雷靜 劉澤世 高興輝 湯一葦★ 耿燕★

碳青霉烯類抗菌藥物具有抗菌譜廣、對大多數(shù)β?內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、不易被水解、不良反應(yīng)相對較少的特點(diǎn)，是有效治療革蘭陰性桿菌嚴(yán)重感染的抗菌藥物之一。然而，在抗生素濫用問題日益嚴(yán)峻的今天，碳青霉烯類抗菌藥物也無法避免出現(xiàn)耐藥危機(jī)，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbap?enem?resistant Enterobacterales，CRE）的出現(xiàn)，無疑使臨床抗感染治療陷于無藥可用的境地［1］。CRE耐藥問題不容小覷，尤其是產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemase?producing Enterobacterales，CPE），早期快速、準(zhǔn)確地檢測CPE 是遏制其傳播的關(guān)鍵，也有助于精準(zhǔn)用藥治療［2］。

1 CRE 定義

美國疾病預(yù)防與控制中心（centers for disease control and prevent，CDC）將CRE 定義為滿足以下任一條件：①腸桿菌目細(xì)菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥；對亞胺培南天然敏感性降低的細(xì)菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結(jié)果；②產(chǎn)碳青霉烯酶［3］。

2 CRE 耐藥機(jī)制

產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE 耐藥最主要的機(jī)制，其余耐藥機(jī)制還包括外膜孔蛋白缺失或突變協(xié)同AmpC 酶或超廣譜β?內(nèi)酰胺酶的表達(dá)、外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)［4?5］。根據(jù)Ambler 分子分類方法，可將碳青霉烯酶分為A、B 和D 三類。見表1。

表1 碳青霉烯酶分類Table 1 classification of carbapenemases

3 CRE 表型檢測方法

3.1 Carba NP 試驗(yàn)

Carba NP 試驗(yàn)是2015年CLSI 推薦的對CPE和產(chǎn)碳青霉烯酶銅綠假單胞菌的一種檢測方法，其原理為碳青霉烯酶水解亞胺培南后導(dǎo)致溶液PH值改變而發(fā)生顏色變化。據(jù)報道，Carba NP 試驗(yàn)檢測腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)KPC、NDM、VIM、IMP 等碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均>90%，但由于OXA?48 對碳青霉烯類藥物活性較弱，導(dǎo)致其結(jié)果具有較高的假陰性。因此，Carba NP 試驗(yàn)在OXA?48 高流行區(qū)域（如土耳其和其他中東地區(qū)等）不具備檢測優(yōu)勢［6?7］。另外，進(jìn)行Car?ba NP 試驗(yàn)應(yīng)選用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行菌株培養(yǎng)。研究表明，從麥康凱和顯色培養(yǎng)基獲取的菌株在檢測VIM 或OXA?48 存在假陰性，而使用MH 平板時，當(dāng)菌株同時攜帶OXA?48 和NDM/VIM 時，結(jié)果存在假陰性［8?9］。

3.2 改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)

2017年，CLSI 推薦改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）用于檢測CPE。2018年，增加了EDTA 改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（EDTA?modified carbapenemase in?activation method，eCIM），根據(jù)碳青霉烯酶可水解美羅培南以及EDTA 可抑制金屬β?內(nèi)酰胺酶活性的原理，可區(qū)分細(xì)菌產(chǎn)酶類型。研究表明，mCIM檢測CPE 的靈敏度和特異度均為100%；eCIM 區(qū)分絲氨酸酶的靈敏度和特異度分別為100%、95.1%，MBLs 的靈敏度和特異度為98.4%和100%，若待測菌株同時存在絲氨酸酶和MBLs，eCIM 試驗(yàn)結(jié)果將出現(xiàn)誤差［10?12］。

3.3 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)

根據(jù)3?氨基苯硼酸和乙二胺四乙酸可分別抑制絲氨酸酶和金屬β?內(nèi)酰胺酶活性的原理，可判斷待測菌株產(chǎn)酶類型，但無法檢測OXA 酶［13］。研究顯示，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測單一酶型菌株的靈敏度為100%，特異度>98.8%，檢測同時產(chǎn)絲氨酸酶和MBLs 的靈敏度為96.8%，特異度為100%［14］。

3.4 質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix?assisted laser desorption ionization time?of?flight mass spectrometry，MALDI?TOF MS）是近年來快速發(fā)展起來的一種檢測生物大分子的重要手段，被認(rèn)為是快速鑒定臨床微生物的新利器，通過測定蛋白特征峰或碳青霉烯類藥物結(jié)構(gòu)的完整性檢測酶的存在。結(jié)合目前研究結(jié)果，MALDI?TOF MS 技術(shù)檢測KPC 酶的靈敏度和特異度分別為85.1%和100%［15?16］。目前MALDI?TOF MS 在此方面的研究存在異質(zhì)性且無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法，進(jìn)行酶水解法時某些抗菌藥物溶液需自配，并需與待測菌共孵育1～2.5 h，且不同酶型孵育時間不同。

