牧亞峰， 左新河， 向 楠， 趙 勇， 華 川2,， 陳繼東2,

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 武漢 430065；3.湖北省中醫(yī)院， 武漢 430074)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病，細胞和抗體介導(dǎo)的慢性免疫性炎癥是甲狀腺組織破壞的主要原因之一[1]。20%～30%患者最終會發(fā)展為甲狀腺功能減退癥[2]，有研究報道AIT還是甲狀腺癌的危險因素[3]。AIT的病因與發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但其發(fā)病是遺傳、環(huán)境、免疫等多因素共同作用的結(jié)果[4]。腸道是人體重要的器官，而腸黏膜屏障作為第一道防線在機體免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色。目前，已知自身免疫性肝炎、糖尿病、炎癥性腸病、慢性腎臟病等疾病存在腸黏膜屏障損傷，損傷的原因涉及細胞因子、腸道菌群、腸道免疫功能等多個方面[5]。然而有關(guān)AIT的腸道研究較少，僅有極少量文獻報道了腸道菌群與橋本甲狀腺炎的關(guān)系[6]，尚沒有藥物對AIT腸道菌群及腸黏膜屏障作用的研究。前期研究表明，芪箭消癭方能夠降低AIT動物模型甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibodies，TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibodies，TPOAb)水平，減輕甲狀腺組織淋巴細胞浸潤[7]。本研究采用AIT大鼠模型，以腸道為切入點，探討芪箭消癭方對AIT大鼠腸道菌群及腸黏膜屏障的影響，為臨床應(yīng)用提供新的思路與參考。本研究通過湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物倫理委員會批準(批號HUCMS201909008)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量(110±10)g，購于三峽大學(xué)，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2017-0012。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，室溫(23±2)℃，相對濕度(55±10)%，光照12 h/d，自由攝食和飲水。

1.2 藥物

芪箭消癭方組成：黃芪30 g，白芍15 g，鬼箭羽15 g，穿山龍15 g。黃芪(1.5 g/袋，相當于飲片10 g，批號19071401)，白芍(1 g/袋，相當于飲片10 g，批號19050921)，鬼箭羽(0.5 g/袋，相當于飲片10 g，批號18041891)，穿山龍(1.67 g/袋，相當于飲片10 g，批號19018041)，江陰天江藥業(yè)有限公司，購自湖北省中醫(yī)院中藥配方顆粒藥房。硒酵母片(西維爾，規(guī)格50 μg/片)，牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司，批號H10940161。

1.3 試劑與儀器

豬甲狀腺球蛋白(貨號180801)、完全弗氏佐劑(貨號F5881)、不完全弗氏佐劑(貨號F5506)、碘化鈉(貨號383112)(美國Sigma公司)；游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)試劑盒(貨號0079c)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)試劑盒(貨號0122c)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)試劑盒(貨號R0009c)、白細胞介素(interleukin，IL)-10試劑盒(貨號R0016c)及分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulin，sIg)A試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司，貨號R0875c)；甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibodies，TPOAb)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號E11199r)；甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibodies，TGAb)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號R0551)；閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)抗體(Abclonal,貨號A0659)、閉合蛋白(Occludin)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號13409-1-AP)；β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司，貨號BM0627)；DNA提取試劑盒(Omega，貨號D3450)；DNA聚合酶(TransGen，貨號AP231-01)；DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，貨號AP-GX-50)。

離心機(湘儀離心機儀器有限公司，型號H1650-W)；多功能酶標儀(美國MD公司，型號Flexstation3)；輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica公司，型號RM2016)；垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN、DYCZ-40)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，型號BX53)；透射電鏡(日本HITACHI公司，型號HT7700-SS)；分光光度計(美國賽默飛公司，型號NanoDrop2000)；PCR儀(美國ABI公司，型號QuantStudio 6)；測序儀(美國Illumina公司，型號Miseq PE300)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

