劉芳美，趙學(xué)群，沙如意，夏 凱，黃 俊

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023)

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和生活方式的改變，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，隨之而來的如肥胖、糖尿病以及心血管疾病等健康問題給人們的生活帶來了嚴(yán)重的困擾和不便[1]。在飲食中糖分的過量攝入是導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的主要因素，同時(shí)糖的過量食用也會(huì)導(dǎo)致蛀牙等口腔疾病發(fā)病率的上升[2]。甜味劑的發(fā)現(xiàn)和使用有助于降低食品中高熱量糖的添加，從而達(dá)到減少糖攝入的目的。甜味劑是一類能夠提供甜味但自身含有較低熱量的化合物，根據(jù)其來源可分為天然甜味劑和合成甜味劑[1]。早期使用的合成甜味劑，如甜菊素、阿巴斯甜和糖精，雖然甜度高，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)常食用它們可能會(huì)引起腸道菌群紊亂而對(duì)健康不利[3]。相較于合成甜味劑，天然甜味劑的使用，如甘露糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇等具有低代謝能、降血糖和安全特性的糖醇，則更易被人們接受[4]。

赤蘚糖醇(erythritol)，化學(xué)名為(2R,3S)-butane-1,2,3,4-丁四醇，是一種白色、無味、不吸濕、無光學(xué)活性、熱穩(wěn)定性好以及易溶于水的四碳醇，廣泛存在于水果、蔬菜和發(fā)酵食品中[5]。赤蘚糖醇由于基本不被人體和腸道微生物利用，不改變血糖濃度和胰島素水平以及不會(huì)引起腹瀉等特性而格外受到人們的關(guān)注[6]。自1848年被首次發(fā)現(xiàn)以來，赤蘚糖醇于20世紀(jì)90年代先后被日本、美國以及歐洲一些國家批準(zhǔn)直接作為食品配料和甜味劑使用，國內(nèi)于2008年正式發(fā)布公告允許赤蘚糖醇在食品中按實(shí)際需要適量使用[7-8]。2019年，赤蘚糖醇的全球市場(chǎng)交易量為70 400 t，而到2026年赤蘚糖醇的市場(chǎng)需求量預(yù)測(cè)將上升至目前的1.5倍[9]。赤蘚糖醇市場(chǎng)需求量的上升對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)提出了新的要求。

赤蘚糖醇可以通過化學(xué)法和微生物發(fā)酵法合成，然而化學(xué)合成法存在生產(chǎn)效率低、成本高和操作危險(xiǎn)等缺點(diǎn)，因此未能得到工業(yè)化推廣[1]。通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)赤蘚糖醇則解決了化學(xué)法合成帶來的不利影響。多年來，研究人員在赤蘚糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)工藝上做了大量工作，結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(包括碳源、氮源和無機(jī)鹽等)、發(fā)酵條件(包括溫度、pH和溶氧等)以及發(fā)酵方法(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵等)對(duì)赤蘚糖醇的產(chǎn)率和產(chǎn)量具有重要影響，相關(guān)內(nèi)容[1,9]已在近期得到很好的論述，筆者將不再贅述。

通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇，相比于其他糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)，存在著產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率不高的現(xiàn)象。微生物菌種的誘變選育和代謝途徑改造則為提高赤蘚糖醇產(chǎn)量提供了新的方向。基于此，筆者綜述了微生物發(fā)酵合成赤蘚糖醇的最新研究概況，包括主要菌種及赤蘚糖醇代謝途徑、以可再生資源為原料合成赤蘚糖醇以及菌種的代謝工程改造，討論提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的潛在路徑，以期為今后高產(chǎn)赤蘚糖醇菌種的選育和構(gòu)建提供新的研究思路。

