來(lái)歡歡,張凱悅,田青,董晉文,趙微,崔美林,張秀紅*

1(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原,030031) 2(山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,山西 太原,030031)

自溶酶是細(xì)菌合成用以降解細(xì)胞壁肽聚糖的酶類,也稱肽聚糖水解酶(peptidoglycan hydrolase,PGH)[1-2]。細(xì)菌快速生長(zhǎng)時(shí),合成的自溶酶作用于細(xì)胞壁肽聚糖形成孔洞和縫隙[3-4],可插入新合成的肽聚糖使細(xì)胞體積增大,自溶酶還有助于子細(xì)胞的分離[5],在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖中起作用。此時(shí),只有細(xì)胞壁特定部位肽聚糖限定程度的水解,保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng),才不會(huì)合成過(guò)多的自溶酶導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡,因此,自溶酶的活性需要極為精準(zhǔn)的調(diào)控[6]。在細(xì)菌進(jìn)入衰亡期時(shí)也會(huì)合成PGH以及其他水解酶類,在細(xì)菌細(xì)胞程序性死亡中起作用。細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖是由糖鏈、肽尾和肽橋組成的單體連成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7],為了精確控制肽聚糖的水解,細(xì)菌細(xì)胞往往編碼多種PGH,如N-乙酰葡萄糖苷糖胺酶,N-乙酰胞壁質(zhì)酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、內(nèi)肽酶和羧肽酶以及轉(zhuǎn)糖基酶[8]。

乳酸菌是一類重要的益生菌,在多種發(fā)酵食品生產(chǎn)中都需要其大量生長(zhǎng)繁殖以發(fā)揮作用[9-10]。但有時(shí)也需要控制乳酸菌的生長(zhǎng),如酸奶后熟過(guò)程中需要抑制乳酸菌的生長(zhǎng)[11-12],以減少酸度的增加及過(guò)多的乳清形成。在白酒釀造過(guò)程中,乳酸菌產(chǎn)生乳酸,降低酒醅pH,促進(jìn)酒精發(fā)酵順利進(jìn)行,而且乳酸及其酯化形成的乳酸乙酯均是白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)[13],乳酸菌在白酒釀造中起到重要作用。但是,每年春末夏初酒醅中的乳酸菌大量增殖會(huì)導(dǎo)致乳酸過(guò)量,既降低新酒產(chǎn)量,過(guò)多的乳酸乙酯又改變了新酒主體風(fēng)味物質(zhì)比例,影響了新酒質(zhì)量[14],是白酒生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題。本文以酒醅來(lái)源的高自溶度L.plantarumSL32-2為研究對(duì)象,考察其自溶酶的酶學(xué)性質(zhì)及底物特異性,為白酒生產(chǎn)過(guò)程中乳酸菌的控制提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

菌株：LactobacillusplantarumSL32-2從某清香型白酒廠地缸上層酒醅中分離(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

主要試劑：MRS培養(yǎng)基,生物試劑,北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;KH2PO4、LiCl、MgCl2,均為分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;馬脲酰-L-苯丙氨酸、對(duì)硝基乙酰苯胺、牛血紅蛋白、對(duì)硝基苯胺,均為分析純,上海宇淳生物科技有限公司;二硝基水楊酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),均為分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;檸檬酸，分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限責(zé)任公司;NaOH、苯酚,均為分析純,洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠。

DNS試劑：酒石酸鉀鈉18.2 g,溶于50 mL蒸餾水中,加熱,于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸0.03 g,NaOH 2.1 g,苯酚0.5 g,攪拌至完全溶解。

茚三酮試劑：稱取茚三酮1 g于盛有35 mL熱水的燒杯中使其溶解,加入40 mg氯化亞錫,攪拌過(guò)濾(作防腐劑)。濾液置冷暗處過(guò)夜,加水至50 mL,搖勻備用。

LiCl-Tris(pH 8.0)緩沖液：配制0.05 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),加入0.01 mmol/L MgCl2和0.001 mmol/L EDTA,待溶解后,加入1 mol/L LiCl,放入4 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與設(shè)備

GI80DS高溫滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司;PHS-3C型酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;ZHJH-C1112B智城超凈工作臺(tái)、ZXMP-R1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司;KQ-3OOE型超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司;可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;D-37520低速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī),貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 菌株的活化

將L.plantarumSL32-2接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生長(zhǎng)曲線繪制與自溶度測(cè)定

生長(zhǎng)曲線繪制：將活化后的L.plantarumSL32-2以2%(體積分?jǐn)?shù),下同)的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng),定期取樣測(cè)OD650 nm值。