48只雌性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組6組各8只。參照文獻報道的方法，采用豬甲狀腺球蛋白與弗氏佐劑皮下免疫注射聯(lián)合高碘水喂養(yǎng)制備AIT大鼠模型[8]。依據(jù)人與大鼠等效劑量折算系數(shù)確定給藥劑量，硒酵母組給藥劑量為36 μg/kg(臨床等效劑量)，芪箭消癭方低、中、高劑量組給藥劑量分別為1.8、3.6、7.2 g/kg(分別為臨床等效劑量的1、2、4倍)，對照組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。供試藥液的制備：按組方比例取黃芪、白芍、鬼箭羽、穿山龍配方顆粒，用100 ℃ 0.9%氯化鈉溶液充分溶解，分別制成質(zhì)量濃度為2.4、1.2、0.6 g/mL的溶液；取適量硒酵母片置于研缽中研磨至極細粉末，加入0.9%氯化鈉溶液充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為3.6 μg/mL的混懸液。以上藥液均分裝并保存于4 ℃冰箱中備用。

2.2 樣本收集與處理

實驗取材前1 d，每組隨機選取5只大鼠，采用應(yīng)激性排便法收集大鼠糞便樣品，肛周消毒后固定并將大鼠尾部提起，手指按壓下腹部促其排便，收集新鮮糞便2～3顆于滅菌凍存管中，-80 ℃保存；禁食12 h，10%水合氯醛麻醉后暴露胸腔,心臟采血收集于真空采血管，取上清分裝于EP管中，-80 ℃保存；暴露頸部剪下附有甲狀腺的氣管段，冰上分離出甲狀腺，置于4%多聚甲醛中固定；暴露腹腔剪下結(jié)腸，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗腸腔，擦干后剪取部分結(jié)腸置于4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中固定，另將剩余結(jié)腸置于凍存管中，-80 ℃保存。

2.3 HE染色觀察甲狀腺及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

將經(jīng)4%多聚甲醛固定好的甲狀腺及結(jié)腸組織取出，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)脫蠟、清洗后行HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。參照文獻制定的甲狀腺炎癥評分標準打分[9]。0分：無淋巴細胞浸潤；1分：2個或3個甲狀腺濾泡之間的間質(zhì)可見淋巴細胞浸潤；2分：1個或2個甲狀腺濾泡大小的浸潤灶；3分：廣泛浸潤面積達10%～39%；4分：廣泛浸潤面積達40%～80%；5分：廣泛浸潤面積達80%以上。

2.4 透射電鏡觀察結(jié)腸上皮超微結(jié)構(gòu)

取出2.5%戊二醛固定好的結(jié)腸組織，加入PBS緩沖液反復(fù)沖洗，1%鋨酸室溫固定2 h，梯度酒精脫水，將丙酮與環(huán)氧樹脂包埋劑按1∶1混合滲透過夜、包埋，70 nm超薄切片，鈾鉛雙染色。透射電鏡下觀察結(jié)腸組織緊密連接、上皮微絨毛等超微結(jié)構(gòu)。

2.5 ELISA檢測血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10及結(jié)腸sIgA的含量

血清自然解凍，按照試劑盒說明書測定血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10含量。取結(jié)腸組織稱重并剪碎，將其與PBS緩沖液(按1∶9的重量體積比)加入組織研磨器中，充分冰浴研磨得勻漿液，取上清液，同法檢測結(jié)腸sIgA含量。

2.6 Western blot檢測結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白

向剪碎的結(jié)腸組織中加入磷酸酶抑制劑裂解，勻漿后取上清，BCA測定蛋白濃度。蛋白上樣后經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳并分離轉(zhuǎn)膜，TBST封閉2 h后加入稀釋的一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗(1∶50000)，37 ℃孵育2 h，ECL顯影曝光，掃描膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

2.7 糞便菌群DNA提取及測序

按照DNA提取試劑盒說明書對各組大鼠糞便樣品進行DNA抽提。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。使用擴增引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3’)對16 S rRNA V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存。擴增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠回收，利用DNA凝膠試劑盒對回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫，利用MiSeq PE300平臺進行高通量測序。最后，基于生物信息云平臺對OTUs進行不同水平(門、屬)物種注釋。根據(jù)聚類結(jié)果，對糞便菌群進行物種多樣性(α多樣性、β多樣性)及物種分類學(xué)組成分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 甲狀腺組織HE染色結(jié)果

