張昶 韓超 黃南祺 吳小兵 徐學虎

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常見癌癥和第四大癌癥相關(guān)死亡病因［1］。我國的CRC 綜合發(fā)病率和死亡率分別排第三位和第五位，且總體仍呈上升趨勢［2］。研究顯示，結(jié)直腸癌在診斷時已有約1/4 患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，接受治療的患者中仍有約一半發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。目前，結(jié)直腸鏡與組織病理學檢查由于侵入性高，難以為患者提供精準的預(yù)后信息［4］。結(jié)直腸癌的療效評價主要以影像學檢查RECIST1.1 為標準，但由于費用高及滯后性等因素影響，實用性并不高；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等血清腫瘤標志物檢測結(jié)果也僅用于參考［5］。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是因各種原因脫離原發(fā)實體腫瘤，進入血液并游離其中的腫瘤細胞。CTCs 可在靶器官增殖并形成轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致遠處器官的繼發(fā)性腫瘤，故CTCs 與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移緊密相連。CTCs 的基本檢測方法為從患者的體液樣本中獲取生物標志物，又被稱為“液體活檢”［6］，其中外周血最為常見。與傳統(tǒng)組織病理學檢查相比，CTCs 檢測具有微創(chuàng)、易于重復(fù)、取材簡單等優(yōu)點，可發(fā)現(xiàn)早期難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移［7］。目前CTCs 已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準用于監(jiān)測乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的疾病進展以及臨床評估患者的預(yù)后與治療療效［8］。本文就CTCs 在結(jié)直腸癌的預(yù)后評估與療效評價中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

1 CTCs 檢測與富集技術(shù)

1.1 標記依賴性檢測技術(shù)

CTCs 檢測和分離最廣泛使用的方法是基于免疫親和力的檢測。由于CTCs 不同程度表達上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratin，CK）等上皮標志物，上皮標志物抗體可與磁性納米顆粒偶聯(lián)或修飾在微流控芯片的溝道上，通過陽性或陰性富集策略進行CTCs 捕獲［9］。標記依賴性檢測技術(shù)的代表性平臺之一是CellSearch 系統(tǒng)，它使用EpCAM 包被的納米磁珠來選擇EpCAM 陽性的細胞，再通過免疫染色確認CK8、18 的高表達和CD45 的不表達的CTCs［10］。Cohen 等［11］利用Cell?Search 系統(tǒng)檢測了430 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（meta?static colorectal cancer，mCRC）患者外周血中CTCs 數(shù)量，得出CTCs 數(shù)量是影響mCRC 患者無進展生存期（progression?free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的獨立因素。AdnaTest平臺（AdnaGen AG，Langenhagen，德國）則依賴于抗體混合物包被的磁珠，以增強結(jié)直腸癌中CTCs的捕獲和富集；再通過多重反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)技 術(shù)（reverse transcription?polymerase chain reac?tion，RT?PCR）檢測各種基因（如HER?2、MUC?1和KRAS）的突變［12］。該平臺通過結(jié)合兩種方法來提高CTCs 檢測的靈敏度以及更好的異質(zhì)性表征。CellMax 檢測平臺是一種基于微流控芯片技術(shù)的單一特異性的EpCAM 依賴性檢測方法，可從外周血中準確富集CTCs。Tsai 等［13］通過CellMax平臺將捕獲的CTCs 計數(shù)與不同CRC 分期（腺瘤，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）相關(guān)聯(lián)，結(jié)果在各階段均顯示出高特異性（86%），驗證了其作為早期癌癥檢測方法的可靠性。

1.2 基于CTCs 物理特性的檢測技術(shù)

CTCs 的細胞分析顯示，與正常細胞相比，CTCs 的生物物理特性表現(xiàn)出明顯不同。它們具有更大的核漿比、更大的尺寸、不同的核形態(tài)，以及與正常細胞不同的電學特性［14］。物理法可不依賴表面標記物富集到更多子類的CTCs，具有廣闊前景。ISET（RareCells Diagnostics，Paris，法國）是利用CTCs 細胞大小及其細胞結(jié)構(gòu)的剛性特性進行分離富集的平臺，其主要優(yōu)勢在于靈敏度高，所需血液標本量少，可在不破壞細胞形態(tài)的基礎(chǔ)上分離上皮細胞［15］。OncoQuick（Greiner Bio?One International GmbH，F(xiàn)rickenhausen，德國）和Ficoll?Paque（GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，瑞典）是基于沉降系數(shù)的差異來分離CTCs 的典型密度梯度離心方法。與Ficoll 相比，OncoQuick分離純度高，CTCs 捕獲率也有一定提升［16］。近年來，基于CTCs 大小原理的微流控芯片也被開發(fā)出來，被稱為“三維過濾”。Parsortix 系統(tǒng)是將微流控芯片構(gòu)建為3D 幾何形狀，并通過寬度逐漸減小的階梯樣結(jié)構(gòu)以捕獲CTCs 的技術(shù)平臺。該平臺對于不同來源腫瘤細胞的捕獲率為42%～70%，且捕捉的CTCs 活性率達到了99%［17］。最近，Su 等［18］根據(jù)CTCs 與正常血細胞間大小與變形能力的差異，研發(fā)出一種新的集成微流控裝置用于CRC 患者外周血CTCs 的分離，結(jié)果顯示在3 小時內(nèi)所有晚期CRC 患者的外周血樣本中均成功捕獲到CTCs。

