武耀運，陳城虎，宋 偉，胡貴鵬，劉 佳，吳 靜

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

氨基酸的脫氨反應(yīng)，即氨基酸脫去氨基生成對應(yīng)的酮酸和氨，是一種典型的C—N裂解反應(yīng)。C—N裂解反應(yīng)是生物有機體重要的生化反應(yīng)。目前能催化C—N裂解反應(yīng)的酶主要包括：轉(zhuǎn)氨酶(AT，EC 2.6.4.X)[1]、氨基酸脫氫酶(AADH，EC 1.4.1.X)[2]、氨裂解酶(AL，EC 4.3.1.X)和氨基酸脫氨酶(TD，EC 4.3.1.19[3]；AAD，EC 1.4.3.X[4])。AT、AADH、AL與TD、AAD相比，其不同之處主要在于：1)AT、AADH和AL的分子量大多數(shù)要比TD、AAD偏大；2)AT、AADH和AL的酶學(xué)性質(zhì)大多不如TD、AAD；3)AT、AADH和AL穩(wěn)定性比TD、AAD弱。其中，AADH和AT催化的氨基酸C—N裂解反應(yīng)存在：1)反應(yīng)可逆且催化效率極低；2)需要添加高成本的氨基受體[5]；3)產(chǎn)品分離純化較復(fù)雜，難以達到工業(yè)化規(guī)模高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和低成本等特點。而AL催化的氨基酸C—N裂解反應(yīng)往往專一性過強，難以廣泛應(yīng)用于催化氨基酸C—N的裂解反應(yīng)。

氨基酸脫氨酶能催化不可逆的氨基酸C—N裂解反應(yīng)，根據(jù)所需輔因子的不同，可分為：1)5'-磷酸吡哆醛(PLP)介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶，代表酶為蘇氨酸脫氨酶(TD，EC 4.3.1.19)[3]；2)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶，代表酶有L-氨基酸脫氨酶(LAAD，EC 4.3.1.2)[4,6-7]和L-氨基酸氧化酶(LAAO，EC 1.4.3.X)[8]。因此，在結(jié)合筆者課題組近幾年在生物催化氨基酸C—N裂解反應(yīng)研究的基礎(chǔ)上，主要概述了氨基酸脫氨酶的研究進展，并總結(jié)了其參與多酶級聯(lián)反應(yīng)合成精細化學(xué)品中的應(yīng)用，展望了生物催化氨基酸C—N裂解的反應(yīng)。

1 PLP介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶

TD是PLP介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶代表酶[3]，能催化L-Thr的α和β位消除—NH2和—OH發(fā)生C—N裂解反應(yīng)，產(chǎn)生2-酮丁酸和氨，是合成2-氨基丁酸[9]、2-羥基酸[10]等藥物中間體的關(guān)鍵酶。TD的缺陷在于底物范圍較窄，對大體積非天然氨基酸底物催化效率較低[3]。因此，近年來研究人員致力于在結(jié)構(gòu)解析、闡釋催化機制的基礎(chǔ)上，通過蛋白質(zhì)工程改造，提升其催化性能。