1 發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的主要微生物及其選育

1.1 細(xì)菌

細(xì)菌能夠利用葡萄糖為底物，經(jīng)過葡萄糖激酶(glucose kinase)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase)、磷酸轉(zhuǎn)酮酶(phosphoketolase)、赤蘚糖醇-4-磷酸脫氫酶(erythritol-4-phosphate dehydrogenase)以及磷酸酶(phosphatase)的作用下合成赤蘚糖醇(圖1)[1,10]。目前已知的能直接合成赤蘚糖醇的細(xì)菌較少，主要為乳酸菌和酒球菌(表1)。Tyler等[11]研究發(fā)現(xiàn)：Lactobacillusflorum2F可以利用葡萄糖為底物合成2.04 g/L的赤蘚糖醇，而以果糖為底物時(shí)赤蘚糖醇的終濃度較低；同時(shí)，該研究分析了包括乳酸菌和酒球菌在內(nèi)的其他22株菌產(chǎn)赤蘚糖醇的情況，發(fā)現(xiàn)包括Leuconostoc、Oenococcus和Weissella等屬在內(nèi)的菌種能夠合成0.02～0.45 g/L的赤蘚糖醇(表1)。van der Woude 等[12]以Synechocystissp.PCC6803為出發(fā)菌株，通過基因工程技術(shù)在該菌內(nèi)過表達(dá)赤蘚糖醇-4-磷酸磷酸化酶和赤蘚糖醇還原酶，獲得1株性狀優(yōu)勢(shì)菌株SEP024，能夠合成0.256 g/L的赤蘚糖醇。總體來說，細(xì)菌代謝合成赤蘚糖醇的產(chǎn)量較低，達(dá)不到赤蘚糖醇工業(yè)化生產(chǎn)要求。

Glu-6-P—glucose-6-phosphate;Fru-6-P—fructose-6-phosphate;acetyl-P—acetyl-phosphate;erythrose-4-P—erythrose-4-phosphate;Erythritol-4-P—erythritol-4-phosphate;1—glucose kinase;2—glucose-6-phosphate isomerase;3—phosphoketolase;4—erythritol-4-phosphate dehydrogenase;5—phosphatase

表1 發(fā)酵合成赤蘚糖醇的主要細(xì)菌

1.2 真菌

與細(xì)菌相比，真菌可通過磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)以葡萄糖、甘油和果糖等為底物代謝合成赤蘚糖醇，其中工業(yè)化生產(chǎn)赤蘚糖醇所使用的菌種主要為酵母菌[9]。在酵母中，以葡萄糖為碳源時(shí)，葡萄糖在胞內(nèi)先經(jīng)葡萄糖激酶(glucose kinase)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase)、磷酸葡萄糖酸脫氫酶(phosphogluconate dehydrogenase)、核酮糖磷酸3-差向異構(gòu)酶(ribulose phosphate 3-epimerase)以及核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶(ribulose-5-phosphate isomerase)催化作用下生成核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸，之后在轉(zhuǎn)酮酶(transketolase)、轉(zhuǎn)醛酶(transaldolase)、赤蘚糖-4-磷酸激酶(erythrose-4-phosphate kinase)和赤蘚糖還原酶(erythrose reductase)的作用下生成赤蘚糖醇(圖2)[13-14]。而以甘油為底物時(shí)，甘油可由甘油激酶(glycerol kinase)、甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)、磷酸甘油醛異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase)和醛縮酶(aldolase)的作用下轉(zhuǎn)換為果糖-1,6-二磷酸，之后經(jīng)葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖途徑。最近，Niang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇可以進(jìn)一步被降解為赤蘚酮糖和赤蘚酮糖磷酸而被細(xì)胞利用，該過程中赤蘚糖醇脫氫酶(erythritol dehydrogenase)、赤蘚酮糖激酶(erythrulose kinase)和赤蘚酮糖磷酸異構(gòu)酶(erythrulose phosphate isomerase)發(fā)揮關(guān)鍵作用。

