張默涵 葛振宇 譚楊 谷金華 史立宏 張小茜

近年來(lái)，隨著中國(guó)人群飲食結(jié)構(gòu)與生活方式逐漸西方化，相關(guān)癌癥（結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌）發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌近年來(lái)已成為全球，尤其是中國(guó)的常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。大多數(shù)散發(fā)的結(jié)直腸癌遵循常規(guī)的“正常-腺瘤-癌”序列，與在特定進(jìn)展階段發(fā)生的特定突變相關(guān)[2]。在分子水平上，有研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）可通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[3-4]。

大量的證據(jù)表明結(jié)直腸癌發(fā)生與腸道菌群、遺傳和其他因素密切相關(guān)[5-6]。有研究顯示，多種腸道菌群與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)，但特異菌仍未明確。有研究表明，在結(jié)直腸癌患者的糞便中Prevotellaceae、Fusobacterium和Peptostreptococcus等菌群顯著升高[7]。

本研究旨在尋找與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的特定腸道菌群，通過(guò)16srRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)健康對(duì)照組、腺瘤性息肉組和結(jié)直腸癌組的腸道菌群進(jìn)行比較，并檢測(cè)3組樣本腸道組織的IL-6的表達(dá)，以評(píng)估腸道菌群對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)展的影響，為進(jìn)一步臨床治療策略的確定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選取2020年1月至2021年5月于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的40例患者，根據(jù)疾病類(lèi)型分為C組（20例結(jié)直腸癌患者）、A組（20例腺瘤性息肉患者）。另外，篩選于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)胃腸鏡健康查體的就診者20例，設(shè)為N組作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有結(jié)直腸癌與腺瘤性息肉的診斷均由至少2名專(zhuān)業(yè)醫(yī)師依據(jù)結(jié)腸鏡表現(xiàn)與病理結(jié)果進(jìn)行診斷。2）年齡在18～70歲，過(guò)去近6個(gè)月無(wú)抗生素與益生菌服用史。3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）具有其他胃腸道疾病或具有糖尿病、高血壓、肥胖癥、結(jié)石及各種存在肝、臟嚴(yán)重原發(fā)性疾病患者、精神疾病障礙不能耐受腸鏡檢查者；2）標(biāo)本收集前3個(gè)月應(yīng)用抗生素或益生菌的；3）依從性差，難以隨訪的患者。4）具有3年及以上酗酒史的。所有參加研究的受試者都被告知研究性質(zhì)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集和DNA提取 所有糞便樣本均采用無(wú)菌糞便盒收集，收集后分類(lèi)編號(hào)并于2 h內(nèi)置于-80℃冰箱儲(chǔ)存，以準(zhǔn)備進(jìn)一步提取DNA。使用Power Soil DNA提取試劑盒（MO Bio Laboratories公司，購(gòu)自北京）按照說(shuō)明書(shū)的操作規(guī)程從樣品中提取細(xì)菌總DNA。以260 nm/280 nm和260 nm/230 nm的比值評(píng)價(jià)DNA的質(zhì)量和數(shù)量。然后將DNA保存在-80℃，等待下一步處理。

用通用引物對(duì)（正向引物：5’-ACTCCTACGGG AGGCAGCA-3’；反向引物：5‘-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3’）結(jié)合適配序列和條碼序列，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增總體積為50 μL，包括10 μL Buffer，0.2 μL Q5高保真DNA聚合酶，10 μL高GC增強(qiáng)子，1 μL dNTP，每個(gè)引物10 μM，60 ng基因組DNA。熱循環(huán)條件為：在95℃下初始變性5 min，然后在95℃下變性1 min，在50℃下變性1 min，在72℃下加熱1 min，最后在72℃下延伸7 min。第1輪的PCR產(chǎn)物通過(guò)VahtsTM DNA清潔珠純化。第2輪PCR在40 μL反應(yīng)中進(jìn)行，該反應(yīng)包含20 μL 2×Phμsion HF MM、8 μL ddH2O、每種引物10 μM和第1輪的PCR產(chǎn)物10 μL。熱循環(huán)條件如下：首先在98℃下變性30 s，然后在98°C下變性10 s，65℃變性30 s，72℃變性30 s，在72℃下延長(zhǎng)5 min。最后用Quant-itTMdsdna-hs試劑對(duì)所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并匯集在一起。利用中國(guó)北京Biomarker Technologies Corporation的Illumina HiSeq 2 500平臺(tái)（2×250對(duì)末端）對(duì)純化的混合樣品進(jìn)行細(xì)菌rRNA基因的高通量測(cè)序分析。物種鑒定和分類(lèi)細(xì)菌 16S：使用Silva（Release128，http：//www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物種鑒定和分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-6在3組腸道組織的表達(dá) C組取材于結(jié)直腸癌患者術(shù)后的腫瘤組織，A組取材于腸鏡下所取的腺瘤性息肉患者的息肉組織，N組取材于健康體檢者的腸壁組織。將收集的C組、A組、N組的組織進(jìn)行固定、包埋，利用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)3組組織樣本IL-6的表達(dá)情況，IL-6定位于細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性。染色結(jié)果判定采用半定量結(jié)果判斷：每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度：細(xì)胞無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為0分， 5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比和陽(yáng)性強(qiáng)度兩項(xiàng)相乘，得到該視野的最終得分。每張切片的得分為該切片選取的5個(gè)視野得分的平均值。最后該切片按照得分為下述4個(gè)等級(jí)：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為陽(yáng)性（++），8分以上為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。統(tǒng)計(jì)學(xué)上把強(qiáng)陽(yáng)性（+++）與陽(yáng)性（++）所占比率稱(chēng)為為陽(yáng)性率。