Gallagher等[11]研究發(fā)現(xiàn)，來源于大腸桿菌(E.coli)的EcTD具有PLP的催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)控蛋白聚合的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，而來源于鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)[12]的StTD僅含催化結(jié)構(gòu)域[12]，兩者催化結(jié)構(gòu)域高度相似。進一步通過解析CgTD的催化機制[13]發(fā)現(xiàn)(圖1)：PLP會與CgTD Lys70位的Nε以席夫堿的形式共價連接生成中間體1，當(dāng)?shù)孜镩_始反應(yīng)時，L-Thr的Nα位會去親核進攻1C4'生成中間體2，之后C4'處發(fā)生轉(zhuǎn)亞胺反應(yīng)，生成化合物3，然后化合物3會對L-Thr去質(zhì)子化生成化合物4，再對化合物4的L-Thr醌類中間體的β-羥基進行消除，生成化合物5。在此基礎(chǔ)上，Lys70位的Nε對5C4'再次進行親和攻擊，生成化合物6，化合物6通過轉(zhuǎn)亞胺反應(yīng)，重新生成中間體1，并釋放出產(chǎn)物亞胺，在水環(huán)境下，亞胺自發(fā)水解生成α-酮酸[3]?；谶@一機制，Song等[3]通過同源建模獲得了來源于谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的CgTD蛋白結(jié)構(gòu)，經(jīng)蛋白通道計算后發(fā)現(xiàn)了“門”結(jié)構(gòu)，遂提出“開門”策略，并結(jié)合丙氨酸掃描、組合位點、定點及迭代飽和突變策略，對CgTD蛋白質(zhì)進行工程改造后，獲得了寬底物譜且能催化大體積的非天然氨基酸的最佳突變體M7，M7可用于生產(chǎn)天然和非天然α-酮酸，包括2-氧-丁酸(83.4 g/L，轉(zhuǎn)化率99.0%)、苯丙酮酸(72.5 g/L，轉(zhuǎn)化率95.0%)、2-氧-戊酸(21.1 g/L，轉(zhuǎn)化率91.0%)和2-氧-4-苯丁酸(29.9 g/L，轉(zhuǎn)化率84.0%)。

圖1 CgTD催化α，β-脫氨反應(yīng)機制

2 FAD介導(dǎo)的L-氨基酸脫氨酶

FAD介導(dǎo)的LAAD是一種膜依賴型脫氨酶[4，6-7]，可催化C—N裂解反應(yīng)生成相應(yīng)的α-酮酸和氨(圖2)。LAAD主要存在于普羅登菌屬(Providenciasp.)[14]、摩爾根菌屬(Morganellasp.)[4]及變形桿菌屬(Proteussp.)[6]的細胞膜中，可與細胞膜上的電子傳遞鏈耦聯(lián)，F(xiàn)AD的電子能通過電子傳遞鏈傳遞給細胞膜上的氧化型細胞色素b，使O2分子還原為H2O，因此該酶又被稱為FAD介導(dǎo)的H2O生成型氨基酸脫氨酶。目前，研究主要集中于來源于Proteussp.