圖1示，炎癥評分結(jié)果顯示，對照組為0分，模型組評分較其明顯增高(P<0.01)，與模型組比較，各藥物組評分顯著降低(P<0.01)。甲狀腺HE染色結(jié)果顯示，對照組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，呈類圓形或多邊形，濾泡上皮細胞呈單層立方形，排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡間隙未見淋巴細胞浸潤；模型組濾泡上皮細胞呈扁平狀，大部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞萎縮，可見彌漫性淋巴細胞浸潤；硒酵母組濾泡上皮細胞排列尚整齊，濾泡腔萎縮，膠質(zhì)含量減少，可見吸收空泡；芪箭消癭方各劑量組濾泡結(jié)構(gòu)完整性改善，淋巴細胞浸潤明顯減少，病變程度減輕。

3.2 結(jié)腸組織HE染色及超微病理變化

圖2示，結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示，對照組結(jié)腸黏膜完整，上皮細胞排列整齊，黏膜隱窩平行排列，杯狀細胞豐富，無淋巴細胞浸潤；與對照組比較，模型組結(jié)腸黏膜上皮部分斷裂且不完整，黏膜隱窩形態(tài)扭曲，伴有淋巴細胞浸潤；與模型組比較，芪箭消癭方低劑量組、芪箭消癭方中劑量組、芪箭消癭方高劑量組及硒酵母組結(jié)腸黏膜完整性有所恢復(fù)，淋巴細胞浸潤明顯減少。

注:C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組;與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01;箭頭指淋巴細胞聚集圖1 各組大鼠甲狀腺組織HE染色及炎癥評分結(jié)果比較(×100)

注:C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較(×100)

圖3示，結(jié)腸黏膜超微病理顯示，對照組可見細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整，連接致密、連續(xù)，橋粒密度較高，上皮細胞表面微絨毛正常。與對照組比較，模型組細胞間緊密連接出現(xiàn)部分斷裂，連接開放、疏松，橋粒密度下降，微絨毛數(shù)量減少且排列較紊亂。經(jīng)芪箭消癭方低、中、高劑量及硒酵母干預(yù)后，細胞間緊密連接連續(xù)性均有不同程度恢復(fù)，連接更加緊密，腸上皮微絨毛數(shù)量增加，排列較模型組整齊。

注:C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組(“*”所指為橋粒,“→”指緊密連接斷裂處)圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜超微病理結(jié)果比較(鈾鉛雙染色×12000)

3.3 血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10結(jié)果

表1示，與對照組比較，模型組FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ水平顯著升高(P<0.01)，IL-10水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ水平明顯下降(P<0.05,P<0.01)，IL-10水平明顯上升(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清ELISA檢測結(jié)果

3.4 結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白及sIgA表達結(jié)果

圖4A、4B、4C示，與對照組比較，模型組ZO-1、Occludin蛋白表達明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組ZO-1、Occludin蛋白表達顯著升高(P<0.01)。圖4D示，與對照組比較，模型組sIgA水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組sIgA水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。

注:C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組；閉鎖連接蛋白(zonula occludens，ZO)-1,閉合蛋白(Occludin)，分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulin，sIg)A；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖4 各組大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白及sIgA表達比較

3.5 腸道菌群的變化

3.5.1 物種多樣性分析 本研究共得到2020932條有效序列。表2示，各組Shannon、Simpson、chao、ace指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖5A示，當OTUs水平逐漸增加時曲線趨于直線，大部分樣本所含OTUs在400～600之間，表明腸道微生物豐富度較高且分布較均勻。圖5B示，當Shannon指數(shù)達到3.7時，各樣本稀釋曲線趨向平坦，表明測序數(shù)據(jù)足夠大，能夠反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。圖5C韋恩圖顯示，6組共有728個重疊的OTUs，對照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組分別獨有18、13、16、10、7、8個OTUs。圖5 D PCoA圖示，對照組和模型組在PC1水平上呈明顯分開，表明AIT大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較對照組有改變且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而給藥后硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組在PC1水平上偏離模型組的距離逐漸增大，說明給藥后大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

