談欣怡， 譚奚揚(yáng)， 曹左媛， 陳曉云

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院， 上海 200032)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫應(yīng)答異常，多種自身抗體產(chǎn)生累及多器官多系統(tǒng)的免疫疾病，女性的發(fā)病率為男性的10倍[1]。肺臟是SLE常易侵犯的器官，其中間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)發(fā)病率高達(dá)50%，是SLE的主要并發(fā)癥之一[1]。目前SLE-ILD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的治療藥物。有研究表明，酪氨酸激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcriptions，JAK2/STATs)信號(hào)通路可以刺激輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17，Th17)分化，誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)肺纖維化[1]。因此，糾正Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)平衡可能具有改善SLE-ILD的作用。中醫(yī)藥治療ILD具有一定的優(yōu)勢(shì)，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2，3]。上海市名中醫(yī)陳湘君教授根據(jù)SLE肝腎虧虛、熱毒內(nèi)蘊(yùn)的基本病機(jī)研發(fā)出經(jīng)驗(yàn)方“自身清”，治療SLE及其并發(fā)癥效果顯著[4-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該方具有控制炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等作用[7-9]，臨床發(fā)現(xiàn)其對(duì)抑制SLE-ILD有良好效果。本研究通過觀察“自身清”對(duì)SLE-ILD模型小鼠肺組織病理學(xué)、Th17/Treg平衡及白細(xì)胞介素17A(interleukin-17A，IL-17A)、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)水平影響，探討其對(duì)SLE-ILD抗炎及抗纖維化作用機(jī)制，為今后治療SLE-ILD提供依據(jù)。本研究通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)LHERAW-19011)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)11周齡雌性MRL/lpr小鼠40只和MRL/MpJ小鼠8只，體質(zhì)量20～23 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(23±3) ℃，相對(duì)濕度35%～45%，光照12 h晝夜循環(huán)，自由攝食飲水。

1.2 藥物

“自身清”組成：黃芪15 g，白術(shù)6 g，白芍15 g，地黃15 g，山茱萸9 g，白花蛇舌草15 g，牡丹皮15 g，丹參15 g，青蒿15 g，赤芍15 g，制何首烏12 g，甘草5 g，重樓15 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院新藥顆粒劑藥房提供并制備。枸櫞酸托法替布片(批號(hào)CG3062)尚杰，規(guī)格5 mg/片，由輝瑞公司提供。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BeyoECL Star(特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)分別為C0105 S、P0010 S、P0013B、P1046、P0012 AC、P0018 AS)；改良馬松(Masson)三色染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)G1346)；JAK2抗體、磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2，P-JAK2)抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3，P-STAT3)抗體、STAT5抗體、磷酸化STAT5(phosphorylated-STAT5，P-STAT5)抗體，均購(gòu)自CST公司(貨號(hào)分別為3230、4406、30835、9145、94205、9359)；叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3 (fork-head box p3,Foxp3)抗體、維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoid-associated orphan receptor γt，RORγt)抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)分別為ab215206、ab207082)；小鼠IL-17A高敏ELISA試劑盒、人/小鼠/大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司(貨號(hào)分別為70-EK217HS-96、70-EK981-96)。

1.4 儀器設(shè)備

多樣品組織研磨機(jī)(上海凈信科技有限公司，型號(hào)Tissuelyser-24)；PowerPac 基礎(chǔ)電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號(hào)分別為164-5050、165-8001、170-3930)；凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)CHEMISCOPE 6300)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5242R)；全自動(dòng)組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、組織攤片機(jī)(德國(guó)Leica公司,型號(hào)分別為TP1020、EG1150、RM2235、H11210)；正置顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)ECLIPSE Ci)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司，型號(hào)Synergy H1MF)。

2 方法

2.1 分組與干預(yù)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取2只MRL/lpr小鼠肺組織行HE和Masson染色，驗(yàn)證模型建立。將40只MRL/lpr小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、托法替布組每組8只，另將8只MRL/MpJ小鼠作為野生型對(duì)照組。中藥根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積折算[10，11]，即單位體質(zhì)量小鼠日給藥劑量為單位體質(zhì)量成人日處方量的9.1倍作為中劑量組小鼠日灌胃劑量，高劑量組為中劑量組2倍，低劑量組為中劑量組0.5倍。以蒸餾水溶解，最終制備成濃度為0.962 g/(kg·d)、1.925 g/(kg·d)、3.849 g/(kg·d)濃縮液，即低、中、高劑量組給藥濃度。以蒸餾水溶解托法替布，配制成終濃度為10 mg/(kg·d)的混懸液。模型組和野生型對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組小鼠每日灌胃1次，每次灌胃體積為0.2 mL/20 g，連續(xù)灌胃4周。