1.2.3 觀察指標(biāo) 1）α多樣性分析：α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，其中度量菌群豐度的指標(biāo)：Chao1指數(shù)；度量菌群多樣性的指標(biāo)：香農(nóng)指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)越大說(shuō)明群落多樣性越高。

2）β多樣性分析：β多樣性分析用于比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。基于binary_jaccard等算法呈現(xiàn)物種多樣性的矩陣；基于R語(yǔ)言平臺(tái)繪制主坐標(biāo)分析（PCoA），通過(guò)主坐標(biāo)分析實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的分類(lèi)，進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異；UPGMA分析，樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，說(shuō)明兩個(gè)樣品的物種組成越相似；Anosim分析，可以對(duì)不同分組的樣品之間beta多樣性是否有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。

3）LefSe和Metastats分析：LefSe分析，即組間差異顯著物種分析（或biomarkers分析），采用線性判別分析（LDA）來(lái)估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，該分析目的為找到組間在豐度上有顯著性差異的物種。Metastats分析，對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)得到P值，并對(duì)P值進(jìn)行校正得到Q值；最后根據(jù)P值（或Q值）篩選出導(dǎo)致兩組樣品組成差異的物種，P＜0.05，Q＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件用于所有統(tǒng)計(jì)分析和圖表構(gòu)建。使用t檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估微生物分類(lèi)群、臨床參數(shù)和多樣性指數(shù)差異的顯著性，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，多樣本率的比較采用KrusKal-Wallis秩和檢驗(yàn)法（H檢驗(yàn)法）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同樣本間菌群的豐度差異

隨著測(cè)序條數(shù)的加大，檢測(cè)到的OTU數(shù)目逐漸增多，稀釋性曲線先急劇上升后趨于平緩（圖1A）。熱圖展示了不同樣本在屬的水平所包含優(yōu)勢(shì)菌群的豐度差異，呈現(xiàn)組內(nèi)聚集現(xiàn)象（圖1B）。物種分布柱狀圖展示了不同樣本在屬的水平特征菌群所占的比例（圖1C）。綜上所述，在“健康—腺瘤性息肉—結(jié)直腸癌”3組中，每個(gè)樣本的菌群的豐度并不相同。

圖1 不同樣本間菌群的豐度差異

2.2 不同樣本間菌群的多樣性差異

反映物種多樣性的香農(nóng)指數(shù)曲線隨著測(cè)序條數(shù)的加大先急劇上升后趨于平緩（圖2A）?；赽inary_jaccard算法的PCoA顯示，3組樣本的多樣性同組之間相互聚集，不同組之間相互分離。（圖2B）?；赽inary_jaccard算法的Anosim分析箱形圖可見(jiàn)R=0.322，P=0.001（圖2C）。

圖2 不同樣本間菌群的多樣性差異

2.3 部分菌群與結(jié)直腸癌的進(jìn)展相關(guān)

C組、A組與N組的Chao1指數(shù)具有顯著性差異，且C組與A組的差異較大（P＜0.01），而A組與N組的差異較?。≒＜0.05）（圖3A）。物種分布柱狀圖顯示在N組中Bifidobacterium、Faecalibacterium豐度較高、A組中Escherichia-Shigella、Enterobacteriaceae豐度較高、C組中Lachnospiraceae豐度明顯降低，Escherichia-Shigella、Enterobacteriaceae豐 度 較 高（圖3B）。分支圖和LEfSe分析顯示差異最顯著的菌為結(jié)直腸癌組中Prevotellaceae；腺瘤性息肉組中的Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae和正常組中的Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae（LDA得分＞4，P＜0.05，圖3C，3D）。