表2 各組大鼠α多樣性指數(shù)結(jié)果比較

3.5.2 門水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 在門水平(Phylum)上，各組大鼠腸道菌群包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)等主要門類。對照組大鼠腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為優(yōu)勢菌門。與對照組比較，模型組厚壁菌門比例明顯升高(P<0.01)，擬桿菌門下降(P<0.01)，厚壁菌門與擬桿菌門比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)上升(P<0.01)。與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組厚壁菌門比例顯著下降(P<0.05)，擬桿菌門比例上升(P<0.05)，F(xiàn)/B值降低(P<0.01)(見表3圖6A)。

注：A.Rank-Abundance曲線；B.稀釋曲線；C.韋恩圖；D.PCoA圖；C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組。圖5 OTUs曲線及β多樣性分析比較

3.5.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 在屬水平(Genus)上，各組大鼠腸道菌群主要包括Muribaculaceae、瘤胃球菌屬Ruminococcaceae、毛螺菌屬Lachnospiraceae、乳酸桿菌屬Lactobacillus、擬桿菌屬Bacteroides、克里斯滕森菌屬Christensenellaceae、普雷沃氏菌屬Prevotellaceae、羅姆布茨菌Romboutsia等，其中乳酸桿菌屬與普雷沃氏菌屬組間變化顯著。與對照組比較，模型組乳酸桿菌屬和普雷沃氏菌屬豐度明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中劑量組乳酸桿菌屬豐度呈不同程度回升(P<0.05)，高劑量組乳酸桿菌屬豐度呈下降趨勢(P>0.05)；而在普雷沃氏菌豐度水平方面，與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組呈下降趨勢(P>0.05)，芪箭消癭方低劑量組成上升趨勢(P>0.05)(見表3圖6B)。

表3 各組大鼠門水平與屬水平腸道菌群變化比較

4 討論

AIT是典型的進行性自身免疫性疾病，近年來發(fā)病率日趨升高。由于發(fā)病機制不明，臨床表現(xiàn)不典型，部分患者在未診斷時可能已發(fā)展為甲狀腺功能減退癥。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段多為激素、硒制劑或隨訪觀察，尚不能完全根治。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)甲狀腺抗體水平的同時，還能降低西藥毒副作用以及兼顧乏力、便秘等臨床癥狀，具有顯著的療效優(yōu)勢。AIT屬于中醫(yī)學(xué)“癭病”范疇，多由正氣不足、痰濁瘀血結(jié)于頸前所致。臨床辨證以此證為主者，當以益氣扶正、化痰活血法治療。芪箭消癭方正是以“扶正祛邪”為大法，重用甘溫之黃芪以益氣扶正，白芍柔肝斂陰，佐以鬼箭羽活血通絡(luò)，穿山龍活血之余兼能化痰，全方共達益氣養(yǎng)陰、化痰活血之功。本研究大鼠造模后甲狀腺抗體水平升高，甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞且炎癥評分增高，表明成功誘導(dǎo)出AIT動物模型。硒酵母廣泛應(yīng)用于AIT的臨床治療，加之其良好的藥物安全性及有效性，故將硒酵母作為本實驗的陽性對照藥。

注:C.對照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組圖6 門水平(A)與屬水平(B)腸道菌群變化比較

