宋 哲，敬 瓊，楊貴生，周 燕，張 斌，湯 承，岳 華

（1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川省阿壩藏族羌族自治州疾病預(yù)防控制中心，四川 馬爾康 624000）

腹瀉是我國(guó)兒童最常見(jiàn)的一種疾病，是影響兒童健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題.病毒是引起兒童腹瀉的主要的原因[1-2]，其中輪狀病毒(Rotavirouses，RV)、諾如病毒(Norovirus，NoV)、札幌病毒(Sapovirus，SV)、腸道腺病毒(Enteric Adenoviruses，EAd)、星狀病毒(Astroviruses，AstV)等最為常見(jiàn)[3].不同地區(qū)導(dǎo)致兒童腹瀉的病毒種類(lèi)和流行情況存在一定的差異[3-5]，而我國(guó)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)相比發(fā)達(dá)地區(qū)的兒童腹瀉患病率要更高[6-7].有研究資料顯示西藏、四川、寧夏等地少數(shù)民族聚居區(qū)兒童腹瀉遠(yuǎn)高于全國(guó)平均水平，可能與地區(qū)經(jīng)濟(jì)、生活習(xí)慣和衛(wèi)生資源分布存在的差異性等有關(guān)[8-9].紅原縣位于四川省阿壩藏族羌族自治州，地處青藏高原東南沿，是典型的高原牧區(qū)，兒童腹瀉是當(dāng)?shù)氐某０l(fā)病和多發(fā)病，但兒童腹瀉相關(guān)的病原學(xué)和流行病學(xué)資料嚴(yán)重匱乏，制約了當(dāng)?shù)貎和篂a病的診斷和防控.

病毒宏基因組技術(shù)具有能夠直接從樣本中無(wú)偏差鑒定病毒種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)新病毒，了解病毒的遺傳多樣性和較為容易的獲得病毒基因組等優(yōu)勢(shì)[10].2011 年單同領(lǐng)等采用此技術(shù)，分析了上海腹瀉兒童糞便中病毒的群落，為兒童腹瀉病毒的診斷提供了參考[11]；2012 年P(guān)han 等從西非的兒童腹瀉糞便中鑒定到多種致腹瀉病毒，并發(fā)現(xiàn)了一種新的 bufavirus 病毒[12]；2017 年趙小英等在我國(guó)江蘇的兒童腹瀉糞便中鑒定出多種致腹瀉病毒，并獲得了一株新型人雙埃可病毒基因組，在此基礎(chǔ)上對(duì)該新型病毒的分子流行病學(xué)進(jìn)行深入研究[13]；這些研究體現(xiàn)出了病毒宏基因組技術(shù)在兒童腹瀉病毒鑒定的優(yōu)勢(shì).本研究目的是調(diào)查紅原縣兒童腹瀉糞便中的病毒種類(lèi)及其分子特征，為當(dāng)?shù)貎和篂a的診斷和防控提供參考，豐富青藏高原兒童腹瀉病毒的遺傳進(jìn)化資料.

1 材料和方法

1.1 樣品采集

12 份糞便樣本來(lái)自2019 年5 ～11 月紅原縣 4 月齡～11 歲急性胃腸炎患者.

1.2 試劑

QIAamp Viral RNA Mini kit 購(gòu)自德國(guó) QIAGEN 公司；Maxima H Minus Doubles-Stranded cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自中國(guó)Thermo 公司；PMD19-T 載體購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DNase 酶、RNase 酶、DNA Marker、DNA 純化試劑盒和Plasmid Miniprep Kit 均購(gòu)自美國(guó)AXYGEN 公司.

1.3 核酸的提取、cDNA 的合成及測(cè)序

樣本于冰上解凍，渦旋20 s 混勻，5 000 r/min 離心5 min，上清液用0.22 μM 濾器過(guò)濾，加入2%的雙抗，樣本于-80 ℃凍融 3 次，采用 QIAamp Viral RNA Mini kit 試劑盒分別提取12 份樣本的核酸.5 ～6 月的6 份樣本組成一個(gè) pool 樣，10 ～ 11 月的 6 份樣本組成一個(gè) pool 樣，加入 10 U 的 DNase 和 1.5 μg RNase 在37 ℃條件下孵育90 min 以除去游離的核酸. 按照Thermo Scientific Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和隨機(jī)引物的說(shuō)明書(shū)合成雙鏈cDNA，通過(guò)Qubit 分光光度計(jì)測(cè)定pool 樣中cDNA 的質(zhì)量，檢驗(yàn)合格的cDNA 送派森諾生物，利用Illmina 公司的NovaSeq 二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，使用MEGAN 軟件分析病毒種類(lèi).

