邱婷婷 周夢(mèng) 肖明兵 瞿利帥 倪潤(rùn)洲 劉金霞

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的第三大原因[1]。多數(shù)患者早期無(wú)明顯癥狀且缺乏有效的篩查方法，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肝癌患者高死亡率和預(yù)后不良的現(xiàn)狀與缺乏早期篩查手段、晚期治療靶標(biāo)密切相關(guān)[2]，因此，迫切需要研發(fā)新型生物標(biāo)志物用于肝癌的診斷和治療預(yù)后評(píng)估。

ANXA2 是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮極其重要的作用[3]。ANXA2可通過(guò)與t-Pa和S100A10結(jié)合激活纖溶系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤的侵襲性[4]。此外，ANXA2在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的微結(jié)構(gòu)的重塑，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。ANXA2也可以通過(guò)促進(jìn)新生血管的形成影響腫瘤的進(jìn)展[6]。ANXA2有助于維持腫瘤細(xì)胞的惡性表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。

RACK1是Trp-Asp (tryptophane-asparagine）重復(fù)序列家族的成員，是一種可影響腫瘤進(jìn)展的多功能支架蛋白，廣泛存在于各種真核生物中[7-8]。RACK1可通過(guò)促進(jìn) ANXA2 Tyr23（tyrosine 23）磷酸化增強(qiáng)耐藥性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[9]。迄今為止，聯(lián)合檢測(cè)ANXA2 和 RACK1在HCC組織中的表達(dá)及意義鮮見報(bào)道。

本研究 ANXA2 和 RACK1 在HCC及癌旁組織中的表達(dá)水平，探討兩者的表達(dá)與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析聯(lián)合檢測(cè)在HCC患者預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集自2010年1月至2011年12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院行HCC根治性切除術(shù)100例患者的HCC石蠟標(biāo)本。所有患者術(shù)前未進(jìn)行化療、放療或者其他治療，且手術(shù)切除標(biāo)本病理診斷明確，具有完整的臨床病理資料，切緣均＞1 cm。100例患者中，男性82例，女性18例；年齡28～64 歲，中位年齡 53 歲。根據(jù)Edmondson 分級(jí)系統(tǒng)，將腫瘤的組織學(xué)分級(jí)分為高分化、中分化和低分化[10]。腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期根據(jù)2010 AJCC HCC 分期系統(tǒng)定義[11]。肝細(xì)胞癌患者的臨床和病理診斷符合美國(guó)肝臟病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 將HCC及癌旁組織石蠟包埋制成組織芯片，經(jīng)過(guò)烘片、脫蠟和水化后，浸泡在枸櫞酸鈉緩沖溶液中，高壓鍋熱修復(fù)約10 min，冷卻至室溫后，PBS 沖洗后滴加封閉液，室溫 2 h。將組織芯片與小鼠一抗ANXA2 抗體（1∶1 000，購(gòu)自美國(guó)Santa公司）RACK1抗體（1∶50，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司）在4℃孵育過(guò)夜。用 PBS 洗滌后，以 1∶2 500 的稀釋度滴加二抗，孵育 15 min，并用 PBS 洗滌后DAB顯色，用蘇木精進(jìn)一步染色，將組織芯片依次放于0.1%HCL分化，梯度酒精、二甲苯脫水，中性樹膠封片鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定 在HCC細(xì)胞質(zhì)中可檢測(cè)到 ANXA2 和 RACK1 染色為陽(yáng)性，呈黃色和棕黃色顆粒。通過(guò)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和陽(yáng)性染色強(qiáng)度的組合來(lái)評(píng)估ANXA2 和 RACK1 的表達(dá)水平。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淺黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比，將染色程度分為5個(gè)等級(jí)：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%）和 4分（76%～100%）。強(qiáng)度和范圍得分的相乘被認(rèn)為是免疫組織化學(xué)的總得分?；谏鲜鰳?biāo)準(zhǔn)，將具有 ANXA2 或RACK1表達(dá)的組織分為兩組：低表達(dá)（0～3分）和高表達(dá)（4～12分）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)χ2檢驗(yàn)評(píng)估ANXA2和RACK1的表達(dá)水平與臨床特征之間的相關(guān)性。多因素 Cox 比例分析用于評(píng)估潛在的預(yù)后和復(fù)發(fā)因素，并計(jì)算 95%的可信度區(qū)間（CI）。使用 Kaplan-Meier 生存曲線評(píng)估 ANXA2 和 RACK1與預(yù)后的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者特征