腸道菌群與人類共存，研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病、炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病與腸道菌群存在關(guān)聯(lián)[10]。厚壁菌及擬桿菌是哺乳動物的優(yōu)勢菌群[11]，而F/B與某些病理狀態(tài)相關(guān)，是腸道菌群健康的重要指標[12]。本研究顯示，AIT大鼠腸道厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度變化，F(xiàn)/B上升，表明AIT大鼠腸道菌門物種比例失調(diào)，菌群呈紊亂態(tài)勢。該研究結(jié)果與Ishaq[13]所報道的一致。經(jīng)芪箭消癭方干預(yù)后，F(xiàn)/B下調(diào)，菌門物種比例失調(diào)得以糾正。同時發(fā)現(xiàn)，AIT大鼠腸道乳酸桿菌及普雷沃氏菌相對豐度下降，這與AIT患者腸道菌群分析的結(jié)果相同[14]。乳酸桿菌是益生菌的重要來源，能夠通過分泌乳酸、過氧化氫、細菌素等物質(zhì)降低腸道pH，具有殺菌或抑制病原菌黏附感染的作用[15]。研究表明，乳酸桿菌參與調(diào)節(jié)sIgA的分泌[16]。普雷沃氏菌具有定殖性和低致病性，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病中明顯減少[17]，能夠利用富含纖維的碳水化合物生產(chǎn)短鏈脂肪酸，發(fā)揮抗炎作用[18]。低、中劑量芪箭消癭方給藥后，乳酸桿菌相對豐度上升，而高劑量組反應(yīng)不敏感。低劑量組普雷沃氏菌相對豐度有回升趨勢，而中、高劑量組則呈下降趨勢，這可能與方劑中藥物成分濃度增加、抑菌作用藥物成分占主導(dǎo)地位有關(guān)。腸道菌群具有多種功能，可影響其生長和定殖能力，同時能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生下游效應(yīng)，這種效應(yīng)可能有益亦可能有害[19]。某些腸道菌群能夠生產(chǎn)機體所沒有的特定酶，將碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵成短鏈脂肪酸[20，21]。短鏈脂肪酸具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，同時還能夠維持腸上皮完整性、生產(chǎn)維生素、免疫系統(tǒng)信號分子與細胞交互以及激活和抑制特異性反應(yīng)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可有效維持腸道上皮的再生和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進而修復(fù)病理損傷后的腸黏膜[23]。然而部分腸道菌群可突破腸黏膜屏障與免疫系統(tǒng)接觸，進而引起炎癥[24]。

腸黏膜屏障是抵抗有害病原體的第一道防線[25]，緊密連接是維持腸黏膜機械屏障功能完整的重要結(jié)構(gòu)[26]。緊密連接蛋白主要包括以O(shè)ccludin為代表的跨膜蛋白和以ZO-1為代表的胞漿蛋白，前者胞間兩兩相連形成吻合結(jié)構(gòu)而封閉細胞間隙，后者與前者相互連接，使緊密連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而更加穩(wěn)定[27]。sIgA是腸黏膜免疫屏障的重要組成部分，與體液及細胞免疫共同發(fā)揮局部免疫功能[28]，具有增強腸道免疫、阻止條件致病菌增殖及病原菌入侵、恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡的作用[29]。IL-10在炎癥過程中可引起多種宿主防御機制，尤其是上皮細胞的防御機制，其本身具有抑制炎癥反應(yīng)并限制炎癥所導(dǎo)致的組織破壞作用[30]。本研究結(jié)果顯示，AIT大鼠結(jié)腸sIgA、ZO-1蛋白、Occludin蛋白表達明顯下降，結(jié)腸黏膜上皮部分損傷伴緊密連接完整性受損，腸黏膜屏障功能失常并伴有損傷。經(jīng)芪箭消癭方干預(yù)后，sIgA、ZO-1蛋白、Occludin蛋白表達上調(diào)，結(jié)腸黏膜病理形態(tài)及緊密連接結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)，說明腸黏膜屏障功能損傷得到修復(fù)。同時，腸道菌群的組成受到黏膜免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，細胞間緊密連接功能強弱又可通過影響腸黏膜通透性決定菌群抗原是否暴露，腸道菌群、緊密連接、腸黏膜免疫屏障之間的相互協(xié)調(diào)作用有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)[31]。

綜上所述，芪箭消癭方能夠降低AIT大鼠甲狀腺功能、甲狀腺抗體及炎癥因子水平，改善甲狀腺組織炎癥浸潤及炎癥評分，減輕結(jié)腸黏膜病理損傷，其作用機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群生物多樣性及物種組成有關(guān)，進而增加結(jié)腸緊密連接蛋白及sIgA表達，改善腸黏膜屏障損傷而起到治療作用。