2.2 樣本采集

以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后打開小鼠胸腔，用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌注。完成灌注后，取小鼠左肺葉置于4%多聚甲醛中固定，常溫固定48 h，備石蠟切片用。取小鼠右肺上葉、中葉分別放入事先分組標(biāo)記好的凍存管中，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病理學(xué)染色

取小鼠固定后的左肺葉行石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm，每組各取4只小鼠分別進(jìn)行HE和Masson染色，中性樹膠封片，晾干后置于顯微鏡下觀察拍照。

2.4 蛋白免疫印跡

每組各取4只小鼠-80 ℃冰箱中保存右肺上葉組織，20 mg加入100 μL裂解液，并按照說(shuō)明書加入一定量的PMSF和蛋白酶磷酸酶抑制劑，勻漿后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取待檢測(cè)蛋白樣品上樣量30 μg電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜。將膜放入孵育盒中分別加入兔源一抗P-STAT3(1∶2000)、STAT3(1∶1000)、P-JAK2(1∶1000)、JAK2(1∶1000)、P-STAT5(1∶1000)、STAT5(1∶1000)、Foxp3(1∶1000)、RORγt(1∶1200)和β-actin(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。洗膜后加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，用凝膠成像系統(tǒng)顯影分析。

2.5 ELISA檢測(cè)

每組各取4只小鼠右肺中葉組織50 mg，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肺組織中IL-17A和TGF-β1含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 “自身清”對(duì)MLR/lpr小鼠肺臟組織病理學(xué)影響

圖1示，HE和Masson染色顯示，野生型對(duì)照組MRL/MpJ小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積。模型組和“自身清”低劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡間隔明顯增寬，伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維沉積，部分可見肺實(shí)變?！白陨砬濉敝?、高劑量組和托法替布組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡結(jié)構(gòu)較紊亂，少量肺泡壁斷裂，肺泡間隔部分增寬，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積較模型組和“自身清”低劑量組減少。

圖1 各組小鼠肺組織HE和MASSON染色病理結(jié)果比較(×200)

3.2 “自身清”對(duì)各組小鼠肺組織JAK2/STATs信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

表1圖2示，與野生型對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3、p-STAT5蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)，p-JAK2、RORγt、Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，“自身清”低、中、高劑量組小鼠肺組織中p-STAT3、p-JAK2、RORγt蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)，p-STAT5、Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)；托法替布組小鼠肺組織p-STAT3、p-JAK2、RORγt蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與托法替布組比較，“自身清”低劑量組小鼠肺組織中p-STAT5、Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表1 各組小鼠肺組織p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5、RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)結(jié)果

3.3 “自身清”對(duì)各組小鼠肺組織細(xì)胞因子IL-17A和TGF-β1含量的影響

表2示，與野生型對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中IL-17A含量顯著升高(P<0.05)，TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，“自身清”低、中、高劑量組和托法替布組小鼠肺組織中IL-17A含量顯著降低(P<0.05)，TGF-β1含量顯著升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠肺組織細(xì)胞因子IL-17A和TGF-β1水平比較

4 討論

SLE-ILD是繼發(fā)于SLE的一種以肺部慢性炎癥及肺纖維化為主要病理改變的疾病。根據(jù)臨床表現(xiàn)，其屬于中醫(yī)學(xué)“肺痹”“肺痿”等范疇。SLE日久，素體虧虛，濕熱與熱毒久伏于內(nèi)侵襲肌表，流注筋骨關(guān)節(jié)發(fā)為五體痹。五體痹者易受外邪侵襲，若風(fēng)寒濕等邪氣雜至，外邪引動(dòng)伏邪則致病情進(jìn)展，五體之痹內(nèi)舍于肺發(fā)為肺痹。肺痹日久，耗傷肺陰致使“肺熱葉焦”，肺葉萎弱不用發(fā)為“肺痿”[12]，其病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，肺腎虧虛為本，肺絡(luò)痹阻、痰瘀互結(jié)為標(biāo)。前期研究已發(fā)現(xiàn)，“自身清”中方藥組成通過益氣、活血、化瘀等作用可以有效治療風(fēng)濕性肺間質(zhì)病變[13]。

注：A.野生型對(duì)照組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組；F.托法替布組；磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3，p-STAT3)，磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2，p-JAK2)，磷酸化STAT5(phosphorylated-STAT5，p-STAT5)，叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因3(fork-head box p3,Foxp3)，維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoid-associated orphan receptor γt，RORγt)圖2 各組小鼠肺組織p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5、RORγt、Foxp3免疫印跡條帶

