曲守方 黃傳峰 李麗莉 黃杰

地中海貧血（簡稱地貧）是一種常見的常染色體單基因遺傳病，α?地貧和β?地貧是最常見的地貧類型［1?2］。它是目前我國南方地區(qū)在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）領(lǐng)域中數(shù)量最多的單基因遺傳病之一。胚胎植入前遺傳病檢測技術(shù)包括跨躍斷裂點PCR（Gap?PCR）、短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeats，STR）連鎖分析、單核苷酸多態(tài)性（Single?nucleotide polymorphisms，SNPs）分析和高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS）等方法［3?5］。NGS 已經(jīng)成為臨床上用于胚胎植入前染色體非整倍體、染色體結(jié)構(gòu)異常和單基因病檢測的主要檢測手段之一［6?8］。為使胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplanta?tion genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查更加規(guī)范并能夠有效地實施，我國專家制定了胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識［9］。

目前國內(nèi)已有公司開發(fā)胚胎植入前地中海貧血檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法），它是通過連鎖分析判斷胚胎是否遺傳了來自父母的地中海貧血基因突變。本研究使用胚胎植入前地中海貧血診斷國家參考品，評價基于半導(dǎo)體測序法的胚胎植入前地中海貧血檢測試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 樣本

胚胎植入前地中海貧血診斷國家參考品，包括4 個家系樣本，中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

1.2 試劑與儀器

胚胎植入前地中海貧血檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）和測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體測序法），蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司。

Qubit 4.0 熒光定量儀，美國Life Technology 公司；7500 實時熒光定量PCR 儀，Applied Biosystems公司；DA8600 基因測序儀，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 國家參考品檢測

按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，取家系樣本中的胚胎細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞裂解后，然后等溫擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的胚胎細(xì)胞基因組DNA 使用Qubit熒光定量儀進(jìn)行定量。取家系中其它樣本和胚胎細(xì)胞的基因組DNA 作為模板，擴(kuò)增選定區(qū)域，在擴(kuò)增后的DNA 片段兩端加上通用的測序接頭，構(gòu)建測序文庫。使用7500 實時熒光定量PCR 儀，對文庫進(jìn)行定量。根據(jù)文庫的定量結(jié)果，取等物質(zhì)的量的文庫進(jìn)行混合。根據(jù)測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體測序法）操作說明書，混合文庫使用DA8600 基因測序儀進(jìn)行測序。將下機數(shù)據(jù)使用胚胎植入前遺傳病檢測分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 國家參考品1 號家系

胚胎CNGB030013 的β 珠蛋白基因（hemo?globin beta gene，HBB）基因檢測結(jié)果：單體型結(jié)果為M1/F2（即遺傳CNGB030012 女方風(fēng)險染色體中國型δβ，CNGB030011 男方正常染色體βN）；其致病基因檢測結(jié)果為中國型δβ/βN。HBA基因的檢測結(jié)果：單倍體結(jié)果為M2/F1（即遺傳CNGB030012 女方正常染色體αα，CNGB030011男方風(fēng)險染色體α?3.7），其致病基因檢測結(jié)果為αα/α?3.7。見表1。HBB基因中SNP 位置5192095?5248243 的SNP 位點處于中國型δβ 缺失所在區(qū)域，SNP 位置5247992 的SNP 位點為CD41?42 突變位點所在區(qū)域。見表2。HBA基因中SNP 位置224619 和224647 的SNP 位點處于α?3.7缺失所在區(qū)域。見表3。

表1 國家參考品1 號家系結(jié)果Table 1 The result of national reference materials for family No.1

表2 HBB 基因連鎖分析結(jié)果Table 2 The result of HBB gene linkage analysis

表3 HBA 基因連鎖分析結(jié)果Table 3 The result of HBA gene linkage analysis

2.2 國家參考品2 號家系

胚胎CNGB030017 的α 珠蛋白基因（α?globin genes，HBA）基因檢測結(jié)果：單體型結(jié)果為M1/F2（即遺傳CNGB030016 女方風(fēng)險染色體ααCS，CNGB030015 男方正常染色體αα）；其致病基因檢測結(jié)果為ααCS/αα。見表4。HBA基因中SNP 位置221057?234632 的SNP 位點處 于??SEA缺失所在區(qū)域，SNP 位置223597 的SNP 位點處于CS 突變位點所在區(qū)域。見表5。

表4 國家參考品2 號家系結(jié)果Table 4 The result of national reference materials for family No.2