3.5 顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基已廣泛應(yīng)用于臨床微生物的鑒別診斷，其原理為目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生的特異性酶作用于底物而長成有色菌落，由于添加抗菌藥物或其他抑制劑，非目標(biāo)性細(xì)菌生長受限，可從樣本中直接分離出CRE。近年來，不同廠家研發(fā)了不同CRE商品化產(chǎn)品，如Brilliance CRE、bioMérieux chromID Carba、CHROMagar Colorex KPC 等。兩項(xiàng)研究表明，與PCR 相比，以上3 種顯色培養(yǎng)基的靈敏度分別為77.6%～78.0%、89.8%～91.0%和56.0%～83.7%，特異度分別為60.0%～87.1%、76.0%～95.0%和70.0～92.1%，但其對OXA?48 的檢測能力有待提高［17?18］。此外，一些產(chǎn)中間型碳青霉烯酶（NDM?1）菌株可能生長不良［19］。CRE 表型檢測方法。見表2。

表2 CRE 表型檢測方法Table 2 CRE phenotypic testing methods

4 碳青霉烯酶基因型檢測

碳青霉烯酶基因型檢測是檢測能夠編碼碳青霉烯酶的DNA 序列。其主要檢測方法包括靶向基因檢測和二代測序。與表型方法相比，基因型方法的優(yōu)勢是能夠檢測并明確碳青霉烯酶基因型，檢測速度快，節(jié)省時間；劣勢是技術(shù)要求高，不能確定基因是否表達(dá)，檢測成本高。見表3。

表3 CRE 耐藥基因檢測方法Table 3 CRE resistance genotype detection methods

4.1 酶免疫層析技術(shù)

酶免疫層析技術(shù)是一種以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，用于體外快速檢測陽性血培養(yǎng)物以及純菌落中碳青霉烯酶。近年來，不同廠家基于此技術(shù)推出不同的試劑盒，如NG?Test CARBA 5、RESIST?4 O.K.N.V.和免疫顯色試劑，可對blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP（RESIST?4 O.K.N.V.不能檢測）和blaOXA?48進(jìn)行檢測。研究顯示，酶免疫層析技術(shù)檢測碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均>92.0%，但當(dāng)細(xì)菌攜帶2 種或以上的酶型后，酶免疫層析方法只能檢測到部分酶型從而產(chǎn)生重大錯誤［20?21］。

4.2 Carba?R Assay

Carba?R Assay 是一種熒光定量PCR 檢測方法，可在50 min 內(nèi)檢測直腸拭子、尿液和純菌落中5 種碳青霉烯酶。一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn)，在直腸拭子和臨床菌株中，與測序結(jié)果相比，Carba?R 檢測碳青霉烯酶基因的總陽性符合率分別為96.0%和99.7%，總陰性符合率分別為94.0%和98.0%［22］。此外，在301 份痰標(biāo)本中，Carba?R Assay 與PCR 方法相比，其陽性一致率和陰性一致率分別為92.9%和86.7%［23］。而檢測血流感染菌株和陽性血培養(yǎng)物時，Carba?R 特異度為100%，NG?Test CARBA5和Carba?R 檢測菌株的靈敏度分別為92.1%和100.0%，陽性血培養(yǎng)物的靈敏度分別為79.3%和100%［20］。應(yīng)用Carba?R 對CPE 定植患者進(jìn)行快速篩查，可將CPE 的定植率從28.6%降至5.6%，感染率從35.7%降至2.8%，有效地限制了其在醫(yī)療環(huán)境中傳播［24］。

4.3 BDMAX

BD MAX 是一種單試劑、即用、全自動的多重實(shí)時PCR 體外診斷產(chǎn)品，能夠檢測菌株和直腸拭子中的blaKPC、blaNDM、blaVIM/blaIMP和blaOXA?48基因。一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，BD MAX 檢測碳青霉烯酶的靈敏度和特異度可達(dá)97.1%和98.8%，但不能檢測到IMP?11、IMP?13、IMP?14 和OXA?535 突變體，而在直腸拭子標(biāo)本中，其靈敏度和特異度分別為92.8%和97.8%［25］。由于VIM 和IMP 之間缺乏區(qū)分，可能會限制BD MAX 在這些酶廣泛流行的地區(qū)應(yīng)用。

4.4 LightMix Modular Carbapenemases Kits

LightMix Modular Carbapenemases Kits 是一種多重PCR 方法，可根據(jù)需求選擇檢測靶標(biāo)數(shù)量，操作時間約5 min，90 min 內(nèi)報告結(jié)果。與測序結(jié)果相比，其對118 份臨床分離株的總體敏感性和特異性分別為99%和100%，且在CPE 定植患者中，Light?Mix Modular Carbapenemases Kits 與Xpert Carba?R檢測結(jié)果一致［26］。