自溶度測(cè)定[15]：與生長(zhǎng)曲線繪制時(shí)同時(shí)取樣,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,無(wú)菌水洗滌2次,重懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(50 mmol/L,pH 6.5),取部分樣品測(cè)定初始OD650 nm,讀數(shù)記為A0,剩余樣品置于37 ℃繼續(xù)溫育72 h后,測(cè)定OD650 nm,讀數(shù)記為At,自溶度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 自溶酶的制備

將活化的L.plantarumSL32-2以2%的接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)4 h后,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,并用無(wú)菌水洗滌2次,懸浮于1 mL濃度為1 mol/L LiCl的抽提液中,4 ℃靜置1 h,離心(12 000×g,15 min,4 ℃)收集上清液,經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后即自溶酶粗酶液[16]。

1.3.4 自溶酶作用底物的提取

將活化后的L.plantarumSL32-2以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)4 h后,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,然后用無(wú)菌水洗滌2次后,4 ℃保藏備用。

1.3.5 自溶酶活性檢測(cè)

將自溶酶粗酶液加入到底物乳酸菌PBS中,調(diào)整菌液吸光值為0.3左右,記為A0,將乳酸菌PBS調(diào)整到相同的吸光度值作為對(duì)照。在37 ℃恒溫條件下分別反應(yīng)2、4 h后測(cè)OD600 nm,自溶酶處理組記為A1,對(duì)照組記為A2,自溶酶的活性計(jì)算如公式(2)所示[17]：

(2)

1.3.6 底物特異性

還原糖含量測(cè)定用DNS法,具體參考王明瑞等[18]的方法。氨基酸含量測(cè)定用茚三酮比色法,具體參考鄧湘波等[19]的方法。

β-N-乙酰-葡萄糖胺酶活性測(cè)定：以對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷為顯色底物,3 mL的反應(yīng)體系中加入0.9 mL的PBS(0.1 mol/L,pH 7.0),0.1 mL底物溶液(1 mmol/L),2 mL酶液,37 ℃反應(yīng)6 h,410 nm處檢測(cè)釋放的對(duì)硝基苯胺。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時(shí)生成1 μmol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位[20]。

乙酰胞壁酰胺酶活性測(cè)定：以對(duì)硝基乙酰苯胺為底物,3 mL的反應(yīng)體系中加入0.9 mL的PBS(0.1 mol/L,pH 7.0),0.1 mL 1 mmol/L底物溶液,2 mL酶液,37 ℃反應(yīng)6 h,410 nm處檢測(cè)釋放的對(duì)硝基苯胺。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時(shí)生成1 μmol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位[21]。

內(nèi)肽酶活性測(cè)定：以牛血紅蛋白為底物,3 mL反應(yīng)體系中加入0.4 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)和0.2 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制的1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的牛血紅蛋白,38 ℃保溫10 min后,加2.4 mL酶液,38 ℃下反應(yīng)1 h,然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸終止反應(yīng)(對(duì)照管在反應(yīng)前加三氯乙酸),4 ℃下靜止30 min后,離心(4 500 r/min,5 min,4 ℃),上清液用于茚三酮反應(yīng),測(cè)定單位蛋白質(zhì)生成的氨基酸。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時(shí)生成1 μmol氨基酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位[22]。

羧肽酶活性測(cè)定：以馬脲酰-L-苯丙氨酸為底物,3 mL反應(yīng)體系中加入0.4 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8),0.2 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的馬脲酰-L-苯丙氨酸,38 ℃保溫10 min后,加2.4 mL酶液,38 ℃下反應(yīng)1 h,然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸終止反應(yīng)(對(duì)照管在反應(yīng)前加三氯乙酸),4 ℃下靜止30 min后,離心(4 500 r/min,5 min,4 ℃),上清液用于茚三酮反應(yīng),測(cè)定單位蛋白質(zhì)生成的氨基酸量。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時(shí)生成1 μmol氨基酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.plantarum SL32-2的生長(zhǎng)曲線和自溶度曲線

L.plantarumSL32-2的生長(zhǎng)曲線和自溶度曲線如圖1所示?；罨蟮腖.plantarumSL32-2在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速,延滯期較短約為2 h,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～20 h,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,OD650 nm可達(dá)5.08,40 h后進(jìn)入衰亡期。圖1中自溶度曲線表明,L.plantarumSL32-2在培養(yǎng)4 h有1個(gè)自溶度高峰,自溶度高達(dá)46%,此時(shí)菌株正處在對(duì)數(shù)早期,之后自溶度迅速下降,在15%～20%波動(dòng),整體變化趨勢(shì)與乳酸菌LB-3自溶酶的變化趨勢(shì)一致[23]。說(shuō)明在對(duì)數(shù)早期,乳酸菌自溶酶活性較高,在細(xì)胞壁肽聚糖上形成大量縫隙以填充新的肽聚糖,使菌體快速生長(zhǎng)繁殖。在進(jìn)一步分析L.plantarumSL32-2自溶酶的特性時(shí),取對(duì)數(shù)早期4 h的發(fā)酵液提取自溶酶。