1.4 基因組的驗(yàn)證

根據(jù)來(lái)自Illumina 測(cè)序得到的病毒序列，設(shè)計(jì)病毒的檢測(cè)引物并建立檢測(cè)所鑒定病毒的RT-PCR 方法，以進(jìn)一步驗(yàn)證病毒宏基因組鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并調(diào)查各種病毒在各樣本中的分布，引物信息見(jiàn)表1.反應(yīng)體系:酶12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA 或 c DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL.反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度見(jiàn)表1，72 ℃ 延伸 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆接入含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送擎科生物有限公司測(cè)序，采用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列分析.

表1 檢測(cè)6 種病毒的引物信息Table 1 Primer information for detection of 6 viruses

1.5 AstV、NoV、SV 基因組擴(kuò)增

為了進(jìn)一步了解AstV、NoV、SV 的基因組特征，根據(jù)本研究獲得的數(shù)據(jù)和 GenBank 收錄的 AstV、NoV、SV 毒株序列，利用Primer 5.0 分別設(shè)計(jì)引物，引物相關(guān)信息如表2 所示.

表2 擴(kuò)增基因組的各引物信息Table 2 Primer information of amplified genome

1.6 AstV、SV、NoV 的基因組序列和遺傳進(jìn)化及重組分析

將獲得的各目的片段利用DNAstar 中的Seqman進(jìn)行拼接； 用 ORF 查找軟件(http:/ /www. ncbi.nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)進(jìn)行分析；使用DNAStar軟件中的MegAlign 程序分析核苷酸和氨基酸序列的相似性.使用MEGA7.0 軟件以Neighbor-joining(Bootstrap 值為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)獲得的病毒基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析. 用 SimPlot 軟件(Version 3.5.1)和Recombination Detection Program 4.0(RDP 4.0，Version 4.96)的 RDP，Gene Conv，Chimaera，Max-Chi，BootScan，Si Scan 和 3Seq 方法預(yù)測(cè)重組事件.

2 結(jié)果

2.1 腹瀉糞便樣本中病毒種類(lèi)

兩個(gè)文庫(kù)共獲得318710620 reads，可注釋為病毒序列的讀長(zhǎng)為1590815 reads ，并拼接出2 898 條病毒contig.經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后，從紅原縣兒童腹瀉糞便中共鑒定出6 種病毒:AstV、AdV、NoV、SV、CAV 和 AiV，其序列組成見(jiàn)圖1.

圖1 腹瀉兒童糞便樣本中病毒的序列組成Fig.1 Sequence composition of viruses in fecal samples

2.2 病毒在12 份樣本中的分布

RT-PCR 證實(shí)了6 種病毒的真實(shí)存在，檢出率分別為:AstV:66.67%、NoV:8.33%、SV:25.00%、AiV:8.33%、CAV:8.33%、AdV:8.33%. 混合感染檢出率為33.33%.其在各樣本中的分布見(jiàn)表3.

表3 6 種病毒在臨床樣本中的分布Table 3 Distribution of 6 viruses in clinical samples

2.3 AstV 基因組分析

成功從2 號(hào)樣本中獲得一條AstV 基因組，命名為Hu/HY/2019/CHN(GenBank 登錄號(hào):MW863309).完整基因組全長(zhǎng)6 826 bp，編碼框全長(zhǎng)6 645 bp，GC含量 44.37%，由 5′UTR 和 ORF1a、ORF1b、ORF2 以及 3′UTR 組成，5′UTR 為 76 bp，ORF1a 為 2 803 bp，編碼934 個(gè)氨基酸，ORF1b 為 1 561 bp，編碼 520 個(gè)氨基酸，ORF2 為 2 364 bp，編碼 788 個(gè)氨基酸，3′UTR為81 bp. 該毒株與GenBank 中上海人源 AstV 毒株SH1(FJ357759)相似性最高(97.3%)，為 AstV-1b型.與 SH1 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5′UTR 存在 5 個(gè)堿基的突變，3′UTR 相有一個(gè)堿基的突變，ORF1a 和 ORF1b 共有96 個(gè)堿基突變(30 個(gè)氨基酸突變)，ORF2 有 43 個(gè)堿基突變(5 個(gè)氨基酸突變). 經(jīng)預(yù)測(cè)抗原表位后，發(fā)現(xiàn)氨基酸突變并未處于抗原表位位置.

