戚國(guó)偉于寧楊仕明韓東一*

1解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部；國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；（北京 100853）

2海軍軍醫(yī)大學(xué)研究生院（上海 200433）

3解放軍總醫(yī)院研究生院（北京 100853）

研究表明，長(zhǎng)期噪聲暴露會(huì)對(duì)呼吸、循環(huán)、消化等全身多器官和系統(tǒng)造成損傷，這其中最為直接的就是聽(tīng)力損失[1,2]。目前針對(duì)噪聲性聾（Noise in-duced hearing loss,NIHL）的發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)變化、臨床治療及預(yù)防都開(kāi)展了大量研究[3]。隨著對(duì)NIHL認(rèn)識(shí)的深入，相應(yīng)研究手段的革新需求也與日俱增。近年來(lái)，組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用突飛猛進(jìn)，在不斷突破既往瓶頸問(wèn)題的同時(shí)，取得了一系列革命性的發(fā)現(xiàn)[4]，因此也越來(lái)越受到聽(tīng)覺(jué)科學(xué)研究的青睞。本文將對(duì)近年代謝組學(xué)在聽(tīng)覺(jué)科學(xué)研究，尤其是NIHL方面的基礎(chǔ)與臨床研究應(yīng)用做以綜述。

1 代謝組學(xué)

1.1 代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)技術(shù)起始于20世紀(jì)70年代，F(xiàn)erenci等于1998年首次進(jìn)行了系統(tǒng)闡述與定義[5]。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，現(xiàn)在代謝組學(xué)已經(jīng)成為一種可以精確定量分析復(fù)雜生物系統(tǒng)內(nèi)多種代謝物水平及其變化的技術(shù)。在生物信息分析、多元統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)挖掘等技術(shù)的支持下，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于病理生理機(jī)制、疾病標(biāo)志物等領(lǐng)域研究[6]。代謝組學(xué)可以根據(jù)研究目標(biāo)的確定性分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)。非靶向代謝組學(xué)又稱(chēng)為發(fā)現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，是對(duì)樣本中所有代謝物進(jìn)行全面分析的一種方法，可用于初步篩選目標(biāo)代謝物。因?yàn)椴蛔鲱A(yù)先假設(shè)，所以會(huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，重復(fù)性及針對(duì)性較差[7]。靶向代謝組學(xué)又稱(chēng)為假設(shè)驅(qū)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，是以高精度的化學(xué)計(jì)量方法對(duì)樣本中特定代謝物進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)[6]。代謝組學(xué)研究的樣本種類(lèi)廣泛，從細(xì)胞、血液、組織液、糞便，到組織、器官，甚至是完整的活體標(biāo)本，都可以進(jìn)行代謝物分析。醫(yī)學(xué)研究中較為常用的樣本是血液、尿液及組織器官等[8]。代謝組學(xué)的研究對(duì)象主要是分子量在1000 kDa以?xún)?nèi)的小分子物質(zhì)[9]。

1.2 代謝組學(xué)分析技術(shù)

醫(yī)學(xué)研究樣本包含的代謝物種類(lèi)繁多，濃度、分子量、極性、親水性等特質(zhì)不盡相同，這對(duì)于代謝物的檢測(cè)、識(shí)別及定量分析都提出了極大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，還沒(méi)有一種技術(shù)可以精確檢測(cè)出樣本中的所有代謝物。因此，多種檢測(cè)技術(shù)結(jié)合互補(bǔ)成為廣泛應(yīng)用的策略。目前，代謝組學(xué)應(yīng)用最廣泛的分析技術(shù)是核磁共振技術(shù)（Nuclear magnetic resonance，NMR）和質(zhì)譜技術(shù)（Mass spectrometry，MS）[10,11]。

NMR技術(shù)是一種利用不同原子核吸收輻射產(chǎn)生不同共振頻率，將這些共振頻率轉(zhuǎn)化為分子化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)[12]。NMR光譜分析技術(shù)中，樣品制作簡(jiǎn)單并可重復(fù)使用，是一種快速、高效的非靶向分析方法，適合代謝物的定性和定量研究[11]。但由于靈敏度較低，制約了其在靶向代謝組學(xué)中的廣泛應(yīng)用。