GUT1—glycerol kinase;GUT2—glycerol-3-phosphate dehydrogenase;TPI1—triosephosphate isomerase;ALD—aldolase;PFK—phosphofructokinase;FBP—fructose-1,6-bis phosphatase;PGI—glucose-6-phosphate isomerase;HK—glucose kinase;ZWF1—glucose-6-phosphate dehydrogenase;PGLS—6-phosphogluconolactonase;GND1—phosphogluconate dehydrogenase;RPE1—ribulose phosphate 3-epimerase;RKI1—ribulose-5-phosphate isomerase;TKL1—transketolase;TAL1—transaldolase;E4PP—erythrose-4-phosphate kinase;ER：erythrose reductase;EYD1—erythritol dehydrogenase;EYK1—erythrulose kinase;EYI1—erythrulose-1-phosphate isomerase;EYI2—erythrulose-4-phosphate isomerase;P—phosphate

目前已報(bào)道的具有赤蘚糖醇較高產(chǎn)量的酵母菌[16-25]主要包括假絲酵母屬(Candida)、亞羅酵母屬(Yarrowia)和圓酵母屬(Torula)等在內(nèi)的菌種，合成的赤蘚糖醇達(dá)25～245 g/L(表2)。其中，亞羅解脂酵母(Yarrowialipolytica)是工業(yè)化生產(chǎn)赤蘚糖醇中使用最多的菌種。亞羅解脂酵母是一類非常規(guī)油脂酵母，同時(shí)也被認(rèn)為是一種安全微生物(GRAS)，因此在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

表2 發(fā)酵合成赤蘚糖醇的主要酵母菌

除此之外，Yuill等[26]于1948年首次報(bào)道了黑曲霉能夠代謝合成赤蘚糖醇，但包括曲霉在內(nèi)的其他霉菌在赤蘚糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)中并未得到應(yīng)用。

1.3 菌種選育

從自然界分離篩選得到的菌株存在赤蘚糖醇合成效率低的問題，因此為了提高菌種的初始赤蘚糖醇的合成量，需要對(duì)菌種的性狀進(jìn)行改造。常用的方法包括物理誘變，如紫外誘變、射線誘變和常溫等離子誘變以及化學(xué)誘變，如利用硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺和疊氮化鈉等對(duì)目標(biāo)菌種進(jìn)行處理。Moon等[10]通過紫外誘變和亞硝基胍處理Aureobasidiumsp.SN124A，獲得赤蘚糖醇產(chǎn)量提高了47.6%的突變株。董海州等[27]對(duì)分離獲得的球擬酵母ERY237進(jìn)行紫外線和化學(xué)試劑組合誘變，獲得一株在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)87.8 g/L赤蘚糖醇的優(yōu)勢(shì)菌種。王鳳偉等[28]通過對(duì)自然界中富含高濃度糖分樣品的篩選，獲得1株產(chǎn)赤蘚糖醇的亞羅解脂酵母JunA-6，經(jīng)過紫外線、LiCl和硫酸二乙酯(DES)的復(fù)合誘變處理后得到菌株JunA-27，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到67.5 g/L，是初始菌株JunA-6的4.2倍。

Ghezelbash等[29]通過紫外照射亞羅解脂酵母DSM70562，得到1株可合成39.76 g/L赤蘚糖醇的突變菌株mutant 49，比出發(fā)菌株的24 g/L提高了65.7%；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇產(chǎn)量的提高與赤蘚糖還原酶活性的提高有關(guān)，紫外照射引起了該酶270位天冬氨酸被谷氨酸取代，最終導(dǎo)致了該酶的酶活提升1.47倍。此外，原始菌的發(fā)酵會(huì)產(chǎn)6.37 g/L副產(chǎn)物甘油，而mutant 49不合成甘油。類似地，Ghezelbash等[30]通過紫外照射和甲基磺酸乙酯復(fù)合處理木蘭假絲酵母(Candidamagnolia)DSM70638，獲得1株性狀優(yōu)良的突變株mutant 12，該菌株赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到20.32 g/L，相較于出發(fā)菌株提高2.4倍，同時(shí)副產(chǎn)物甘油的濃度下降5.5倍。Qiu等[31]利用紫外誘變和常溫等離子誘變相結(jié)合的方式對(duì)亞羅解脂酵母BBE-18進(jìn)行處理，對(duì)獲得的1 152株突變株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，最終獲得高產(chǎn)突變株yliUA8在發(fā)酵條件優(yōu)化后可產(chǎn)148 g/L的赤蘚糖醇，遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株的43 g/L。由此可知，常規(guī)的菌種誘變選育仍然是優(yōu)良性狀菌種獲得的重要途徑，而在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)赤蘚糖醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，則需結(jié)合其他方法如發(fā)酵工藝優(yōu)化和代謝途徑改造。