的LAAD，根據(jù)其催化特點可分為兩類：Ⅰ型LAAD主要是來源于含黏性變形桿菌(P.myxofaciens)[6]的PmaLAAD和奇異變形桿菌(P.mirabilis)[5]的PmirLAAD，可催化L-Leu、L-Met等大體積的脂肪族氨基酸及L-Phe、L-Trp等芳香族氨基酸，此外，PmaLAAD對極性的L-Cys也有活性，而對小體積的非極性或帶電氨基酸活性較低[6]。而Ⅱ型LAAD主要來源于普通變形桿菌(P.vulgaris)[15]的PvLAAD和奇異變形桿菌(P.mirabilis)[16]的Pm1LAAD，更適合催化帶電荷的L-His、L-Arg等堿性氨基酸和含硫的L-Met，但PvLAAD對大體積非極性底物(如L-Leu)也具有催化活性。從結(jié)構(gòu)上來看，Ⅰ型的PmaLAAD(PDB：5fjn)[6]和Ⅱ型的PvLAAD(PDB：5hxw)[7]均為單體蛋白且兩者結(jié)構(gòu)高度相似，均包含跨膜區(qū)域、底物結(jié)合域(SBD)、FAD結(jié)合域(FBD)及插入模塊。在此基礎(chǔ)上，為了改善LAAD催化性能，研究人員對LAAD進行了系列蛋白質(zhì)工程改造：1)增強底物結(jié)合效率。借助易錯PCR和基因融合篩選[17]，調(diào)整底物結(jié)合口袋使突變酶與底物的親和力增加，比野生酶催化活性提高了6.6倍，(D/L)-4-Phe轉(zhuǎn)化率為49.5%[18]；2)提高催化效率。通過分子對接[19](圖3)和進化保守性分析，在構(gòu)建小而精突變文庫的基礎(chǔ)上獲得最佳突變體，對L-1-萘丙氨酸(L-1-Nal)的催化效率比野生酶提高了7倍[19]；對PmirLAAD的底物口袋、底物結(jié)合力和底物入口通道，進行理性改造，顯著提高了苯丙酮酸(72.5 g/L，轉(zhuǎn)化率96.0%)、α-酮異丁酸酯(107.1 g/L，轉(zhuǎn)化率98.0%)和α-酮-β-甲基戊酸酯(98.9 g/L，轉(zhuǎn)化率99.0%)的催化效率[20]；3)提高穩(wěn)定性。通過對PvLAAD表面的INS疏水殘基進行定點突變，提高了溶液中的穩(wěn)定性；4)提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。通過易錯PCR和定點飽和突變獲得突變體，并敲除E.coli中的L-Phe降解途徑，能將L-Phe轉(zhuǎn)化為10 g/L苯丙酮酸，轉(zhuǎn)化率為100%，進一步通過加強FAD合成，還原型輔因子(FADH2)/FAD再生，可使PPA產(chǎn)量增加到31.4 g/L[21]；5)減少產(chǎn)物抑制。通過修飾PmirLAAD產(chǎn)物結(jié)合區(qū)域周圍的柔性環(huán)獲得4突變體PmLAADM4，突變體轉(zhuǎn)化酮纈氨酸的產(chǎn)物抑制率比野生型降低6.7倍[22]；6)拓展底物譜。通過蛋白質(zhì)工程改造，縮短氫化物轉(zhuǎn)移距離拓展了LAAD的底物譜，高效催化6種L-氨基酸的氧化脫氨，直接合成α-酮酸類化合物(產(chǎn)量>100 g/L，轉(zhuǎn)化率>90.0%)[5]。