MS分析是利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按質(zhì)荷比（m/z）分離并進(jìn)行檢測(cè)的方法。在實(shí)際操作中，未結(jié)合色譜的MS方法有直接輸注質(zhì)譜法（DIMS）和流動(dòng)注射質(zhì)譜法（FI-MS）兩種?；贛S的代謝組學(xué)通常聯(lián)合色譜進(jìn)行成份分析，目前MS聯(lián)用的色譜主要為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-MS，LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）兩類(lèi)。LC-MS對(duì)代謝物的覆蓋廣、靈敏度高，無(wú)需衍生處理，可檢測(cè)到1000種以上的代謝物，適用于不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性低、弱極性或中性的代謝物[13]。GC-MS具有高分離效率、高靈敏度的特點(diǎn)，在樣品分析之前需要進(jìn)行衍生化處理，適用于揮發(fā)性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好的非極性或極性代謝物[5]。

2 代謝組學(xué)在NIHL基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

當(dāng)前代謝組學(xué)在NIHL的基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較少，樣本大多為耳蝸淋巴液，部分研究的樣本為腦組織。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳蝸淋巴液容量有限，取材存在一定困難，易被組織液、血液污染等因素都一定程度的制約了代謝組學(xué)的應(yīng)用。目前，對(duì)于耳蝸淋巴液的代謝組學(xué)分析技術(shù)、流程尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同研究所得結(jié)果也存在一定差異。在代謝組學(xué)分析技術(shù)方面，應(yīng)用LC-MS的研究較多，也有部分研究采用GC-MS。以腦組織為標(biāo)本的研究中，GC-MS為主要的分析方法[14]。

Lingchao Ji等[15]利用CBA鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探究急性噪聲損傷后內(nèi)耳淋巴液的代謝物變化情況。通過(guò)LC-MS發(fā)現(xiàn)，在受到可導(dǎo)致隱性聽(tīng)力損失（hidden hearing loss,HHL）的 噪 聲（8-16KHz，100dB，2h）暴露后即刻，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸淋巴液內(nèi)核苷酸、輔酶因子、碳水化合物以及谷氨酸鹽等25種代謝物上調(diào)，主要涉及丙氨酸、天冬氨酸、嘌呤、谷氨酰胺以及谷氨酸鹽等的代謝。甲硫氨酸、精氨酸等15種代謝物下調(diào)，主要涉及苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的代謝（詳見(jiàn)表1）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同噪聲強(qiáng)度、暴露時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致內(nèi)耳淋巴液中代謝物的不同變化，為不同條件噪聲暴露與內(nèi)耳損傷之間的研究提供了全新的視角與思路。