圖1 L.plantarum SL32-2的生長(zhǎng)曲線及自溶度曲線Fig.1 Growth curve and autolysis rate of L.plantarum SL32-2

2.2 反應(yīng)體系對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

為進(jìn)一步了解L.plantarumSL32-2自溶酶在胞外的活性,以該菌細(xì)胞作為底物,與自溶酶在不同反應(yīng)體系混合后測(cè)定自溶酶活性,自溶酶活性用OD600 nm下降百分率表示,結(jié)果見(jiàn)圖2。在不同的反應(yīng)體系中,反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí),OD600 nm下降百分率最大,表明在該時(shí)間段內(nèi)自溶酶的活性最高,之后OD600 nm下降百分率變化緩慢,因此,在后續(xù)試驗(yàn)中選取2 h作為反應(yīng)時(shí)間。同時(shí),隨著自溶酶比例升高,OD600 nm下降百分率增大,表明自溶酶的活性有所提高,當(dāng)反應(yīng)體系為V(底物乳酸菌)∶V(自溶酶)=1∶2時(shí),自溶酶活性最高,OD600 nm下降百分率可達(dá)23.33%。在后面的試驗(yàn)中選擇V(底物乳酸菌)∶V(自溶酶)=1∶2進(jìn)行。

圖2 反應(yīng)體系對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction systems on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2

2.3 溫度對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

乳酸菌自溶酶可能是多種組分體系,因?yàn)槌Ｒ曰旌闲问綉?yīng)用,仍需明確其自溶酶體系的酶學(xué)性質(zhì)。為了解L.plantarumSL32-2自溶酶體系的最適溫度,試驗(yàn)于27、32、37、42、47 ℃下檢測(cè)自溶酶活性,結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2注：不同字母表示差異性顯著,P<0.05(下同)

隨著溫度的升高,自溶酶的活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),之后自溶酶活性基本趨于穩(wěn)定,37 ℃時(shí),自溶酶的活性最高,OD600 nm下降百分率為16.28%;之后自溶酶活性開(kāi)始下降,42 ℃、47 ℃時(shí)OD600 nm下降百分率分別為14.47%和14.08%。從干酪中分離的LactobacilluscaseiBL23中提取的N-乙酰胞壁酸酶AclB最適溫度為37 ℃,與本試驗(yàn)結(jié)論一致[17]。

2.4 pH對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

為進(jìn)一步了解L.plantarumSL32-2自溶酶的最適pH,在pH值為 5.5、6.5、7.5及8.5的條件下檢測(cè)自溶酶活性,結(jié)果如圖4所示。隨著pH的升高,L.plantarumSL32-2自溶酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)pH為7.5時(shí),自溶酶的活性最高,OD600 nm下降百分率為26.7%;當(dāng)pH>7.5,自溶酶活性開(kāi)始降低,pH為8.5時(shí)OD600 nm下降百分率為21.48%。從意大利臘腸中分離的Lactobacillussakei中提取的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶最適pH為8.0,與本試驗(yàn)結(jié)果比較接近[24]。