2 CTCs 在CRC 預(yù)后評估中臨床價值

CTCs 作為一種潛在微轉(zhuǎn)移灶，其在外周血中的存在與腫瘤患者的死亡結(jié)局密切相關(guān)［19］。有研究報道，對CTCs 數(shù)量及其動態(tài)變化過程進行監(jiān)測可預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后，與TNM 分期聯(lián)合應(yīng)用則可更精確地預(yù)測患者預(yù)后［20］。許多研究也表明，CTCs 對非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC 預(yù)后的評估均具有極高價值。對于非轉(zhuǎn)移性CRC，CTCs 可預(yù)測未來的轉(zhuǎn)移和較差的疾病預(yù)后；而在mCRC 患者樣本中鑒定出CTCs 則可能表明轉(zhuǎn)移病灶的形成［21］。Bork 等［22］研究發(fā)現(xiàn)CTCs 計數(shù)及手術(shù)前后CTCs 的動態(tài)變化可預(yù)測非轉(zhuǎn)移性CRC 的預(yù)后，而術(shù)前CTCs 檢測更是非轉(zhuǎn)移性CRC 一個有力的獨立預(yù)后標志物。在Cohen 等［11］針對430 例mCRC患者的研究中，≥3 個CTCs/7.5 mL 與PFS 和OS 縮短相關(guān)；而在化療治療5 周內(nèi)，基線CTCs 計數(shù)從≥3 轉(zhuǎn)變?yōu)?3 則與較長的PFS 和OS 相關(guān)。另一研究則發(fā)現(xiàn)在基線CEA≥25 ng/mL 的患者中，基線CTCs<3 的患者OS 更長；而在治療后CEA 降低相似的患者中，CTCs 水平不同的患者也表現(xiàn)出差異較大的預(yù)后［23］。這表明CTCs 與CEA 的聯(lián)合檢測可更精準地評估預(yù)后。

CTCs 各亞型的預(yù)后價值也有所差異。有報道稱，上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal tran?sition，EMT）過程與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移緊密相連，導(dǎo)致上皮標志物表達下調(diào)，使基于EPCAM 的CTCs 檢測技術(shù)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［24］。Kozuka等［25］對mCRC 患者CTCs 樣本于單細胞水平進行RNA 測序，結(jié)果顯示EMT 型CTCs 比上皮CTCs更常被檢測到，且與mCRC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。CTCs 也可用于針對原發(fā)腫瘤病灶的基因檢測，進而評估CRC 患者的預(yù)后。Denis 等［26］通過微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）對35 名CRC 患者的CTCs 樣本進行KRAS基因狀態(tài)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs 與相應(yīng)腫瘤組織間的一致性為77%，敏感性為83%。這一數(shù)據(jù)表明，從CRC 患者的血液樣本中檢測CTCs 中KRAS 突變可用于預(yù)測原發(fā)腫瘤中的突變，從而改善患者預(yù)后。另有研究報道，侵襲性CTCs 大多表達CD133、CD44 和CD54+，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs 高表達意味著更短的生存期及更差的預(yù)后［27］。綜上，相關(guān)研究充分體現(xiàn)出CTCs 在結(jié)直腸癌中不同層面的預(yù)后價值。

3 CTCs 在CRC 療效評價中臨床價值

3.1 CTCs 在非轉(zhuǎn)移性CRC 中的療效評估

對于非轉(zhuǎn)移性CRC 患者，手術(shù)是行之有效的首選治療手段，術(shù)前檢測到的CTCs 正是影響癌癥進展和生存的有效預(yù)后因素［28］；同時，手術(shù)操作也會影響外周血CTCs 數(shù)量。Wind 等［29］研究顯示，與術(shù)前相比，術(shù)中CTCs 的檢出率和數(shù)量顯著增加，且開腹手術(shù)檢測到的CTCs 明顯多于腹腔鏡手術(shù)。有報道顯示，接受原發(fā)腫瘤手術(shù)切除的CRC患者術(shù)后外周血中CTCs 數(shù)量會明顯減少，表明手術(shù)已發(fā)揮治療作用；反之，高CTCs 水平則表明術(shù)后的轉(zhuǎn)移風險增加［30］，術(shù)后持續(xù)存在CTCs 也與患者的無復(fù)發(fā)生存期（relapse?free survival，RFS）縮短和預(yù)后不良密切相關(guān)［31］。Yang 等［32］通過研究138 例行根治術(shù)CRC 患者的RFS，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs 陽性是預(yù)后不良的獨立指標，且與術(shù)前CTCs 陽性無關(guān)。最近也有研究表明，當非轉(zhuǎn)移性CRC 患者的術(shù)后CTCs<3 或術(shù)后CTCs 數(shù)量比術(shù)前CTCs 數(shù)量減少或持平時，表現(xiàn)為良好預(yù)后；反之則表現(xiàn)為不良預(yù)后［33］。綜上，CTCs 數(shù)量變化可反映非轉(zhuǎn)移性CRC 患者的手術(shù)治療效果，對手術(shù)療效作出評價。