圖2 FAD介導(dǎo)的H2O生成氨基酸脫氨酶的反應(yīng)原理

圖3 L-1-Nal與PmaLAAD分子對接[19]

3 FAD介導(dǎo)的L-氨基酸氧化酶

另一類FAD介導(dǎo)的脫氨酶是L-氨基酸氧化酶(LAAO)，在催化L-氨基酸發(fā)生C—N裂解反應(yīng)的同時，F(xiàn)ADH2將O2氧化成H2O2，并生成α-酮酸和氨(圖4)。LAAD的分類及其催化底物特異性[6，8，15，23]見表1。這一類酶廣泛存在動物(如毒蛇、哺乳動物的肝臟腎臟等器官)[24]、真菌[25]、藍藻[25]及細菌[25-28]中，不同來源的LAAO底物范圍不同，因此分為廣譜型和專一型兩類。

圖4 FAD介導(dǎo)的H2O2生成氨基酸脫氨酶反應(yīng)原理

表1 LAAD分類及其催化底物特異性

專一型LAAO主要包括L-谷氨酸氧化酶(LGOX，EC 1.4.3.11)[30-31]、L-天冬氨酸氧化酶(LASPO，EC 1.4.3.16)[32]、L-精氨酸氧化酶(LAROD，EC 1.4.3.25)[33]及甘氨酸氧化酶(ThiO，EC 1.4.3.19)[34-35]等。這一類酶只能催化單一的L-氨基酸或者類似物的C—N裂解反應(yīng)生成α-KG[31]、草酰乙酸[32]、2-酮精氨酸[33]、乙醛酸[35]以及氨和H2O2。目前對該類酶的研究主要包括: 1)通過核糖體結(jié)合位點(RBS)工程結(jié)合高密度發(fā)酵實現(xiàn)LGOX過表達，增加酶蛋白的產(chǎn)量，進而提升其發(fā)酵酶活力；2)通過包涵體復(fù)性的方式來提高E.coli表達LASPO的活性蛋白產(chǎn)量[32]；3)發(fā)現(xiàn)并表征了Pseudomonassp.TPU 7192 來源的LAROD，鑒定其為FAD依賴型酶，并表明在不去除L-Arg氧化形成的H2O2的情況下，2-酮精氨酸會經(jīng)過非酶催化轉(zhuǎn)化為4-胍基丁酸[33]；4)通過構(gòu)建B.subtilis168菌株實現(xiàn)ThiO可溶性表達，并全細胞轉(zhuǎn)化Gly生產(chǎn)乙醛酸[35]。此外，這些酶在催化反應(yīng)過程中產(chǎn)生H2O2可被H2O2電極捕獲，可用于臨床檢測、發(fā)酵生產(chǎn)、食品安全檢測、L-氨基酸的定量分析、生物傳感器、D/L-氨基酸的拆分等方面[30-31,36-37]。這些研究為解決L-谷氨酸氧化酶及L-天冬氨酸氧化酶表達量低這一難題提供了新的思路和方法，為對L-精氨酸氧化酶的結(jié)構(gòu)及底物特異性機制解析、蛋白質(zhì)工程改造與其催化氨基酸C—N裂解反應(yīng)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

除了上述酶外，目前已報道的底物專一性的H2O2生成型LAAO還有苯丙氨酸氧化酶[38]、色氨酸氧化酶[39]及賴氨酸氧化酶[40]，這些酶可催化其專一性的底物生成對應(yīng)的α-酮酸、氨和H2O2。與上述酶類似，該類酶的一個共性的問題是不易實現(xiàn)很好地異源表達，從而限制了該類酶在工業(yè)方面的應(yīng)用。未來可以通過蛋白質(zhì)工程策略實現(xiàn)這類酶的可溶性表達，加上結(jié)構(gòu)及機制解析，使這類酶更好地發(fā)揮其功能。

4 氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用

多酶級聯(lián)反應(yīng)通過將多個酶進行組裝，利用“一鍋煮”的方法從廉價易得的底物出發(fā)，合成高價值目標(biāo)產(chǎn)物。其中PLP介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶主要集中在多酶級聯(lián)生產(chǎn)L-2-氨基丁酸[9]、α-羥基酸(2-羥基丁酸)[3]及非天然α-酮酸[41]等產(chǎn)品；而FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶則主要集中在多酶級聯(lián)生產(chǎn)天然α-酮酸[5]、D型氨基酸及其衍生物(D-Phe[42]、D-Tyr[43]、D-Trp及其對應(yīng)的衍生物[44]、D-對羥基苯甘氨酸[45]和D-丹參素[46]等)、R/S-羥基酸(R/S-羥基蛋氨酸[47]、R/S-4-羥基苯基乳酸[48])、芳香醇[49-50]、7-氯吲哚-2-氨基丙酸[51]、α-氨基腈[52]、非天然α-氨基酸[52]和α-酮戊二酸[31]等產(chǎn)品(表2)。

表2 多酶級聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)精細化學(xué)品匯總

4.1 PLP介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用

L-Thr脫掉側(cè)鏈羥基后生成L-2-氨基丁酸(L-ABA),是合成抗癲癇藥物的重要前體。但自然界中沒有直接催化L-Thr形成L-ABA的酶，因此，研究者們設(shè)計了由TD、L-亮氨酸脫氫酶(LeuDH)和甲酸脫氫酶(FDH)組成的三酶級聯(lián)路徑(圖5(a))，并通過構(gòu)建共表達菌株、高密度發(fā)酵、全細胞轉(zhuǎn)化等策略，生產(chǎn)L-ABA產(chǎn)量達到68.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為99.0%[9]。2-羥基丁酸(2-HB)是生產(chǎn)左乙拉坦和布拉西坦等抗癲癇藥物的重要前體[41]。Yao等[10]通過構(gòu)建SeD-LDH和OcL-LDH和EcTD、CbFDH三酶共表達菌株，實現(xiàn)了L-Thr轉(zhuǎn)為78.0 g/L(R/S)-2-HB(圖5(b))，其轉(zhuǎn)化率≥90.0%，對映體過量(e.e.)值>99.0%[10]。非天然α-酮酸是精細化學(xué)合成中的重要組成部分，但目前缺乏用生物催化合成非天然α-酮酸的方法[41]。筆者所在的團隊設(shè)計了一個CgTD和蘇氨酸醛縮酶(TA)結(jié)合的雙酶級聯(lián)路徑，將Gly和醛轉(zhuǎn)化為9種多功能α-酮酸(圖5(c))，從而建立了高效合成α-酮酸的平臺[3]。