自身免疫性疾病MRL/MpJ小鼠及其Faslpr基因敲除MRL/lpr小鼠組織病理學(xué)及血清學(xué)表現(xiàn)與人SLE發(fā)病相似，常用于SLE及其相關(guān)疾病研究。與MRL/MpJ小鼠比較，MRL/lpr小鼠因Faslpr基因突變，抑制T淋巴細(xì)胞凋亡，加速小鼠免疫損傷形成和進(jìn)展[14，15]。且已有研究發(fā)現(xiàn)，MRL/lpr小鼠在8周齡時(shí)肺泡壁出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，14周齡發(fā)生嚴(yán)重肺纖維化[16]，其ILD的發(fā)生相較于其他肺纖維化小鼠模型更符合SLE-ILD發(fā)病機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)選用MRL/lpr小鼠作為模型鼠，MRL/MpJ作為野生型對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12周齡MRL/MpJ小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁連續(xù)未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；MRL/lpr小鼠肺組織已出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增寬，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分膠原纖維沉積等病理表現(xiàn)，基本符合SLE-ILD病理表現(xiàn)，說(shuō)明模型成功。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)“自身清”治療后小鼠肺組織肺泡炎癥及肺纖維化明顯減輕，并具有劑量依賴性，提示“自身清”可以減少SLE-ILD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)肺組織修復(fù)，延緩肺纖維化進(jìn)程，說(shuō)明“自身清”對(duì)SLE-ILD具有一定的治療作用。

SLE-ILD的發(fā)生與自身免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)[17]，其中JAK2/STATs信號(hào)通路介導(dǎo)Th17/Treg失衡是其發(fā)病機(jī)制之一。生理狀態(tài)下，Th17/Treg處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。當(dāng)肺組織損傷時(shí)，炎癥因子IL-6聯(lián)合TGF-β激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，促使CD4+T細(xì)胞向CD4+Th17細(xì)胞分化，增加IL-17分泌，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡、纖維細(xì)胞活化和增生、膠原蛋白沉積，加速肺纖維化進(jìn)展[18，19]。Chen[20]等研究發(fā)現(xiàn)，在病原體攻擊肺組織時(shí)，Th17細(xì)胞可以分泌大量IL-17A，加重肺組織損傷，導(dǎo)致肺纖維化形成。獨(dú)立存在的TGF-β可以誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化[21]。IL-2亦可聯(lián)合TGF-β激活STAT5,誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的分化[22]。當(dāng)機(jī)體Treg細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，可以抑制Th17的分化及炎癥反應(yīng)，延緩ILD進(jìn)程[23]。由此可見，單一抑制Th17細(xì)胞分化或促進(jìn)Treg細(xì)胞分化并不是控制CTD-ILD的最佳途徑，糾正Th17/Treg失衡狀態(tài)才是治療CTD-ILD的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)“自身清”治療后小鼠肺組織中p-JAK2、p-STAT3、RORγt蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低，p-STAT5、Foxp3蛋白表達(dá)明顯升高，低劑量組尤甚，且IL-17A水平明顯低于模型組，TGF-β1水平明顯高于模型組，表明“自身清”對(duì)SLE-ILD小鼠肺組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路具有抑制作用，減輕肺部炎癥及纖維化；此外“自身清”可以活化STAT5/Foxp3相關(guān)信號(hào)通路，糾正Th17/Treg失衡，延緩肺纖維化進(jìn)展。由此可見，不同濃度的“自身清”可以選擇性調(diào)控JAK2/STATs信號(hào)通路，雙向調(diào)節(jié)Th17/Treg分化，溫和抑制SLE-ILD進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)托法替布治療后小鼠肺組織中各蛋白均出現(xiàn)明顯降低，IL-17A分泌較模型組減少，說(shuō)明托法替布可以完全抑制SLE-ILD小鼠肺組織中JAK2/STATs信號(hào)通路，控制SLE-ILD發(fā)展，提示托法替布作為JAK抑制劑可以非選擇性地抑制JAK2/STATs信號(hào)通路，在疾病的急性期可以快速阻斷炎癥進(jìn)展，然而長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[24]?？梢?，兩類藥物對(duì)JAK2/STATs信號(hào)通路的影響不同，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，急性期二者聯(lián)合使用可以有效控制疾病進(jìn)程，緩解期小劑量維持使用 “自身清”對(duì)控制疾病復(fù)發(fā)更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，“自身清”通過選擇性調(diào)控JAK2/STATs信號(hào)通路，一方面抑制JAK2/STAT3活化，抑制Th17分化及IL-17A分泌，減輕肺部炎癥及纖維化；另一方面小劑量使用“自身清”，可以活化STAT5/Foxp3相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，糾正Th17/Treg失衡，恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)，且由此導(dǎo)致TGF-β1分泌適量增加，不影響SLE-ILD病情緩解。本研究只是初步探討“自身清”對(duì)SLE-ILD的治療作用及JAK2/STATs信號(hào)通路的調(diào)控作用，關(guān)于JAK/STATs信號(hào)通路完整的調(diào)控機(jī)制，如對(duì)JAK1、JAK3等作用尚須進(jìn)一步研究。