4.5 ePlex BCID?GN panel

ePlex BCID?GN panel 是一種采用電潤濕和電子傳感器技術(shù)對血培養(yǎng)陽性瓶進(jìn)行提取、擴(kuò)增和競爭性DNA 雜交，可鑒定56 種細(xì)菌和真菌以及包括碳青霉烯酶在內(nèi)的β?內(nèi)酰胺酶檢測試劑盒。研究顯示，BCID?GN panel 對碳青霉烯酶的PPA 和NPA 分別為98.1%和99.9%［27］。

4.6 Verigene Gram?negative blood culture test

Verigene Gram?negative blood culture test 是一種非擴(kuò)增方法，其依賴于從陽性血培養(yǎng)物中提取核酸，然后使用捕獲和檢測探針進(jìn)行基于微陣列的檢測。一項(xiàng)多中心研究表明，Verigene 與參考方法相比，對5 種碳青霉烯酶基因的陽性一致率>94.3%，陰性一致率>99.9%［28］。若陽性血培養(yǎng)物中為混合菌，Verigene 則無法確定耐藥基因與特定細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)［29］。

4.7 FilmArray BCID2

FilmArrayBloodCultureIdentification2（BCID2）采用巢式多重PCR 技術(shù)，可在1 h 內(nèi)檢測包括blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA?48?like、blaVIM在內(nèi)的10 種耐藥基因［30］。一項(xiàng)研究顯示BCID2 鑒定微生物種類的靈敏度和特異度分別為98.8%和99.9%，檢測耐藥基因的靈敏度和特異度均為100%［31］。然而，在FilmArray 上進(jìn)行測試的成本超過100 美元，這限制了該方法在低中度流行環(huán)境下檢測blaKPC的實(shí)用性。

4.8 二代測序

全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）被認(rèn)為是檢測碳青霉烯酶基因的最全面的分子檢測方法，它還可測定除碳青霉烯酶外的其他耐藥基因。在過去十年中，WGS 的成本急劇下降，在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用已指日可待。然而，在將該技術(shù)納入常規(guī)臨床微生物學(xué)之前，還需要克服一些障礙，包括周轉(zhuǎn)時間長和數(shù)據(jù)管理困難。宏基因組測序與WGS 類似，但它是直接從臨床樣本（如痰）中獲得DNA，由于數(shù)據(jù)分析的高成本和復(fù)雜性，目前還不足以對感染進(jìn)行評估。

5 質(zhì)控菌株選擇

進(jìn)行以上碳青霉烯酶實(shí)驗(yàn)室檢測時，應(yīng)同時測試相應(yīng)的陽性和陰性質(zhì)控菌株。首選的陽性質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA?1705（產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA?2146（產(chǎn)NDM 型金屬β?內(nèi)酰胺酶）和肺炎克雷伯菌ATCC BAA?2524（產(chǎn)OXA?48 型碳青霉烯酶），首選的陰性質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌BAA?1706（不產(chǎn)碳青霉烯酶）。若實(shí)驗(yàn)室不具備上述首選質(zhì)控菌株，可選擇經(jīng)DNA 測序后相應(yīng)已明確的碳青霉烯酶基因型作為陽性質(zhì)控菌株，而陰性質(zhì)控菌株可選擇大腸埃希菌ATCC 25922［13］。

6 小結(jié)和展望

目前實(shí)驗(yàn)室的CRE 表型檢測方法，靈敏度較高、操作方便、價格較低，但存在特異度較低、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、耗時較長等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步使用。隨著CRE 基因型方法的出現(xiàn)，提高了檢測的靈敏度和特異度，且操作簡單，但也只能檢測已知基因，不能檢測未知基因。全基因測序方法彌補(bǔ)這個缺陷，能夠檢測已知和未知CRE 基因，這能夠幫助臨床解決疑難問題。

隨著CRE 在包括中國在內(nèi)的全球范圍內(nèi)不斷地蔓延，一些菌株攜帶CRE 酶型種類和數(shù)量也在增加。未來的CRE 實(shí)驗(yàn)室檢測方法和應(yīng)用可能有下面一些趨勢：第一是檢測樣本的類型會拓展，除了已應(yīng)用的菌落、陽性血培養(yǎng)物以及肛拭子以外，呼吸道標(biāo)本可能獲得更多的應(yīng)用。第二是在檢測CRE 存在的前提下，迅速對其酶型進(jìn)行判斷，可用于臨床指導(dǎo)治療依據(jù)。第三是既往菌種鑒定基礎(chǔ)上的耐藥性檢測有望被快速的CRE 酶型檢測的“功能性”鑒定所取代。