2 以可再生資源或廢棄物為原料發(fā)酵合成赤蘚糖醇

2.1 以粗制甘油為原料

傳統(tǒng)赤蘚糖醇的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)主要以商業(yè)化的葡萄糖和甘油為底物，而以純的甘油或葡萄糖為底物合成赤蘚糖醇不僅帶來成本的上升，同時(shí)也和綠色能源經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展理念相悖。近年來，研究人員在以可再生資源為原料合成赤蘚糖醇方面進(jìn)行了大量探索，其中粗制甘油是使用較多的原料。粗制甘油是生物柴油等生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，主要成分包含甘油(80%)、殘油、游離脂肪酸和鈉鹽[32]。Tomaszewska等[33]考察了亞羅解脂酵母在以純甘油和粗制甘油為碳源條件下合成赤蘚糖醇的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：亞羅解脂酵母可以利用粗制甘油合成最高產(chǎn)量為80.5 g/L的赤蘚糖醇，略低于純甘油條件下的84.1 g/L，說明粗制甘油可以作為赤蘚糖醇工業(yè)化生產(chǎn)中的主要原料。Mironczuk等[34]通過反復(fù)分批發(fā)酵優(yōu)化可使亞羅解脂酵母利用粗制甘油為原料合成155.5 g/L的赤蘚糖醇，雖然低于對(duì)照組使用純甘油時(shí)的208 g/L，但得率達(dá)到0.56 g/g，高于對(duì)照組的0.41 g/g。Kobayashi等[24]證實(shí)叢梗孢酵母可利用粗制甘油為底物發(fā)酵合成赤蘚糖醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到60%，高于使用純葡萄糖為碳源時(shí)50%的轉(zhuǎn)化率，也說明粗制甘油可以替代葡萄糖成為發(fā)酵合成赤蘚糖醇的原料。此外，Rakicka等[21]通過兩階段發(fā)酵法測(cè)試了亞羅解脂酵母利用兩種來源粗制甘油(生物柴油生產(chǎn)線，甘油比例為83%；肥皂生產(chǎn)線，甘油比例為76%)合成赤蘚糖醇的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇的最高產(chǎn)量分別為162和116 g/L。這一產(chǎn)量雖然低于使用純甘油時(shí)的199.4 g/L，但從原料經(jīng)濟(jì)成本考慮，使用粗制甘油為原料合成赤蘚糖醇是更好的選擇。

2.2 以糖蜜和餐廚廢棄油為原料

除了粗制甘油，Mironczuk等[35]采用農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物糖蜜為原料發(fā)酵合成赤蘚糖醇。糖蜜的主要成分為蔗糖(55%)、其他糖類物質(zhì)、有機(jī)酸和鹽。該研究中，以糖蜜為原料，經(jīng)過兩階段發(fā)酵后亞羅解脂酵母AMM可合成70 g/L的赤蘚糖醇。而Hijosa-Valsero等[23]研究MoniliellapollinisMUCL 40570、M.pollinisMUCL 28141、PseudozymafusiformataDSM 27425 和P.tsukubaensisNRRL Y-7792利用甘蔗糖蜜(sugarcane molasses)、甜菜糖蜜(beet molasses)、紅葡萄汁(red grape must)和玫瑰葡萄汁(rose grape must)發(fā)酵合成赤蘚糖醇的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MUCL 40570和MUCL 28141可利用4種原料為底物合成50～97 g/L的赤蘚糖醇；DSM 27425和NRRL Y-7792不能利用甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜代謝合成赤蘚糖醇，但能利用葡萄汁為原料合成14～30 g/L的赤蘚糖醇。由此可見，不同菌種對(duì)原料的分解代謝能力存在差異。