圖4 pH對(duì)L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2

2.5 L.plantarum SL32-2自溶酶底物特異性分析

乳酸菌與金黃色葡萄球菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)類似,糖鏈均由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過(guò)β-1,4糖苷鍵交替連接而成;乳酸菌肽聚糖的四肽尾是-L-丙氨酸-2-γ-D-谷氨酸-3-X-4-D-丙氨酸,其中的X可能是L-賴氨酸(L-Lys)、內(nèi)消旋二氨基庚二酸(mDAP)或L-鳥氨酸(L-Orn),肽橋可以由1條四肽尾的第4位氨基酸與另1條四肽尾的第3位氨基酸交聯(lián)形成,也可以通過(guò)1個(gè)D-氨基酸或多個(gè)L-氨基酸連接形成[25],可見(jiàn),乳酸菌肽聚糖多樣性表現(xiàn)在肽橋和肽尾。肽聚糖復(fù)雜結(jié)構(gòu)使得細(xì)菌可編碼多個(gè)PGH。為了解L.plantarumSL32-2自溶酶的底物特異性,在有無(wú)外加自溶酶的條件下,比較自溶前后緩沖液中的還原糖和氨基酸含量變化,判斷是否有切斷糖鏈和肽鏈的酶類,并同時(shí)檢測(cè)自溶度。從圖5中可以看出,L.plantarumSL32-2自溶前還原糖為1.59 mg/mL,自溶后增加到2.38 mg/mL,增加了0.50倍,說(shuō)明L.plantarumSL32-2自溶酶可降解肽聚糖糖鏈部分;添加自溶酶后還原糖質(zhì)量濃度由自溶前的1.49 mg/mL,增加到自溶后的3.06 mg/mL,增加了1.05倍,L.plantarumSL32-2的自溶度在添加自溶酶后也由17.21%增加到29.25%(圖6),說(shuō)明自溶酶在胞外顯著促進(jìn)了乳酸菌的自溶。L.plantarumSL32-2自溶前氨基酸為0.041 mg/mL,自溶后增加到1.101 mg/mL,增加了25.83倍,說(shuō)明L.plantarumSL32-2自溶酶可降解肽聚糖的肽鏈部分;添加自溶酶后氨基酸由自溶前的0.040 mg/mL,增加到自溶后的1.753 mg/mL,增加了42.83倍,再次說(shuō)明自溶酶在胞外顯著促進(jìn)了乳酸菌的自溶。由上可知,無(wú)論是否外加自溶酶,自溶后氨基酸增加量都遠(yuǎn)大于還原糖,證明作用于肽尾和肽橋的自溶酶組分活性更高。

圖5 添加自溶酶對(duì)L.plantarum SL32-2自溶前后還原糖和氨基酸變化量的影響Fig.5 Effect of adding autolysin on the concentrations of reducing sugars and amino acids before and after autolysis of L.plantarum SL32-2

圖6 添加自溶酶對(duì)L.plantarum SL32-2自溶度的影響Fig.6 Effect of adding autolysin on the autolysin rate of L.plantarum SL32-2

由于乳酸菌自溶酶組分較多,所作用的底物各不相同,將L.plantarumSL32-2自溶酶分別作用于對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、對(duì)硝基乙酰苯胺、馬脲酰-L-苯丙氨酸和牛血紅蛋白4種底物,檢測(cè)β-N-乙酰-葡萄糖胺酶、乙酰胞壁酰胺酶、羧肽酶以及內(nèi)肽酶的活性,結(jié)果如圖7所示。β-N-乙酰-葡萄糖胺酶、乙酰胞壁酰胺酶、羧肽酶、內(nèi)肽酶的活性分別為0.003 6、0.002 7、1.126 7、2.098 7 U。表明作用于肽鏈的內(nèi)肽酶和羧肽酶活性遠(yuǎn)高于作用于糖鏈的β-N-乙酰-葡萄糖胺酶及連接糖鏈和肽的酰胺酶,由此可知,內(nèi)肽酶及羧肽酶是L.plantarumSL32-2最主要的PGH。

圖7 L.plantarum SL32-2自溶酶底物特異性分析Fig.7 Analysis of substrate specificity of autolysin from L.plantarum SL32-2

3 結(jié)論

細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中合成的自溶酶除了用于細(xì)胞生長(zhǎng)分裂和程序性死亡外,還可在饑餓誘導(dǎo)條件下篩選高自溶度菌株用于干酪生產(chǎn)[26],也可以提取自溶酶用于控制乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。本試驗(yàn)主要研究了酒醅來(lái)源L.plantarumSL32-2自溶酶特性及底物特異性,結(jié)果表明,L.plantarumSL32-2在對(duì)數(shù)期早期自溶度最高,其自溶酶最適pH為7.5,最適溫度為37 ℃;將自溶酶添加到該細(xì)菌細(xì)胞緩沖液中,自溶度增加了12.04%、緩沖液中還原糖增加了1.05倍、氨基酸增加了42.83倍;進(jìn)一步分析自溶酶的底物特異性發(fā)現(xiàn),L.plantarumSL32-2自溶酶中β-N-乙酰葡萄糖胺酶、酰胺酶、羧肽酶、內(nèi)肽酶的活性分別為0.003 6、0.002 7、1.126 7、2.098 7 U,說(shuō)明L.plantarumSL32-2作用于肽鏈的酶活性遠(yuǎn)高于作用于糖鏈的酶,并且其自溶酶在細(xì)胞內(nèi)外均能促進(jìn)乳酸菌裂解,因此有望通過(guò)添加自溶酶的方式,控制乳酸菌的過(guò)量生長(zhǎng)。