為了進(jìn)一步分析Hu/HY/2019/CHN 的進(jìn)化關(guān)系，選取了GenBank 中國(guó)內(nèi)所有的AstV 基因組序列、11 個(gè)與其相似性最高的國(guó)外毒株基因組序列和其它型代表毒株基因組序列，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示與上海株SH1(FJ375759)遺傳關(guān)系最近(圖2).基于ORF1a、ORF1b、ORF2 分別建立的進(jìn)化樹(shù)也與上海株SH1(FJ375759)遺傳關(guān)系最近(資料未顯示).

2.4 SV 基因組分析

成功從9 號(hào)樣本中獲得一條片段為7 355 bp ，其中編碼框全長(zhǎng)為7 302 bp 的SV 基因組，命名為Hu/CHN/2019/GIV.1/HY-7(GenBank 登錄號(hào):MW86330 9)，GC 含量為 53.23%.由 5′ UTR 和 ORF1、ORF2 及3′UTR 組成.5′UTR 長(zhǎng)度為 16 bp，ORF1 與 ORF2 之間有4 個(gè)核苷酸的重疊.ORF1 的長(zhǎng)度為6 803 bp，編碼2 266 個(gè)氨基酸，依次為 NS1、NS2、NS3、NS4、NS5、NS6-7 和 VP1；ORF2 長(zhǎng)度為 504 bp，編碼 168 個(gè)氨基酸，構(gòu)成 VP2 蛋白.3′UTR 長(zhǎng)度為 36 bp. 與 GenBank中江蘇毒株TZ-Lib06-1(GenBank 登錄號(hào):MN16159 5)相似性最高(98.47%)，為 GIV.1 型. 與 GenBank中所有的34 條完整GIV.1 型 SV 相比，ORF1 區(qū)域有43 個(gè)獨(dú)特的核苷酸的突變， 9 個(gè)核苷酸突變位于RdRp區(qū)域，A1304T 核苷酸突變?yōu)橛辛x突變使得RdRp基因編碼的氨基酸發(fā)生了獨(dú)特變異(N435T)；15 個(gè)核苷酸突變位于VP1 區(qū)域，A173T 核苷酸突變?yōu)橛辛x突變，使得VP1 基因編碼的氨基酸發(fā)生了獨(dú)特的變異(V58E)；VP2 區(qū)域有兩個(gè)獨(dú)特的核苷酸突變，未見(jiàn)有義突變.

選擇GenBank 中的全部國(guó)內(nèi)SV 毒株的基因組序列、10 個(gè)與其相似性最高的國(guó)外毒株基因組序列和其它型代表毒株的基因組序列采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖 3)，Hu/CHN/2019/GIV.1/HY-7 與江蘇株MN161595 遺傳關(guān)系最近. 基于 SV 的 VP1、VP2 和RdRp 區(qū)氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果與全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致(資料未顯示).

2.5 NoV 基因組分析

成功從3 號(hào)樣本中獲得一條片段為7 554 bp，其中編碼框全長(zhǎng)為6 702 bp 的NoV 基因組，命名為Hu/HY-1/19/CHN(GenBank 登錄號(hào):MW981327)，GC 含量為 49.85%. 由 5′UTR 和 ORF1、ORF2、ORF3 以及3′UTR 組成.5′UTR 為5bp， ORF1 的長(zhǎng)度為5 097 bp，依次編碼 p48、NTPase、p22、Vpg、 Pro、RdRp；ORF2 的長(zhǎng)度為 1 623 bp，編碼 VP1 蛋白；ORF3 長(zhǎng)度為8 076 bp，編碼 VP2 蛋白，3′UTR 為41 bp.使用諾如病毒在線分型網(wǎng)站進(jìn)行分型，結(jié)果為GII.4 型Sydney-2012 類(lèi)基因簇，與我國(guó)河南毒株MK934772 相似性最高，核苷酸相似性為98.73%，氨基酸相似性為97.1%.