Kristian Pirttil?等[16]針對(duì)脈沖噪聲暴露以及氫氣防護(hù)對(duì)內(nèi)耳淋巴液代謝物的影響進(jìn)行了深入研究。研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左耳接受156dB，400次的脈沖噪聲暴露，而后吸入濃度為2%的氫氣1小時(shí)。利用LC-MS技術(shù)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的雙側(cè)內(nèi)耳淋巴液進(jìn)行代謝組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，脈沖噪聲暴露組與氫氣治療組相比，有7種代謝物在雙側(cè)內(nèi)耳都產(chǎn)生了顯著變化。其中，水蘇堿、高水蘇堿等在噪聲暴露組的含量顯著下降，U539（[C8H18NO2]+）、U547（[C7H8NO2]+）在噪聲暴露組的含量上升。泛酸、肌酸、丁酰肉堿、乙酰肉堿等8種代謝物僅在兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右耳表現(xiàn)出顯著差異，噪聲暴露組明顯高于氫氣治療組（見(jiàn)表1）。?；舛緣A類(lèi)代謝物與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，氫氣治療組中該類(lèi)代謝物顯著下調(diào)說(shuō)明了氫氣對(duì)NIHL的治療作用與減輕毛細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少由活性氧（ROS）導(dǎo)致的細(xì)胞毒性相關(guān)。同時(shí)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞容量作用的滲透保護(hù)性代謝物水蘇堿、高水蘇堿濃度在氫氣治療組也顯著上調(diào)，提示氫氣對(duì)NIHL的治療作用存在其他潛在機(jī)制，值得深入研究。除此以外，該研究還從內(nèi)耳淋巴液代謝的角度證實(shí)，即使是單側(cè)耳受到噪聲暴露，雙側(cè)都會(huì)發(fā)生類(lèi)似的代謝變化。Kristian Pirttil?認(rèn)為這種變化的產(chǎn)生，與骨導(dǎo)聽(tīng)力的影響密不可分。雖然骨導(dǎo)聽(tīng)覺(jué)的產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，但內(nèi)耳淋巴液代謝物的變化也為該領(lǐng)域研究提供了全新的角度與方法。Takeshi Fujita等[17]利用GC-MS技術(shù)對(duì)內(nèi)耳淋巴液的成份分析進(jìn)行了探索性研究。在經(jīng)過(guò)4kHz，126dB，2小時(shí)的噪聲暴露后，分別于2小時(shí)、24小時(shí)取內(nèi)耳淋巴液。分析結(jié)果顯示，噪聲暴露后2小時(shí)，內(nèi)耳淋巴液中3-羥基丁酸、甘油、富馬酸、丙酮酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸+異檸檬酸、甘露糖等7種代謝物含量升高。噪聲暴露后24小時(shí)，內(nèi)耳淋巴液中3-羥基丁酸、富馬酸、磷酸鹽、赤蘚糖醇、檸檬酸+異檸檬酸等5種代謝物含量升高，甘油、半乳糖胺、甘露糖、肌糖等4種代謝物含量降低。在取內(nèi)耳淋巴液的同時(shí)，該研究還在相同時(shí)間點(diǎn)取血漿進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明，在內(nèi)耳淋巴液中顯著變化的10種代謝物并未在血漿中發(fā)生明顯變化，這可能與差異代謝物的膜通透性及血迷路屏障的作用有關(guān)。該結(jié)果提示，對(duì)于NIHL的代謝通路及分子機(jī)制等方向研究，血漿作為研究樣本的代表性較低，不適合作為單一樣本來(lái)源進(jìn)行分析。同時(shí)，在NIHL臨床標(biāo)志物研究方面，血漿樣本的代表性也值得深入探討。除了內(nèi)耳淋巴液，Jun He等[14]還利用小鼠的腦組織作為樣本，采用GC-MS進(jìn)行研究。在給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16KHz，110dB，1h的噪聲暴露后，取全部腦組織作為標(biāo)本，并根據(jù)大腦不同結(jié)構(gòu)、功能劃分為12個(gè)亞區(qū)。代謝組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿素、氨基酸、GABA、脂肪酸、核苷、有機(jī)酸等17種代謝物發(fā)生顯著變化，涉及嘌呤、谷胱甘肽、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸鹽、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸等的代謝。這些變化不僅限于聽(tīng)覺(jué)功能亞區(qū)，非聽(tīng)覺(jué)功能區(qū)也有出現(xiàn)。這表明，噪聲暴露對(duì)于中樞的影響，不僅局限于聽(tīng)覺(jué)功能區(qū)。當(dāng)前，噪聲所致的耳鳴是困擾聽(tīng)覺(jué)研究的難題。耳鳴的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，涉及中樞多個(gè)功能區(qū)域，既往研究手段往往只針對(duì)個(gè)別區(qū)域，無(wú)法整體分析所有功能區(qū)的變化。通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)，由各區(qū)域的差異代謝物推導(dǎo)整體代謝通路變化，進(jìn)而將各功能區(qū)結(jié)合，可能為耳鳴的中樞機(jī)制研究帶來(lái)全新發(fā)現(xiàn)！

