杜英杰，賈曉彤，唐秀明，杜占鑫，崔建東，賈士儒

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457; 2.中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓 644000)

酶是一種具有高效性、專一性且催化條件溫和及無污染等特點(diǎn)的生物催化劑，在食品加工、生物醫(yī)藥、水處理和生物能源等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力[1]。然而，大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，易受溫度、pH以及重金屬鹽等因素的影響變性或失活，使其難以回收利用和連續(xù)化生產(chǎn)。固定化酶具有較好的催化特性和穩(wěn)定性，可以有效提高酶的利用率。自20世紀(jì)60年代以來，隨著固定化材料和酶工程領(lǐng)域的研究進(jìn)一步發(fā)展，固定化酶技術(shù)為酶的應(yīng)用[2-4]開拓了更加廣闊的應(yīng)用前景。

金屬-有機(jī)框架(MOFs)材料是一種具有多孔結(jié)構(gòu)、處于分子尺度的原位雜化型的骨架材料，由金屬離子與有機(jī)配體通過配位鍵結(jié)合形成[5-10],由于其結(jié)構(gòu)的可設(shè)計(jì)性、比表面積大、金屬離子和有機(jī)配體種類的豐富性以及孔徑的可控性等特性使MOF材料被廣泛應(yīng)用在光催化、傳感以及環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域[11-17]。近年來，MOFs材料作為酶固定化的載體[8-10]受到人們廣泛的關(guān)注。

1 以MOFs為載體固定化酶的一般方法

作為一種新型材料[18-19]，MOFs形成的基本原理是無機(jī)金屬離子與有機(jī)配體之間通過配位鍵作用獲得的類晶體狀有機(jī)骨架結(jié)構(gòu)材料。到目前為止，以MOF為載體固定化酶的方法主要包括原位固定化法、吸附法和共價(jià)結(jié)合法，其中原位包埋法又分為原位礦化法[16, 20]、共沉淀法[16]和共包埋法[16]。原位固定化法主要是利用酶蛋白分子為核心，在其周圍原位生長(zhǎng)MOF晶體，最終在酶分子周圍形成穩(wěn)定的MOF殼層，實(shí)現(xiàn)在MOF的形成過程中將酶分子原位固定化到MOF晶體中[20](圖1)。其中，由于沸石咪唑酯骨架(ZIF)材料是MOF材料中一個(gè)可以在溫和水相中合成的亞類，因此原位固定化方法以ZIF系列的MOF最為常見[16]。與原位包埋法不同的是，吸附法和共價(jià)結(jié)合法是預(yù)先制備MOFs載體，然后利用酶分子與MOFs材料間的相互作用(如，吸附力或共價(jià)鍵)將酶分子固定在MOFs表面或孔隙中[19,21]。但是，預(yù)先制備MOFs往往需要高溫高壓等反應(yīng)條件，同時(shí)獲得的MOFs材料需要進(jìn)一步化學(xué)修飾才能實(shí)現(xiàn)酶的共價(jià)固定。此外，吸附法固定酶存在酶分子與載體之間的相互作用較弱，在一定條件下可能導(dǎo)致酶分子從載體上脫落，從而使固定化酶的穩(wěn)定性降低等問題[21]。與吸附法相比，雖然共價(jià)法固定化酶的穩(wěn)定性得到了大幅度提升，但是強(qiáng)共價(jià)鍵的形成往往會(huì)對(duì)酶分子的構(gòu)象產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致固定化酶的表觀催化活性降低[18-19]。與吸附法和共價(jià)結(jié)合法相比，原位固定法由于其具有制備簡(jiǎn)單、反應(yīng)體系環(huán)境較為溫和、生物親和性高等優(yōu)勢(shì)，所以它更加適用于以MOFs為載體來固定化酶[16,19-21]。

圖1 仿生礦化法制備的含蛋白MOFs復(fù)合物的示意[20]