餐廚廢棄油中含有大量油脂和化學(xué)有機(jī)物，隨意丟棄會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，因此實(shí)現(xiàn)餐廚廢棄油的再次利用具有重要意義。Liu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，亞羅解脂酵母M53可以利用餐廚廢油為原料代謝合成赤蘚糖醇，在培養(yǎng)基中添加30 g/L廢棄油，在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)72 h可獲得22.1 g/L的赤蘚糖醇，得率高達(dá)0.74 g/g。隨后，該課題組Liu等[37]對(duì)利用廢棄油脂生產(chǎn)赤蘚糖醇進(jìn)行了工藝優(yōu)化。首先對(duì)絲瓜瓤(loofah sponge)進(jìn)行清洗和烘干，之后將其切割成尺寸大小為1 cm × 1 cm × 0.5 cm的顆粒并加入發(fā)酵液中，使其作為一種水包油分散劑從而提高細(xì)胞對(duì)油脂的利用率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，至少60 g/L的底物可以被完全利用，赤蘚糖醇的得率達(dá)到0.76 g/g油脂，通過分批補(bǔ)料及擴(kuò)大發(fā)酵，赤蘚糖醇產(chǎn)量可進(jìn)一步提高至114.3 g/L。

2.3 以農(nóng)作物廢棄物為原料

農(nóng)作物廢棄物中含有大量能被微生物利用的有機(jī)物質(zhì)。Liu等[38]嘗試以大豆殘?jiān)鼮樵虾铣沙嗵\糖醇。由于亞羅解脂酵母不能直接分解大豆殘?jiān)允紫壤妹?Mucorflavus)和木霉(Trichodermareesei)對(duì)大豆殘?jiān)M(jìn)行預(yù)發(fā)酵，然后以預(yù)發(fā)酵產(chǎn)物為原料利用亞羅解脂酵母進(jìn)一步發(fā)酵合成赤蘚糖醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5 L發(fā)酵罐中亞羅解脂酵母可代謝底物合成14.7 g/L的赤蘚糖醇，利率為0.49 g/g。

采用固態(tài)發(fā)酵方法以可再生資源為原料合成赤蘚糖醇的工藝在近幾年得到了突破。相比于傳統(tǒng)液態(tài)深層發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)更穩(wěn)定以及產(chǎn)量更高的特點(diǎn)[39]。Liu等[39]首次采用兩階段固態(tài)發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)了以大豆殘?jiān)鼮榈孜锷a(chǎn)赤蘚糖醇的工藝，第一階段為毛霉發(fā)酵，72 h后原位接種亞羅解脂酵母進(jìn)行第二階段的赤蘚糖醇發(fā)酵。另外，為解決實(shí)際發(fā)酵過程中底物大豆殘?jiān)Y(jié)塊造成的內(nèi)部缺氧問題，在原料中分別添加干絲瓜瓤、麩皮、玉米芯和蕎麥殼來疏松大豆殘?jiān)?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以麩皮作為疏松材料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵192 h后赤蘚糖醇的得率為143.3 mg/g(以1 g干底物計(jì))的。在另一項(xiàng)研究中，Liu等[40]嘗試?yán)糜土献魑飶U棄物為原料通過一步固體發(fā)酵法合成赤蘚糖醇，因?yàn)橛土献魑飶U棄物含氮量較高，對(duì)赤蘚糖醇的合成具有抑制作用，為此，他們使用了1株經(jīng)過改造后的亞羅解脂酵母M53-S，該菌株的snf1基因(編碼sucrose non-fermenting protein kinase)被敲除，可以實(shí)現(xiàn)在氮源充足的條件下利用底物合成赤蘚糖醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M53-S可利用花生濾渣餅、40%芝麻粕和10%餐廚廢棄油組成的混合物為原料發(fā)酵合成赤蘚糖醇，得率為185.4 mg/g。