表1 不同實(shí)驗(yàn)室代謝物變化研究對(duì)比表Table 1 Different results of metabolite changes

總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)前應(yīng)用代謝組學(xué)的NIHL基礎(chǔ)研究較少，實(shí)驗(yàn)流程、質(zhì)量控制、技術(shù)參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所得結(jié)果也略有區(qū)別，這與不同研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及技術(shù)自身的局限性有關(guān)。在所有發(fā)表的研究中，氨基酸類(lèi)、谷氨酸鹽類(lèi)以及有機(jī)糖類(lèi)代謝物都有所涉及，說(shuō)明NIHL的產(chǎn)生與以上物質(zhì)的代謝高度相關(guān)。

3 代謝組學(xué)在NIHL臨床研究中的應(yīng)用

同基礎(chǔ)研究類(lèi)似，當(dāng)前代謝組學(xué)在NIHL臨床研究中應(yīng)用也較為有限。受限于樣本來(lái)源，淋巴液只能從人工耳蝸手術(shù)患者[18]及部分迷路切除術(shù)患者獲取，且難以得到正常對(duì)照，很大程度限制了代謝組學(xué)的應(yīng)用。有學(xué)者采用血漿作為樣本，對(duì)NIHL的長(zhǎng)期效應(yīng)進(jìn)行探究[19]。在分析技術(shù)方面，絕大部分研究均采用LC-MS。

Sylvie Mavel等[18]就應(yīng)用 LC-HRMS（liquid chro-matography–high resolution mass spectrometry）分析人類(lèi)內(nèi)耳外淋巴液的可行性進(jìn)行了探究。研究選取23名因雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性耳聾而擬行人工耳蝸植入的患者，于術(shù)中打開(kāi)圓窗后使用特殊的毛細(xì)針管吸取外淋巴液。由于患者個(gè)體差異及術(shù)中操作等影響，單個(gè)樣本淋巴液容量為0.8μl-2 ml之間。為進(jìn)行對(duì)照，研究選取與內(nèi)耳淋巴液產(chǎn)生、循環(huán)高度相關(guān)的腦脊液作為參照。由于樣本容量遠(yuǎn)低于代謝組學(xué)其他常規(guī)樣本檢測(cè)量，研究對(duì)實(shí)驗(yàn)流程中樣本分離、提純、質(zhì)控等各個(gè)環(huán)節(jié)都進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果提示：從腦脊液和內(nèi)耳外淋巴液中可以分別穩(wěn)定檢測(cè)出94和74種代謝物，有38種代謝物被同時(shí)在兩種樣品中檢測(cè)出來(lái)。這說(shuō)明，通過(guò)優(yōu)化技術(shù)，可以解決樣本量有限等問(wèn)題，且所得結(jié)果穩(wěn)定可靠。此外，研究將人耳淋巴液代謝物與豚鼠淋巴液代謝物進(jìn)行了對(duì)比，僅有15種代謝物同時(shí)存在于兩物種的淋巴液中。其中，乳酸鹽在兩物種的淋巴液中均有很高的含量，谷氨酸鹽、纈氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、琥珀酸鹽、蘇氨酸、賴(lài)氨酸、甘氨酸、核糖、阿糖醇、伽馬氨基丁酸（GABA）、o-磷酸乙醇胺和葡萄糖醛酸酯均有不同強(qiáng)度信號(hào)，肌酸酐在豚鼠僅可檢測(cè)到微量信號(hào)。從代謝物角度所反饋出的表型信息說(shuō)明，人類(lèi)內(nèi)耳的代謝物及相關(guān)通路具有一定種屬特異性，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所得的成果要轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用還有大量難題亟待破解。Long Miao等[19]利用LC-MS技術(shù)，就長(zhǎng)期噪聲暴露對(duì)人體血漿代謝物的影響進(jìn)行了研究。研究選取62名在工廠中接觸噪聲一年以上、無(wú)耳聾家族遺傳史的工人，純音測(cè)聽(tīng)結(jié)果在3、4、6kHz處的閾值均高于25dB。對(duì)血漿樣本代謝物分析后發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，共有207種代謝物含量變化。其中，136種代謝物含量上調(diào)，71種代謝物下調(diào)，20種代謝物（脂質(zhì)分子、脂肪酸等）含量差異顯著。代謝通路結(jié)果表明，甘油磷脂、糖基磷脂酰肌醇（GPI）、膽堿、α-亞麻酸、亞油酸以及內(nèi)源性大麻素的代謝均與NIHL的產(chǎn)生及進(jìn)展相關(guān)。利用RT-qPCR技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)與自噬通路相關(guān)的3種mRNA含量顯著下調(diào)，這說(shuō)明自噬通路與NIHL的發(fā)生關(guān)系密切。同時(shí)，其他代謝通路及相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)也為NIHL血漿標(biāo)志物的研究提供了啟發(fā)與參考。該研究的設(shè)計(jì)思路以及代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用都為NIHL臨床研究開(kāi)辟了新方向。