近年來，采用更換MOFs的有機(jī)配體以構(gòu)建新型MOFs的固定化策略逐漸受到了研究者的關(guān)注，其中，利用氨基酸、多肽等生物分子作為MOFs的有機(jī)配體替代物構(gòu)造新型仿生MOFs(BioMOFs)，并進(jìn)一步進(jìn)行酶的固定化，從而為MOFs固定化酶帶來高的酶活回收率。但是生物分子作為配體與金屬離子的結(jié)合能力較弱，因此，開發(fā)高穩(wěn)定性的BioMOFs作為酶的固定化載體是未來的研究方向之一[21-22]。

2 MOFs固定化酶的改進(jìn)策略

利用MOFs固定酶雖然被廣泛研究，但是由于MOFs本身的特性局限，所以MOFs固定化酶存在固定化效率低、酶活回收差的問題[21-23]。因此，對(duì)MOFs材料進(jìn)行修飾、改造和雜化(如，利用孔徑工程、表面功能化和雜化功能化等手段)并對(duì)其固定化酶的策略進(jìn)行改進(jìn)以獲得高效的固定化方法具有較高的研究意義。

2.1 MOFs孔徑工程固定策略

由于目前所報(bào)道的大部分MOFs自身的孔徑一般小于2 nm，對(duì)于大多數(shù)酶分子而言難以通過吸附或擴(kuò)散的方式進(jìn)入MOFs的孔徑，而且小的孔徑也會(huì)產(chǎn)生較大的傳質(zhì)阻力，降低酶的催化效率[22-24]。早在2006年已有Cu2+和均苯三甲酸(H3BTC)合成的Cu-MOFs，利用其本身的孔道和表面電荷直接吸附固定化過氧化物酶[22]。但是由于Cu-MOF晶體本身的孔徑較小造成酶的固載量較低，導(dǎo)致固定化酶的酶活不高。因此亟待開發(fā)具有介孔孔道的MOFs材料進(jìn)行酶的固定化。

Lykourinou等[23]通過改變配體分子的長(zhǎng)度對(duì)MOFs材料進(jìn)行擴(kuò)孔改進(jìn)獲得了具有介孔孔道的MOFs晶體，并利用吸附法固定化微過氧化物酶(圖2)，由于改進(jìn)的MOFs晶體中的介孔孔道與微過氧化物酶的水動(dòng)力學(xué)直徑恰好吻合，因此這種緊密的孔道和酶分子的貼合作用表現(xiàn)出了明顯的限域作用，從而使底物的轉(zhuǎn)化率比游離酶的增大了3倍。但是，盡管人們目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)MOFs進(jìn)行擴(kuò)孔有利于酶的固定化，但是由于MOFs自身是規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，因此很難實(shí)現(xiàn)MOFs的理性擴(kuò)孔過程，這大大地限制了MOFs材料固定化酶的適用范圍[18-19]。

圖2 改性擴(kuò)孔的Tb-MOFs固定化微過氧化物酶示意[23]

2.2 MOFs表面功能化固定策略

為了提高M(jìn)OFs材料在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，通過化學(xué)基團(tuán)對(duì)MOFs表面進(jìn)行功能化修飾，并利用功能化修飾的MOFs為載體進(jìn)行酶的固定化[19]引起人們的關(guān)注。相對(duì)于未修飾的MOFs材料，功能化修飾的MOFs具有更多的與酶結(jié)合的共價(jià)固定化位點(diǎn)，因此它不僅能賦予MOFs材料更高的酶蛋白負(fù)載量，而且可以為固定化酶帶來更高的穩(wěn)定性。Jung等[24]利用MOFs材料配體分子上殘留在MOFs材料內(nèi)部或表面的羧基的可修飾性，通過共價(jià)法將酶分子結(jié)合在MOFs顆粒上，并以此方法共價(jià)固定化的脂肪酶用于手性醇的動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與游離酶相比，固定化酶的反應(yīng)活性和立體選擇性并沒有出現(xiàn)明顯的降低，但發(fā)現(xiàn)功能化修飾的MOFs固定化酶比吸附法固定化酶具有更高的固定化效率。Cao等[25]利用戊二醛修飾后的MOFs(UiO-66-NH2)對(duì)大豆環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)固定化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管固定化酶的底物選擇性沒有出現(xiàn)明顯的改善，但是通過氨基和交聯(lián)劑交聯(lián)共價(jià)固定化的方式可以獲得較高的固定化效率，固定化之后的酶活回收率約88%。