2.4 IL-6在3組不同組織樣本中的表達(dá)水平比較

利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)3組不同腸道組織的IL-6的表達(dá)，IL-6的陽(yáng)性部位在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色。結(jié)果顯示IL-6蛋白在C組中的陽(yáng)性率為95%（19/20），其中強(qiáng)陽(yáng)性為60%（12/20），陽(yáng)性為35%（7/20），弱陽(yáng)性為5%（1/20），陰性為0（0/20），在A組中的陽(yáng)性率為60%（12/20），其中強(qiáng)陽(yáng)性為5%（1/20），陽(yáng)性為55%（11/20），弱陽(yáng)性為40%（8/20），陰性為0（0/20），在N組中的陽(yáng)性率為0（0/20），弱陽(yáng)性為30%（6/20），陰性為70%（14/20）。IL-6在C組中的陽(yáng)性率高于A組高于N組，且3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=43.570，P＜0.01）（表1，圖4）。

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組織中IL-6的表達(dá)水平 （IHC×400）

表1 IL-6蛋白在3組腸道組織中的表達(dá)情況

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可以通過(guò)多種方式影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展，例如誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子[8]、抑制NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷[9]等，也有部分腸道微生物可通過(guò)代謝食物成分產(chǎn)生短鏈脂肪酸抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[10]。與健康人相比，結(jié)直腸癌患者的糞便微生物豐度以及優(yōu)勢(shì)菌群有很大差異[11]。據(jù)報(bào)道，腸道菌群的差異可能會(huì)影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[12]。目前，16srRNA測(cè)序作為一種分析腸道微生物多樣性的工具已在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用[13]。盡管腸道菌群與腸道疾病之間的關(guān)系已有大量研究，但與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的特異性菌群仍不明確。

本研究中采用16srRNA測(cè)序技術(shù)，探究在“健康-腺瘤性息肉-結(jié)直腸癌”的進(jìn)展過(guò)程中受試者腸道菌群的數(shù)量和豐度差異。有研究表明與健康對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌組的糞便腸道菌群多樣性增加[14-15]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。但也有其他研究表明，與健康對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌組的腸道微生物豐度和多樣性降低[2,14]，這可能與地域差異、樣本數(shù)量或疾病的進(jìn)展時(shí)期有關(guān)。通過(guò)α多樣性及β多樣性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組腸道微生物群落的組成及多樣性與腺瘤性息肉組及健康對(duì)照組之間有顯著性差異：即3組中，每個(gè)樣本的菌群豐度與多樣性并不相同，且呈現(xiàn)出組內(nèi)樣本差異小，組間樣本差異大的現(xiàn)象。有研究表明，Prevotellaceae可能與結(jié)直腸癌有密切關(guān)系，其在結(jié)直腸癌患者的腸腔內(nèi)明顯富集[16]。Prevotellaceae在既往研究中也被證明在AOM/DSS小鼠中的表達(dá)高于對(duì)照組，并可以增加DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度[17]。Bifidobacteriaceae豐度較高的一組可檢測(cè)到結(jié)腸中較高的短鏈脂肪酸水平[18]，另外有研究表明，Ruminococcaceae也產(chǎn)生短鏈脂肪酸[19]。在本研究中，初步探討了在“健康-腺瘤性息肉-結(jié)直腸癌”的進(jìn)展過(guò)程中受試者腸道菌群的變化，并通過(guò)LEfSe分析進(jìn)一步明確了結(jié)直腸癌組中差異最顯著的菌為Prevotellaceae，這與既往研究一致，說(shuō)明該菌群可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展；而腺瘤性息肉組中差異最顯著的菌為Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae，提示上述菌群可能參與腺瘤性息肉的發(fā)生。而正常組中，差異最顯著的菌為Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae，說(shuō)明這兩種菌可能抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。簡(jiǎn)而言之，LEfSe分析揭示3組間差異最顯著的特定菌群。最后，本研究還驗(yàn)證了大腸癌進(jìn)展過(guò)程中健康受試者的腸壁組織、腺瘤性息肉患者的息肉組織和結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中IL-6的表達(dá)，IL-6在腫瘤組織中的陽(yáng)性率高于腺瘤性息肉組高于健康組，且3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明隨著結(jié)直腸癌的進(jìn)展，IL-6的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，即慢性炎癥可能通過(guò)產(chǎn)生IL-6等炎性因子導(dǎo)致癌前病變，進(jìn)而進(jìn)展為結(jié)直腸癌。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，腸道菌群在結(jié)直腸癌進(jìn)展的不同階段可能作為評(píng)估患者病情的生物標(biāo)志物，并可能通過(guò)IL-6影響癌癥的進(jìn)展。鑒別癌前病變或腫瘤病變特有的細(xì)菌群落可提供更有效的診斷策略，后續(xù)將分析長(zhǎng)期處于不同結(jié)直腸癌進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)中的患者，并繼續(xù)加大樣本數(shù)量、深入探索更多通路，探究潛在的促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物及其促癌作用的機(jī)制。