圖5 PLP介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應(yīng)

4.2 FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用

氨基酸脫氨酶廣泛應(yīng)用于催化L-型氨基酸合成D-氨基酸，典型案例包括: 1)由LAAD、內(nèi)消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(DAPDH)和葡萄糖脫氫酶(GDH)或甲酸脫氫酶(FDH)組成的三酶級聯(lián)反應(yīng)，催化α-氨基的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，用于催化合成D-Phe[42](產(chǎn)量57.8 g/L，轉(zhuǎn)化率96.3%，e.e.值>99.0%,圖6(a))和D-Tyr[43](產(chǎn)量18.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為45.3%，e.e.值>99.0%，圖6(a))；2)由苯丙氨酸裂合酶(PAL)[51]或色氨酸合成酶(TrpS)[44]、LAAD和D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAAT)組成的級聯(lián)反應(yīng)用于合成不同的苯丙氨酸[53](圖6(b))及色氨酸衍生物[44](圖6(c))；3)由LAAD、4-羥基扁桃酸合酶(HmaS)、(S)-扁桃酸脫氫酶(MDH)以及內(nèi)消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(DAPDH)四酶組成的級聯(lián)反應(yīng)可合成42.7 g/L D-對羥基苯甘氨酸(D-HPG)[45](轉(zhuǎn)化率為92.5%,圖6(d))；4)由酪氨酸酚裂解酶(TPL)、LAAD、D-乳酸脫氫酶(DLDH)和葡萄糖脫氫酶(GDH)四酶組成的多酶級聯(lián)反應(yīng)以鄰苯二酚和丙酮酸為原料，合成1.05 g/L D-丹參素(D-DSS)[46](圖6(e))。

圖6 FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應(yīng)生成D-Phe、D-Tyr、D-色氨酸衍生物、D-苯丙氨酸衍生物及D-丹參素

FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶可用于合成羥基蛋氨酸[47]及羥基苯基乳酸[48]，如由LAAD、D/L-LDH和FDH組成的級聯(lián)反應(yīng)(圖7(a))催化L-蛋氨酸合成羥基蛋氨酸(2-羥基-4-甲硫基丁酸)[47]，該級聯(lián)反應(yīng)的第一階段酮蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為99.6%，第二階段(R/S)-羥基蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率及e.e.值均大于95.8%[47]。而以L-Tyr 為底物，通過LAAD、D/L-HicDH和FDH組成的級聯(lián)催化路線(圖7(b))，可生成(R/S)-4-羥基苯基乳酸(4-HPLA)，轉(zhuǎn)化率及e.e.值均大于98.0%[48]。同樣以L-Tyr 為底物，由LAAD、丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醇脫氫酶(ADH)和GDH組成的級聯(lián)反應(yīng)則催化生成酪醇[49](圖8(a))，32 h總產(chǎn)量能達到35.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為93.6%[49]。另一研究案例是以L-Phe或L-Tyr為底物，由LAAD、羥杏仁酸合成酶(HmaS)、(S)-扁桃酸脫氫酶(MDH)、苯甲酰甲酸脫羧酶(BFD)和苯乙醛還原酶(PAR)組成的五酶級聯(lián)路線，可催化生成苯甲醇[50]或4-羥基芐醇[50](圖8(b))，最終轉(zhuǎn)化率分別為99.0%和93.6%。