生物碳可以為細(xì)胞的定植提供場(chǎng)所，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。為進(jìn)一步提高蘚糖醇產(chǎn)量，Liu等[41]將生物碳引入固態(tài)發(fā)酵體系中。首先將不同基料包括米糠、麥桿、蘑菇渣和豬糞等通過高溫碳化后研磨成碳顆粒，之后加入由豆粕渣餅、芝麻粕和餐廚廢油(質(zhì)量比為5∶4∶1)組成的底物原料中，最終發(fā)現(xiàn)：麥稈制成的生物碳顆粒在促進(jìn)亞羅解脂酵母合成赤蘚糖醇方面效果最明顯，赤蘚糖醇的得率由不加生物碳顆粒時(shí)的182.4 mg/g提升至199.7 mg/g，隨后通過連續(xù)分批發(fā)酵優(yōu)化，赤蘚糖醇的得率可達(dá)到222.5 mg/g。

2.4 以微藻殘?jiān)鼮樵?/h3>

微藻被認(rèn)為是一種重要的可持續(xù)原料，因其不需要土地進(jìn)行種植從而不會(huì)和糧食作物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。Liu等[42]研究證實(shí)亞羅解脂酵母可利用裂壺藻(Schizochytriumsp.zjut8)殘?jiān)?油脂提取后的剩余物質(zhì))、豆粕渣餅和芝麻粕等物質(zhì)組成的原料合成赤蘚糖醇，且經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵后產(chǎn)物得率可達(dá)223.2 mg/g(以1 g干底物計(jì))。然而，在該研究中由于微藻殘?jiān)欣w維素成分，不能直接被亞羅解脂酵母利用，因此需要使用蛋白酶和纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理，一定程度上增加了生產(chǎn)成本。在以后的研究中，可通過對(duì)亞羅解脂酵母進(jìn)行代謝途徑改造以實(shí)現(xiàn)其對(duì)含纖維素成分原料的直接利用。

綜合可知，利用微生物以可再生資源為原料經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵合成赤蘚糖醇，并實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)是未來主要的研究方向，這不僅可大幅度降低生產(chǎn)成本，而且實(shí)現(xiàn)廢棄物的回收再利用對(duì)于環(huán)境保護(hù)和能源節(jié)約也具有重要意義。

3 赤蘚糖醇代謝途徑改造

基因工程技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為定向改造微生物的代謝通路提供了保障。相較于傳統(tǒng)的誘變選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化，以定向改造代謝途徑提高微生物目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量為目的的代謝工程方法具有周期短、效率高和目標(biāo)更明確等優(yōu)點(diǎn)。目前，利用代謝途徑改造提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的研究主要集中于亞羅解脂酵母，主要包括提高底物葡萄糖和甘油的代謝、提高磷酸戊糖途徑效率和赤蘚糖醇合成以及切斷赤蘚糖醇的分解途徑(圖3)。另外，代謝途徑改造過程中所涉及的基因敲除方法主要包括同源重組、基于Cre-Lox的同源重組以及CRISPR-Cas敲除體系，而所使用的質(zhì)粒載體多為染色體整合質(zhì)粒(表3)。

