，P=0.087）、術(shù)中腹水量（χ2= 3.69，P=0.055）、腹膜癌指數(shù)評(píng)分（peritoneal cancer index，PCI）（χ2=3.12，P=0.077）、腫瘤細(xì)胞減滅程度評(píng)分（completeness of cytoreduction，CC）（χ2=2.72，P=0.099）、組織病理分級(jí)（χ2=5.85，P=0.016）。多因素分析顯示，Gsα蛋白高表達(dá)僅與1個(gè)病理指標(biāo)呈獨(dú)立正相關(guān)：高級(jí)別或高級(jí)別伴印戒細(xì)胞的組織病理類型（OR=3.47，95%CI：1.1～15.6，P=0.029）。

2.4 PMP預(yù)后的相關(guān)性分析

中位隨訪時(shí)間26.8個(gè)月（95%CI：15.0～38.6個(gè)月）。21例（32.3%）死亡，44例（67.7%）生存，中位OS為79.4個(gè)月（95%CI：44.6～114.2個(gè)月）。1、2、3、5年生存率分別為96.7%、89.9%、79.4%、55.1%（圖4A）。

單因素生存分析顯示，影響PMP預(yù)后的主要臨床病理特征包括：年齡（P=0.041，圖4B）、既往手術(shù)（P=0.028，圖4C）、神經(jīng)侵犯（P=0.006，圖4D）、病理分級(jí)（P=0.026，圖4E）、Gsα蛋白表達(dá)（P=0.022，圖4F）。多因素分析顯示，年齡、既往手術(shù)、病理分級(jí)和Gsα蛋白表達(dá)為獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

表2 65例PMP患者多因素生存分析

3 討論

PMP臨床病理的主要特征是黏蛋白的持續(xù)分泌。黏蛋白的過度分泌有利于包裹腫瘤細(xì)胞并提供適宜腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境[6]，過度分泌的黏蛋白呈進(jìn)行性積聚和硬化，導(dǎo)致惡性腸梗阻[7]，為PMP的主要臨床死因[8]。

PMP中啟動(dòng)黏蛋白持續(xù)分泌的分子機(jī)制主要是GNAS基因突變[9-12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道GNAS基因在PMP中的突變率為40%～77%[13-14]，為PMP高頻突變。GNAS基因突變導(dǎo)致Gsα蛋白持續(xù)活化與表達(dá)，并激活cAMP-PKA-CREB信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)MUC2基因表達(dá)，導(dǎo)致黏蛋白分泌持續(xù)亢進(jìn)，被認(rèn)為可能是PMP發(fā)生、發(fā)展的核心分子病理機(jī)制[2,15]。故探索Gsα蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性研究，有可能為PMP治療提供新的線索，有助于PMP的臨床風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)和預(yù)后評(píng)估。

本研究定量分析65例PMP臨床病理標(biāo)本的Gsα蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Gsα蛋白高表達(dá)與高級(jí)別或高級(jí)別伴印戒細(xì)胞的組織病理分級(jí)呈顯著正相關(guān)。2016年P(guān)SOGI關(guān)于PMP組織病理分級(jí)的共識(shí)認(rèn)為，腹膜高級(jí)別黏液癌的組織病理特點(diǎn)即包括腫瘤性黏液上皮豐富（占腫瘤體積＞20%），因此本研究從分子病理方面證實(shí)腹膜高級(jí)別黏液癌或高級(jí)別黏液癌伴印戒細(xì)胞富集黏液性上皮的組織病理特點(diǎn)。

生存分析顯示影響PMP預(yù)后的主要臨床病理特征包括年齡、既往手術(shù)、神經(jīng)侵犯、組織病理分級(jí)、Gsα蛋白表達(dá)，其中年齡、既往手術(shù)、神經(jīng)侵犯、病理分級(jí)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-19]。神經(jīng)侵犯、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是多種實(shí)體瘤最典型的組織病理學(xué)核心特征，體現(xiàn)腫瘤的侵襲性，也可表征PMP的腫瘤生物學(xué)行為[7]。Gsα蛋白高表達(dá)在該研究中證實(shí)為PMP獨(dú)立預(yù)后因素，證實(shí)Gsα蛋白高表達(dá)促進(jìn)黏蛋白的持續(xù)分泌，提示不良預(yù)后。Gsα蛋白高表達(dá)構(gòu)成了PMP組織病理分級(jí)、黏蛋白持續(xù)分泌、不良預(yù)后的共同分子病理基礎(chǔ)。

目前臨床中缺乏Gsα蛋白免疫組織化學(xué)定性、定量表達(dá)的診斷共識(shí)。本研究基于IPP病理圖像分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和既往研究結(jié)果，對(duì)Gsα蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行了客觀定量，創(chuàng)新性的提出mIOD、PAR兩個(gè)量化指標(biāo)來綜合評(píng)價(jià)Gsα蛋白表達(dá)，結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道與臨床預(yù)后較一致[7,20]。

總之，本研究采用定量免疫組織化學(xué)方法研究Gsα蛋白表達(dá)與PMP主要臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Gsα蛋白高表達(dá)者腫瘤的惡性生物學(xué)行為更強(qiáng)，與PMP預(yù)后相關(guān)，提示Gsα蛋白可作為干預(yù)治療的靶點(diǎn)。