圖7 FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應(yīng)用于生產(chǎn)(R/S)-羥基蛋氨酸及(R/S)-4-羥基苯基乳酸

圖8 FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應(yīng)用于生產(chǎn)酪醇、苯甲醇及4-羥基苯甲醇

4.3 FAD介導(dǎo)的氨基酸氧化酶在多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用

FAD介導(dǎo)的氨基酸氧化酶可用于合成蝴蝶霉素前體7-氯吲哚-2-氨基丙酸、α-氨基腈、非天然α-氨基酸和α-酮戊二酸，主要案例包括: 1)以L-Trp為底物由色氨酸-7-鹵化酶(Trp 7-halogenase)和LAAO級聯(lián)反應(yīng)生成7-氯吲哚-2-氨基丙酸，7-氯吲哚-2-氨基丙酸經(jīng)進一步的生物合成步驟可生成蝴蝶霉素,7-氯吲哚-2-氨基丙酸轉(zhuǎn)化率>90.0%[52](圖9(a));2)以苯丙氨酸為底物使用氨基酸氧化酶與化學(xué)HCN水解反應(yīng)級聯(lián)合成α-氨基腈，然后α-氨基腈在氰水解酶AY487533的催化下合成非天然α-氨基酸-2EtPG產(chǎn)量為28.6 g/L,轉(zhuǎn)化率達73.0%[53](圖9(b));3)以L-Glu為底物將LGOX和Kcat耦聯(lián)生產(chǎn)α-酮戊二酸，產(chǎn)量達103.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為 94.6%[31](圖9(c))。

圖9 FAD介導(dǎo)的氨基酸氧化酶參與多酶級聯(lián)反應(yīng)生成蝴蝶霉素、α-氨基腈(2EtPG)和α-酮戊二酸

5 結(jié)論與展望

針對氨基酸脫氨酶催化氨基酸C—N裂解脫氨反應(yīng)相關(guān)研究，國內(nèi)外的研究進展主要體現(xiàn)在2個方面：一是PLP介導(dǎo)的蘇氨酸脫氨酶的結(jié)構(gòu)解析、機制解析、蛋白質(zhì)工程改造及其在多酶級聯(lián)中的應(yīng)用；二是FAD介導(dǎo)的氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶的表達、蛋白質(zhì)工程改造及其在多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用。然而，由于氨基酸脫氨酶/氧化酶自身在原核生物中表達量低、三維結(jié)構(gòu)及其催化機制不夠清晰、催化效率低、底物范圍窄，轉(zhuǎn)化過程條件繁多且復(fù)雜等瓶頸問題，導(dǎo)致多酶級聯(lián)反應(yīng)路線合成的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度較低。因此，為了提高氨基酸脫氨酶/氧化酶的催化性能，今后的研究需要：1)利用X線衍射及冷凍電鏡等技術(shù)解析氨基酸脫氨酶/氧化酶三維晶體結(jié)構(gòu)并借助動力學(xué)模擬、量子力學(xué)及密度泛函理論，解析酶催化機制；2)通過蛋白質(zhì)工程改造策略對氨基酸脫氨酶/氧化酶進行理性改造，提高其催化性能；3)深入研究酶固定化技術(shù)，降低生產(chǎn)成本，為實現(xiàn)氨基酸C—N裂解的工業(yè)化應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。并將前述研究中涉及的重要新技術(shù)的革新意義延伸到生物催化領(lǐng)域中，主要包括：使用冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)新技術(shù)的革新指向結(jié)構(gòu)生物學(xué)方向；利用計算化學(xué)解析催化機制指向理論生物化學(xué)計算方向；蛋白質(zhì)理性改造新技術(shù)指向構(gòu)建小而精的突變文庫進而推進蛋白進化方向；酶固定化新技術(shù)為今后生物催化領(lǐng)域提出經(jīng)濟化應(yīng)用的方向。