斜體字母代表基因名稱，其中紅色和綠色分別表示過表達(dá)基因和敲除基因

Carly等[43]發(fā)現(xiàn)和鑒定了基因EYK1，該基因編碼赤蘚酮糖激酶催化赤蘚酮糖合成赤蘚酮糖-1-磷酸(圖2)，當(dāng)亞羅解脂酵母W29的EYK1被敲除后，發(fā)酵液中的赤蘚糖醇由30.7 g/L上升至35.7 g/L(表 3)，敲除菌的赤蘚糖醇得率為0.49 g/g，高于原始菌株的0.39 g/g。而Carly等[44]通過在亞羅解脂酵母JMY2900中單獨(dú)或組合過表達(dá)甘油激酶(GUT1)、甘油-3磷酸脫氫酶(GUT2)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI1)、轉(zhuǎn)酮酶(TKL1)、赤蘚糖-4-磷酸磷酸化酶(E4PP)和赤蘚糖還原酶(ER)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)同時(shí)過表達(dá)GUT1和TKL1或GUT1和ER時(shí)，發(fā)酵液中赤蘚糖醇濃度相較于對(duì)照菌株有明顯提升，其中，赤蘚糖醇的得率由0.46 g/g上升至0.61 g/g(表3)，高于其他過表達(dá)單個(gè)基因時(shí)的產(chǎn)量；而敲除EYK1后結(jié)合GUT1和TKL1的過表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中赤蘚糖醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，達(dá)到80.6 g/L。Mironczuk等[13]在亞羅解脂酵母AMM中分別過表達(dá)磷酸葡萄糖酸脫氫酶(GND1)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(ZWF1)、TKL1和轉(zhuǎn)醛酶(TAL1)，考察其對(duì)細(xì)胞合成赤蘚糖醇的影響，結(jié)果表明，相較于對(duì)照菌株MK1發(fā)酵合成的赤蘚糖醇為25.30 g/L，過表達(dá)任一基因均可使細(xì)胞合成的赤蘚糖醇達(dá)到40 g/L以上。

表3 代謝途徑改造提高亞羅解脂酵母赤蘚糖醇產(chǎn)量方法概覽

Cheng等[45]對(duì)亞羅解脂酵母CGMCC 7326內(nèi)源性赤蘚糖還原酶進(jìn)行分析，并對(duì)其中的ER10、ER25和ER27進(jìn)行過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因分別單獨(dú)過表達(dá)皆可一定程度上提高CGMCC 7326的赤蘚糖醇合成效率，其中過表達(dá)ER27時(shí)效果最明顯，發(fā)酵液中赤蘚糖醇由原始菌產(chǎn)生的154 g/L提升至重組菌中的182 g/L，同時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度由1.6提高至2.2 g/(L·h)(表 3)。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步在該菌中過表達(dá)GND1和ZWF1，所獲菌株的赤蘚糖醇得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別比原始菌的提高23.5%和50%，達(dá)到0.63 g/g和2.4 g/(L·h)，同時(shí)赤蘚糖醇達(dá)到190 g/L。Jagtap等[46]在亞羅解脂酵母Po1f中過表達(dá)來源于釀酒酵母的糖醇磷酸化酶(PYP)，提高了該菌對(duì)甘油底物的利用效率和赤蘚糖醇的產(chǎn)量，其中發(fā)酵液中赤蘚糖醇的產(chǎn)量、赤蘚糖醇的生產(chǎn)強(qiáng)度、赤蘚糖醇得率和甘油利用速率分別由10.70 g/L、0.09 g/(L·h)、0.11 g/g和0.41 g/(L·h)上升至18.60 g/L、0.16 g/(L·h)、0.19 g/g和0.56 g/(L·h)。此外，他們進(jìn)一步在該重組菌中過表達(dá)GUT1和TKL1，且經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)化后，最終發(fā)酵液中赤蘚糖醇可達(dá)到58.8 g/L。同樣是以亞羅解脂酵母Polf為出發(fā)菌株，Zhang等[14]在過表達(dá)GUT1、TPI1、TKL1和TAL1等基因的基礎(chǔ)上敲除赤蘚糖醇脫氫酶的編碼基因EYD1，所獲菌株MY11能以甘油為底物發(fā)酵合成40 g/L的赤蘚糖醇，相較于對(duì)照菌株的18 g/L有了顯著提升。另外，為了進(jìn)一步提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量，他們?cè)贛Y11基礎(chǔ)上過表達(dá)核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(RKI1)，所獲菌株產(chǎn)赤蘚糖醇的得率可達(dá)到0.52 g/g，產(chǎn)量可達(dá)52 g/L。