本研究共包括100 例經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌的患者。

2.2 ANXA2 和 RACK1 的表達(dá)

本研究選擇了100對(duì)肝癌組織和鄰近的正常組織進(jìn)行IHC分析。在100例組織中，ANXA2在HCC組織中的表達(dá)（42%）明顯高于鄰近正常組織（11%，P＜0.001），RACK1在HCC組織中的表達(dá)（38%）明顯高于鄰近正常組織（18%，P=0.002）。IHC結(jié)果表明，ANXA2和RACK1在HCC組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃或棕褐色，兩者在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.001，P=0.002），且隨著腫瘤組織學(xué)分級(jí)的增高，表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加（表1，圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)ANXA2和RACK1在HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá) （IHC×400）

表1 ANXA2 和 RACK1 的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系 例

2.3 ANXA2 和 RACK1 表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

根據(jù)ANXA2和RACK1表達(dá)情況，分為低表達(dá)和高表達(dá)組，進(jìn)一步分析 ANXA2 和 RACK1 的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性（表1）。結(jié)果顯示ANXA2 表達(dá)強(qiáng)度與 AFP（P=0.027）、腫瘤大?。≒=0.018）、脈管癌栓（P=0.035）、腫瘤分化（P＜0.001）和 TNM 分期（P＜0.001）間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與性別、年齡、腫瘤數(shù)目、HBV 感染、Child 分級(jí)和肝硬化等因素均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。此外，RACK1表達(dá)與腫瘤分化（P＜0.001）、脈管癌栓（P=0.009）和TNM 分期（P＜0.001）間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其他臨床病理特征之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。進(jìn)一步分析 ANXA2 和 RACK1的共表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果表明ANXA2/RACK1 的高表達(dá)與腫瘤分化（P＜0.001）、TNM 分期（P＜0.001）和脈管癌栓（P=0.035）相關(guān)。雙變量Kendall檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ANXA2和RACK1的表達(dá)水平存在顯著的正相關(guān)（Z=0.419，P＜0.01）。

2.4 ANXA2 和 RACK1 表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的影響

經(jīng)Kaplan-Meier法分析，ANXA2 和 RACK1高表達(dá)組患者生存率明顯降低，兩者在HCC中的高表達(dá)與患者總生存率的降低相關(guān)（P＜0.05，圖2A）。且ANXA2-/RACK1-患者的總體生存率顯著高于ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2+/RACK1+的患者（圖2A）。因此，聯(lián)合檢測(cè)ANXA2 和RACK1 的表達(dá)在患者預(yù)后分析中具有重要臨床意義。單因素分析提示脈管癌栓（P=0.002）、腫瘤分化（P=0.015）、TNM 分期（P＜0.001）、ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2/ RACK1共表達(dá)（P＜0.001）與患者總體生存時(shí)間相關(guān)。多因素分析提示ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2 /RACK1 的共表達(dá)（P=0.043）是預(yù)測(cè)總體生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，ANXA2/RACK1聯(lián)合表達(dá)的增加與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良相關(guān)。

2.5 ANXA2和RACK1的表達(dá)對(duì)HCC患者復(fù)發(fā)的影響

ANXA2/RACK1 高表達(dá)患者累積復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)ANXA2/RACK1患者（PANXA2＜0.001，PRACK1＜0.001，圖2B）。提示ANXA2和RACK1促進(jìn)肝細(xì)胞癌患者的復(fù)發(fā)。在 12 例早期復(fù)發(fā)患者（復(fù)發(fā)時(shí)間＜12個(gè)月）中，11 例高表達(dá) ANXA2（11/12，91.7%）和RACK1 (11/12，91.7%，表2）。與 ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2-/RACK1-患者相比，ANXA2+ /RACK1+患者總是伴隨更早的復(fù)發(fā)（圖2B）。單因素分析顯示脈管癌栓（P=0.008）、腫瘤分化（P=0.011）、TNM 分期（P＜0.001）、ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）和 ANXA2/RACK1共 表 達(dá)（P＜0.001，表2）與復(fù)發(fā)時(shí)間相關(guān)。多因素分析顯示ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2/RACK1 的共表達(dá)（P=0.008）是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)時(shí)間的獨(dú)立因素（表3）。 ANXA2/RACK1的共表達(dá)是預(yù)測(cè)HCC患者總體生存和復(fù)發(fā)時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素，且兩者的聯(lián)合檢測(cè)可SS以更好地預(yù)測(cè)患者的生存及復(fù)發(fā)（表4）。