雖然利用功能化修飾的MOFs來固定酶能夠改善固定化酶的部分性能，但由于存在功能化修飾的過程復(fù)雜、難以掌控等問題，這在一定程度上限制了該方法在以MOFs為載體固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用[26]。因此，如果能將MOFs材料的生物親和性高、比表面積大等優(yōu)勢(shì)與其他材料的優(yōu)勢(shì)或特性相結(jié)合，將MOFs材料進(jìn)行雜化形成新的材料，可能為以MOFs為載體固定化酶提供新的高效固定化策略。

2.3 MOFs雜化功能化固定策略

傳統(tǒng)的MOFs材料存在力學(xué)穩(wěn)定性差、難以回收、化學(xué)性能(如親疏水性)不適合酶固定化等問題，在一定程度上限制了其在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用。將MOFs與一系列功能材料或者利用新型競(jìng)爭(zhēng)性配體對(duì)傳統(tǒng)MOFs進(jìn)行雜化[27]，在保留傳統(tǒng)MOFs材料優(yōu)良性能的同時(shí)使其更適合作為酶固定化的載體。

2.3.1 配體競(jìng)爭(zhēng)性雜化固定策略

近年來，通過采用競(jìng)爭(zhēng)性配體對(duì)MOFs的傳統(tǒng)配體進(jìn)行雜化合成新型MOFs用于酶的固定化[28-29]受到了越來越多的關(guān)注和報(bào)道。所用的競(jìng)爭(zhēng)性配體多為生物親和性配體(如，氨基酸、短肽分子等)，這些生物親和性配體的加入可以改善酶與雜化MOFs間的相互作用及其所處的微環(huán)境，在固定化過程中也可以減緩MOFs傳統(tǒng)的有機(jī)配體對(duì)酶分子的傷害，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快捷的一步固定化。Chen等[29]報(bào)道了一種新型的氨基酸作為競(jìng)爭(zhēng)性配體進(jìn)行雜化固定化的方法(圖3)，以此改進(jìn)MOFs固定化酶的載體晶體結(jié)構(gòu)和酶分子所處的微環(huán)境，獲得了較高的催化活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，氨基酸可以促進(jìn)仿生礦化過程，能夠?qū)崿F(xiàn)酶蛋白的快速封裝，使MOFs具有超高的酶蛋白的固載效率。該研究證明了被包裹的蛋白質(zhì)/酶不僅能很好地維持其原有酶學(xué)性質(zhì)和分子構(gòu)造，而且MOFs外殼結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用使酶在極端條件(如，蛋白水解劑、高溫和化學(xué)變性劑)下仍保留優(yōu)異的生物活性。

圖3 氨基酸雜化MOF固定化酶制備示意[29]

2.3.2 磁性雜化MOF固定化酶

除了配體競(jìng)爭(zhēng)性雜化策略外，人們也嘗試將MOFs材料與金屬納米粒子、石墨烯、多孔SiO2納米球和磁性納米粒子等功能材料相結(jié)合，以獲得優(yōu)越性能的雜化MOFs[30-32]用于酶固定化。在這些雜化MOFs材料中，金屬氧化物納米粒子Fe3O4具有反式尖晶石結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性，在食品、環(huán)境和醫(yī)藥等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[33-34]。磁性Fe3O4納米粒子作為酶固定化的新型載體，具有良好的生物相容性、粒徑小、比表面積大、超順磁性、較高的載酶量及在溶液中穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)[35]。同時(shí)，磁性粒子不僅可以通過施加外界磁場(chǎng)快速地從反應(yīng)體系中分離出來，促進(jìn)酶的有效回收和循環(huán)利用，還可以與多種材料復(fù)合，利用這些復(fù)合材料獨(dú)特的物理或表面特性提高酶的固定效率，解決單一材料在固定化酶領(lǐng)域所存在的問題[36-38]。