現(xiàn)階段應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)的NIHL臨床研究數(shù)量有限，這其中最主要的制約因素是研究樣本的來(lái)源。內(nèi)耳淋巴液是人耳在噪聲等環(huán)境因素影響下代謝變化最為直接和全面的反應(yīng)載體，因此也是最理想的研究樣本。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已知，不同條件的噪聲暴露、噪聲暴露后不同時(shí)間段，內(nèi)耳代謝情況都不盡相同。如能掌握關(guān)鍵代謝物含量的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)代謝通路揭示其與聽(tīng)力損失之間的關(guān)系，并用藥物加以阻斷干預(yù)，就能有效預(yù)防、治療NIHL。盡管這些設(shè)計(jì)是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行探索，但能為臨床應(yīng)用提供相對(duì)直接的參照。除此以外，安全、穩(wěn)定且可靠的內(nèi)耳淋巴液獲取方式是所有臨床研究面臨的首要難題，這不僅關(guān)系到研究的開(kāi)展，也制約著研究成果的應(yīng)用。耳蝸血迷路屏障在保護(hù)內(nèi)耳環(huán)境相對(duì)獨(dú)立穩(wěn)定的同時(shí)，也限制了藥物進(jìn)入。如前述問(wèn)題能夠攻克，定會(huì)為內(nèi)耳疾病的治療帶來(lái)革命性的突破！

4 代謝組學(xué)在NIHL的研究應(yīng)用展望

代謝組學(xué)近年來(lái)發(fā)展迅猛，其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用已涉及病理機(jī)制、疾病標(biāo)志物、藥物治療、預(yù)后轉(zhuǎn)歸等多個(gè)領(lǐng)域[6]。隨著可分析代謝物種類(lèi)的持續(xù)增加，目標(biāo)代謝物分析臨界濃度的不斷降低，結(jié)合生物化學(xué)、生物信息分析、統(tǒng)計(jì)分析等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，以及基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等多組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用，必將為生物醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)不斷突破。當(dāng)前，代謝組學(xué)在NIHL研究中的應(yīng)用較為局限，制約因素主要為：（1）樣本來(lái)源受限；（2）樣本容量?。唬?）技術(shù)流程缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范；（4）缺少權(quán)威性的數(shù)據(jù)參照。

要拓展代謝組學(xué)的應(yīng)用范圍，不僅僅需要技術(shù)本身的革新，微創(chuàng)、可重復(fù)的內(nèi)耳淋巴液獲取方式是當(dāng)前最急需突破的難題。借助代謝組學(xué)，NIHL研究有望在以下四個(gè)方面取得突破性進(jìn)展：（1）不同噪聲所致?lián)p傷及恢復(fù)全過(guò)程代謝通路動(dòng)態(tài)變化；（2）NIHL精準(zhǔn)治療及預(yù)防策略；（3）骨導(dǎo)聽(tīng)覺(jué)產(chǎn)生機(jī)制；（4）噪聲易感性基因篩選及分子機(jī)制。