表2 肝癌患者總生存時(shí)間及復(fù)發(fā)時(shí)間的單因素分析

表2 肝癌患者總生存時(shí)間及復(fù)發(fā)時(shí)間的單因素分析 （續(xù)表2）

表3 肝癌患者總生存時(shí)間及復(fù)發(fā)時(shí)間的多因素分析

表4 ANXA2和RACK1的表達(dá)與復(fù)發(fā)之間的關(guān)系

圖2 ANXA2和RACK1不同表達(dá)的HCC患者生存與復(fù)發(fā)情況

3 討論

肝細(xì)胞癌患者具有較高的發(fā)病率和高死亡率[13]。研究表明不同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了HCC的細(xì)胞增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移，包括Wnt/β-Catenin 途徑、Ras/Raf/MAPK途徑、PI3/AKT/ mTOR 途徑和 JAK/STAT 途徑等[14-16]。靶向治療通過(guò)抑制HCC中的特定分子及其下游信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。索拉非尼在延長(zhǎng)晚期HCC患者的壽命中起重要作用，是臨床上廣泛使用的代表性靶向藥物，其通過(guò)阻斷生長(zhǎng)因子的酪氨酸激酶受體發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。因此，尋找在HCC發(fā)生發(fā)展中起作用的新型基因，探尋其對(duì)預(yù)后的價(jià)值以及新的治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。本研究初步探討ANXA2/RACK1在HCC組織中的表達(dá)水平與患者的臨床病理因素之間的關(guān)系，分析兩者聯(lián)合檢測(cè)在患者預(yù)后判斷中的價(jià)值。

ANXA2廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)膜下、核內(nèi)、細(xì)胞外基質(zhì)及儲(chǔ)存離子的細(xì)胞器周圍，在不同物種中的結(jié)構(gòu)高度保守[19]。ANXA2 結(jié)構(gòu)上包含3個(gè)功能不同的區(qū)域，其中N端具有 Ser11（serine 11）、Ser25 和 Tyr23磷酸化位點(diǎn)，這3個(gè)不同的位點(diǎn)磷酸化后發(fā)揮不同的功能，共同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20-21]。Tyr23磷酸化后，促進(jìn)STAT3入核加快乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且通過(guò)與RACK1 相互作用來(lái)調(diào)節(jié)乳腺癌的多重耐藥性[22-23]有趣的是，ANXA2存在HCC和肝硬化組織中，而磷酸化 ANXA2 僅在HCC組織中檢測(cè)到，其潛在機(jī)制需要進(jìn)一步研究[22]。

RACK1具有7個(gè)WD40 重復(fù)的螺旋槳結(jié)構(gòu)，與G蛋白β亞基具有高度同源性，可作為支架蛋白發(fā)揮作用，與激酶、受體和病毒相互結(jié)合，參與各種細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)答[24]。RACK1與 FAK 和三維纖維膠原蛋白基質(zhì)中的細(xì)絲蛋白、波形蛋白相互作用，促進(jìn)腫瘤血管生成[25]。進(jìn)一步研究表明RACK1 作為介導(dǎo)細(xì)胞相互作用的信號(hào)橋，通過(guò)與Src相互作用促進(jìn)ANXA2的磷酸化，即ANXA2 酪氨酸磷酸化由Src介導(dǎo)以RACK1依賴的方式進(jìn)行，進(jìn)而促進(jìn)耐藥性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[26-27]。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn) ANXA2 和 RACK1 在肝細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)，多因素Cox 回歸分析表明ANXA2、RACK1 和 ANXA2/RACK1高表達(dá)是預(yù)測(cè)患者總體生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素，ANXA2、RACK1 和 ANXA2/RACK1 高表達(dá)有助于對(duì)復(fù)發(fā)時(shí)間的預(yù)測(cè)。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，ANXA2-/RACK1-患者的總體生存率顯著高于ANXA2 +/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2+/RACK1 +的患者，與ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2-/Rack1-患 者 相 比，ANXA2+/RACK1+患者易于更早期復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示ANXA2/RACK1與HCC患者預(yù)后不良和早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是HCC基因治療潛在的靶點(diǎn)。但是ANXA2協(xié)同RACK1參與HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍需要在HCC細(xì)胞系中進(jìn)行深入研究。