Wang等[37]研發(fā)了一種無表面活性劑、經(jīng)濟(jì)和綠色的高分散磁性核/殼復(fù)合微球(Fe3O4@MIL-100(Fe))，這種微球具有合適的孔徑(7.07 nm)、高比表面積(137.27 m2/g)和高磁化強(qiáng)度(49.67 A/m)的特點(diǎn)。將假絲酵母脂肪酶固定在磁性核/殼復(fù)合微球上(圖4)后進(jìn)行了催化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化酶在65 ℃下水解橄欖油6 h后仍保持65%左右的初始酶活，在連續(xù)10次催化運(yùn)行后，固定化酶的殘余酶活仍保持初始酶活的60%。

圖4 Fe3O4@MIL-100(Fe)磁性核/殼復(fù)合微球固定化脂肪酶的制備示意[37]

3 MOFs固定化酶的應(yīng)用

3.1 食品領(lǐng)域

隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品安全越來越重視，準(zhǔn)確有效地分析食品中的有害成分是食品安全領(lǐng)域研究的重要問題[39]。在眾多檢測(cè)技術(shù)中，磁性納米粒子雜化MOFs固定化酶作為一種新的生物酶檢測(cè)器已被證實(shí)是檢測(cè)食品安全性的合適方法[40]。例如，Wang等[41]開發(fā)了基于磁性沸石咪唑骨架-8(Fe3O4@ZIF-8)的簡(jiǎn)易磁性固相萃取技術(shù)，F(xiàn)e3O4@ZIF-8與高效液相色譜聯(lián)用為同時(shí)測(cè)定塑料包裝飲料和食品中的聚合物添加劑提供了一種有效的富集和測(cè)定方法。

3.2 醫(yī)藥領(lǐng)域

固定化酶可以作為疾病體外檢測(cè)的檢測(cè)器，或用于對(duì)體內(nèi)病灶進(jìn)行藥用酶或蛋白等的靶向遞送或緩釋輔助治療。Zhao等[42]將抗體蛋白或藥用酶蛋白通過MOFs固定化后作為靶向催化劑運(yùn)送進(jìn)體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了負(fù)載蛋白的靶向催化或者定點(diǎn)釋放。另外，與其他納米材料相比，MOFs材料的低生物毒性使MOFs固定化酶在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有無法替代的優(yōu)勢(shì)。

3.3 環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域

隨著環(huán)境問題和污染的日趨嚴(yán)重，污染物的檢測(cè)與防治受到了世界各國(guó)的關(guān)注并成了重點(diǎn)研究領(lǐng)域[5, 43-44]，其中，抗生素濫用所造成的污染已嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康，迫切需要制定有效的抗生素殘留降解和處置策略[30, 44]。Yang等[43]采用自組裝法將酰胺酶固定在ZIF-8中(β-lactamase@ZIF-8)，并采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了β-lactamase@ZIF-8多孔材料降解青霉素的催化性能，得到良好的結(jié)果，這為消除水環(huán)境中青霉素殘留提供新的策略。

4 總結(jié)和展望

本文介紹了近年來已報(bào)道的MOFs固定化酶常用的合成方法，分析了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及改進(jìn)策略。針對(duì)MOFs固定化酶的固定化效率和催化劑穩(wěn)定性較差的問題，提出利用孔道工程改變MOFs孔道的內(nèi)部環(huán)境，或者通過擴(kuò)孔以獲得更高的固定化效率和更廣的酶種類適用范圍；通過MOFs后修飾的固定化方法改變MOFs與酶分子的接觸方式從而獲得穩(wěn)定性更高的催化劑；利用雜化功能化固定策略為MOFs固定化酶帶來新的物化特性。在這些策略中，對(duì)MOFs雜化功能化固定策略可能會(huì)成為酶的固定化領(lǐng)域新的研究重點(diǎn)，但是對(duì)MOFs雜化材料與酶分子的相互作用關(guān)系，尤其是材料對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律尚需進(jìn)一步研究。

總之，在MOFs中雜化其他材料或分子進(jìn)行功能化改進(jìn)后，使得雜化材料功能化的固定化酶成為更適合工業(yè)化應(yīng)用的候選催化劑。相信通過國(guó)內(nèi)外學(xué)者的努力，具有大比表面積的雜化材料可以在生物催化領(lǐng)域，甚至是在藥物傳遞、催化和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。