3.2 CTCs 在mCRC 中的療效評估

據(jù)報道，約50%～60%的CRC 患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中80%～90%的患者患有不可切除的肝臟病變［34］。近年來，mCRC 的治療取得了顯著進展，從OS 約11～12 個月發(fā)展到如今的平均OS 達到3年［35］。不過，mCRC 的高度異質(zhì)性依舊阻礙著靶向治療策略和個體化治療方案的優(yōu)選，臨床上需要預(yù)后標志物來監(jiān)測化療反應(yīng)，對mCRC 患者的化療療效進行評價。Cohen 等［11］首次報道了CTCs 計數(shù)可作為患者預(yù)后的指標以及評估m(xù)CRC患者化療療效的標志物，目前已被FDA 批準用于臨床實踐。此外也有報道稱，CTCs 是mCRC 患者PFS 和OS 的獨立預(yù)測因素，也是一線治療有效性評估的關(guān)鍵因素［36］。

目前，CEA 是監(jiān)測mCRC 對全身治療反應(yīng)的首選標志物。然而，S?rbye 等［37］的研究指出，在接受含奧沙利鉑化療治療的CRC 患者中盡管出現(xiàn)了客觀緩解，而CEA 水平卻一過性升高，這一現(xiàn)象說明了CEA 作為療效評價標志物的不穩(wěn)定 性。Satoshi 等［38］通過一項基于64 名接受奧沙利鉑治療的mCRC 患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，相較于CEA，CTCs 水平并未出現(xiàn)激增，表明在監(jiān)測mCRC 對全身治療的反應(yīng)方面，CTCs 是比CEA更有效的標志物。由于CTCs 通過提前識別潛在轉(zhuǎn)移，確定患者對化療是否耐藥進而評估化療療效，故在化療過程中，CTCs 持續(xù)存在提示腫瘤對化療不敏感，若檢測到CTCs 在化療過程中持續(xù)變化則提示腫瘤對化療敏感。Tan 等［39］通過研究mCRC 化療過程中CTCs 和CTCs 相關(guān)miRNAs 的變化情況，發(fā)現(xiàn)CTCs 與miRNA 聯(lián)合時可更好地反映療效及疾病進展狀況。此外，Javier 等［40］研究發(fā)現(xiàn)CTCs<3/7.5 mL 的KRAS野生型腫瘤患者的PFS 和OS 均高于CTCs>3/7.5 mL 的KRAS突變型腫瘤患者，CTCs 計數(shù)和KRAS狀態(tài)是接受貝伐單抗化療治療的mCRC 患者的獨立預(yù)后因素。這些研究表明，CTCs 與其它靶點或生物標志物的聯(lián)合檢測在mCRC 患者療效評價方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

4 小結(jié)與展望

通過近些年研究的不斷深入，CTCs 檢測作為新型液體活檢技術(shù)已應(yīng)用于多種腫瘤領(lǐng)域，其相關(guān)技術(shù)在不斷進步，應(yīng)用領(lǐng)域也在持續(xù)擴大。與傳統(tǒng)影像學檢查和組織病理學檢查相比，CTCs 檢測具有微創(chuàng)、快速等優(yōu)勢，在腫瘤性疾病的早期診斷、療效評價及預(yù)后評估等方面都具有巨大潛能。但是，CTCs 的臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用依舊面臨著諸多挑戰(zhàn)，如檢測技術(shù)缺陷、檢測結(jié)果的假陽性率與假陰性、缺乏關(guān)于CTCs 標準方面的共識等。在結(jié)直腸癌療效及預(yù)后評估方面，目前研究已表明CRC 患者外周血CTCs 數(shù)量與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，基于CTCs 水平的動態(tài)監(jiān)測也是預(yù)后及療效評價有價值的臨床工具。將CTCs 與CEA等生物標志物同時檢測，可多層面地提高CRC 患者療效評價的精確性。雖然目前還面臨著樣本量不夠大、檢測手段缺陷等導(dǎo)致的可靠性不足的問題，但隨著本領(lǐng)域研究者的不斷拓展，如針對CRC 特性進行多次多時間點CTCs 檢測、與多生物標志物及基因位點聯(lián)合檢測等，CTCs 在結(jié)直腸癌患者治療及預(yù)后評價中的重要性將會充分得到體現(xiàn)。