表5 HBA 基因連鎖分析結(jié)果Table 5 The result of HBA gene linkage analysis

2.3 國家參考品3 號家

胚胎CNGB030021 的HBB基因檢測結(jié)果：單體型結(jié)果為M2/F1（即遺傳CNGB030020 女方正常染色體βN，CNGB030019 男方風(fēng)險染色體中國型δβ）；其致病基因檢測結(jié)果為βN/中國型δβ。見表6。HBB基因中SNP 位置5214597?5249004 的SNP 位點處于中國型δβ 缺失所在區(qū)域，SNP 位置5247992 的SNP 位點處于CD41?42 突變位點所在區(qū)域。見表7。

表6 國家參考品3 號家系結(jié)果Table 6 The result of national reference materials for family No.3

表7 HBB 基因連鎖分析結(jié)果Table 7 The result of HBB gene linkage analysis

2.4 國家參考品4 號家系

胚胎CNGB030010 的HBB基因檢測結(jié)果：單體型結(jié)果為M2/F1（即遺傳CNGB030008 男方風(fēng)險染色體βIVS?II?654，CNGB030009 女方正常染色體βN）；其致病基因檢測結(jié)果為βN/βIVS?II?654。見表8。HBB基因中SNP 位置5247153 的SNP位點處于IVS?II?654 突變位點所在區(qū)域。見表9。

表8 國家參考品4 號家系結(jié)果Table 8 The result of national reference materials for family No.4

表9 HBB 基因連鎖分析結(jié)果Table 9 The result of HBB gene linkage analysis

3 討論

胚胎植入前單基因病遺傳學(xué)檢測是輔助生殖技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新的診斷技術(shù)。該檢測技術(shù)是通過囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢，取出滋養(yǎng)層細(xì)胞3～5 個，進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，經(jīng)過高通量測序及生物信息學(xué)分析后，選擇不帶致病基因突變的囊胚植入子宮繼續(xù)妊娠，達(dá)到優(yōu)生的目的。目前全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）是通過非選擇性地擴(kuò)增活檢的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的整個基因組DNA，為后續(xù)分析提供足量的DNA 模板，包括簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate oligonucleotide primer PCR，DOP?PCR）、多重置換擴(kuò)增（multiple displace?ment amplification，MDA）、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（multiple annealing and looping?based amplifica?tion cycles，MALBAC）等［10?11］。全基因組DNA 擴(kuò)增均勻性不夠，將降低覆蓋率和分辨率，并增加等位基因脫扣的幾率；擴(kuò)增精確性不夠，則將導(dǎo)致大量假陽性結(jié)果［12］，可通過單體型連鎖分析技術(shù)可有效提高檢測準(zhǔn)確性。注：M1 表示女方風(fēng)險染色體，M2 表示女方正常染色體；F1 表示南方風(fēng)險染色體，F(xiàn)2 表示男方正常染色體。

胚胎植入前地中海貧血檢測若直接對胚胎地貧致病位點進(jìn)行檢測具有一定的局限性，只針對部分已知的位點進(jìn)行檢測，無法覆蓋所有地貧的類型。同時在單細(xì)胞擴(kuò)增過程中易發(fā)生目標(biāo)區(qū)域丟失或者等位基因脫扣的情況，導(dǎo)致檢測失敗或造成假陽性、假陰性結(jié)果。胚胎植入前地中海貧血檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）是對α?地中海貧血相關(guān)基因HBA1、HBA2和β?地中海貧血相關(guān)基因HBB及其上下游連鎖的SNP 位點進(jìn)行檢測。根據(jù)先證者子代1 的兩條鏈分別來自父親和母親各一條鏈，構(gòu)建出單體型，然后根據(jù)胚胎的有效SNP 位點信息，判斷胚胎的基因型。胚胎中至少存在一個有效位點為雜合的基因型，才能構(gòu)建出單體型。為了避免由于DNA 重組導(dǎo)致假陽性或者假陰性，設(shè)計試劑盒時需要包含盡可能多的高頻突變的SNP 位點，從而在樣本中檢出盡可能多的有效位點。

中國食品藥品檢定研究院建立胚胎植入前地中海貧血診斷國家參考品，用于胚胎植入前的胚胎HBA和HBB基因突變檢測試劑盒的性能評價，適用方法學(xué)有高通量測序法、gap?PCR 法、一代測序法和芯片法。本研究結(jié)果顯示國家參考品4 個家系樣本的檢測結(jié)果均與標(biāo)示結(jié)果一致，未出現(xiàn)漏檢、假陽性或假陰性結(jié)果。評價的試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測出國家參考品的相應(yīng)基因型別。研究表明研制的國家參考品能夠滿足胚胎植入前地中海貧血檢測試劑盒質(zhì)量評價的要求。