綜合可知，代謝途徑定向改造是一種提高初始菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量的有效方法。然而，目前赤蘚糖醇代謝途徑改造多集中于亞羅解脂酵母W29、Polf和MK1等初始赤蘚糖醇產(chǎn)量較低的實(shí)驗(yàn)室模式菌株，對(duì)于已工業(yè)化菌種的代謝途徑改造相對(duì)較少。因此，筆者相信在初始赤蘚糖醇產(chǎn)量較高的工業(yè)化菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)代謝途徑改造，同時(shí)結(jié)合發(fā)酵工藝優(yōu)化，將是提高赤蘚糖醇產(chǎn)量瓶頸的有效途徑。

4 結(jié)論與展望

目前，赤蘚糖醇主要由酵母菌通過固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，其中亞羅解脂酵母是主要的菌種。近年來，研究人員結(jié)合菌種誘變選育、發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化和赤蘚糖醇合成途徑改造，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了提高出發(fā)菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量的目標(biāo)。同時(shí)，已有以可再生資源或廢棄物為原料，通過混菌發(fā)酵工藝合成赤蘚糖的研究實(shí)例。雖然如此，微生物代謝合成赤蘚糖醇的過程仍有較多問題需要探索。①目前所使用菌種多為亞羅解脂酵母，該菌雖然是國際公認(rèn)的安全微生物，但其生長(zhǎng)環(huán)境溫度為30 °C左右，夏天生產(chǎn)時(shí)容易造成染菌倒罐，且存在冷卻能耗高的問題?；诖?，未來可考慮對(duì)現(xiàn)有工業(yè)化菌種進(jìn)行耐熱性定向改造，或者從環(huán)境中分離能耐受高溫脅迫且性狀優(yōu)良的菌種。②對(duì)于亞羅解脂酵母，目前已知環(huán)境滲透壓對(duì)其代謝合成赤蘚糖醇具有重要調(diào)控作用，而潛在的分子機(jī)制尚未清楚。其中，赤蘚糖醇合成途徑中關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及赤蘚糖醇合成的時(shí)域性值得進(jìn)一步研究和探索。③對(duì)于赤蘚糖醇的代謝途徑改造多以過表達(dá)底物代謝過程、磷酸戊糖途徑和赤蘚糖醇合成關(guān)鍵步驟中的基因以及敲除赤蘚糖醇降解途徑中的基因?yàn)橹鳌６鴮?duì)于改造底物的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)從而提高底物運(yùn)輸，提高赤蘚糖醇的外排等方面的研究尚未深入開展，這將有助于赤蘚糖醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。④如果以可再生資源或廢棄物為原料合成赤蘚糖醇，則所用菌種必須能夠分解利用纖維素或半纖維素為碳源，這對(duì)使用亞羅解脂酵母發(fā)酵合成赤蘚糖醇提出了新的挑戰(zhàn)。雖然可以通過對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理或通過混菌發(fā)酵來解決這一問題，但無疑增加了生產(chǎn)周期和成本。同時(shí)，纖維素水解混合物中存在的酸類物質(zhì)和羥甲基糠醛等會(huì)對(duì)亞羅解脂酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。因此，未來通過對(duì)亞羅解脂酵母的定向改造以提高其對(duì)可再生資源的直接利用水平，同時(shí)增強(qiáng)其環(huán)境脅迫應(yīng)對(duì)能力將有望實(shí)現(xiàn)赤蘚糖醇的綠色可持續(xù)生產(chǎn)。⑤ 最后，誘變帶來的菌種產(chǎn)量提高和代謝途徑中關(guān)鍵酶的突變所導(dǎo)致的酶活性提高有關(guān)。未來是否可通過體外定向進(jìn)化提高關(guān)鍵酶的活性和穩(wěn)定性，進(jìn)而通過反向代謝工程技術(shù)在胞內(nèi)表達(dá)進(jìn)化后的酶，從而達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的值得研究。