與GenBank 中相似性最高的 100 條 GII.4 型Sydney-2012 類(lèi)基因簇毒株的 RdRp 區(qū)域相比，Hu/HY-1/19/CHN 有23 個(gè)獨(dú)特的核苷酸突變(A126G、A147G、C159T、T175C、G177A、A222G、C267T、C303T、G366A、T418C、T453C、G546A、T705C、T729C、A820G、C978T、 C979T、 C993T、 T996C、 G1101A、 C1110T、A1271G、C1365T)，其中 A820G 和 A1271G 位置的核苷酸位點(diǎn)為有義突變導(dǎo)致了氨基酸位點(diǎn)的突變(I274V、E424G)，分別位于 RdRp 手掌和手指結(jié)構(gòu)域.與GenBank 中相似性最高的100 條GII.4 型Sydney-2012 類(lèi)基因簇毒株的VP1 區(qū)域的抗原表位A、B、B2、D、E、F 進(jìn)行位點(diǎn)突變的分析，結(jié)果顯示在抗原表位F 中有1 個(gè)獨(dú)特突變(D357G)，位于P2 結(jié)構(gòu)域.

出于篇幅考慮，只選擇了GenBank 中與Hu/HY-1/19/CHN 相似性最高的 30 條(相似性 97.73%-98.73%)全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，所有毒株均為 GII.4 型 Sydney-2012 類(lèi)基因簇，Hu/HY-1/19/CHN 聚為獨(dú)立一支，顯示出獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)(圖4).基于VP1 蛋白和RdRp 蛋白的氨基酸序列分別建立的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果均與Sydney-2012 類(lèi)基因簇毒株聚為一支，分別與廣東毒株(KY407116) 和濟(jì)南毒株(MG214988)遺傳關(guān)系最近(資料未顯示).

3 討論

四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣屬于典型的高原牧區(qū)，兒童腹瀉是當(dāng)?shù)氐某０l(fā)病和多發(fā)病，但兒童腹瀉相關(guān)的病原學(xué)和流行病學(xué)資料嚴(yán)重匱乏.本實(shí)驗(yàn)采用了宏病毒組技術(shù)從紅原縣12 份兒童腹瀉糞便中鑒定出6 種致腹瀉病毒(AstV、NoV、SV、AiV、CAV、AdV)，并用RT-PCR 進(jìn)一步證實(shí)了這6 種病毒的存在，其中星狀病毒的檢出率最高.12 份樣本中有6 份單一病毒感染，4 份樣本為病毒混合感染. 病毒的混合感染會(huì)增加疾病的嚴(yán)重性，同時(shí)也增加了診斷和防控的難度[14].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為當(dāng)?shù)貎和篂a的病原學(xué)診斷提供了參考，也為進(jìn)一步開(kāi)展腹瀉病毒的分子流行病學(xué)的調(diào)查奠定了基礎(chǔ).

AstV 是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的重要病原之一[15]. 在本實(shí)驗(yàn)的12 份樣本中，AstV 檢出率為66.67%，春季和秋季的樣本中均有檢出. 因此，AstV 可能是導(dǎo)致當(dāng)?shù)貎和篂a的一個(gè)重要原因. 本實(shí)驗(yàn)AstV 的檢出率顯著高于2017 ～2019 年四川地區(qū)1.89% 的AstV 檢出率[16]，這可能與采樣地點(diǎn)不同有關(guān). 目前在Gen-Bank 中中國(guó)AstV-1b 型完整基因組共5 條，包括本研究上傳的Hu/HY/2019/CHN(MW863309)毒株，采樣年份分別為 2005、2007、2008、2010、2019 年. AstV 基因ORF2 中的兩個(gè)可變區(qū)VR1 和VR2 被用來(lái)評(píng)估HAstV 的變異，將5 條序列的 VR1 和 VR2 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示差異不大，提示我國(guó)AstV-1b型的序列仍相對(duì)穩(wěn)定，這與Guo 的研究結(jié)果一致[17].

在本實(shí)驗(yàn)采集的12 份樣本中 SV 檢出率為25.00%，均為秋季采集的樣本，這可能與SV 以寒冷季節(jié)較為流行有關(guān)[18].2001 年我國(guó)首次報(bào)道了SV 的檢出[19]，該病毒已經(jīng)在國(guó)內(nèi)廣泛流行，檢出率在0.70% ～2.50%[20-22].2017 ～2019 年在四川 1 ～50 歲人群中709 份樣本SV 檢出陽(yáng)性率為2.50%[16]，低于本實(shí)驗(yàn)在紅原縣樣本的檢出率，這可能和樣本的時(shí)間和采樣的地點(diǎn)有一定關(guān)系.本研究從腹瀉糞便樣本中獲得了1 株SV 基因組序列，為GIV.1 型.SV 的RdRp與基因組的復(fù)制以及亞基因組RNA 的合成和擴(kuò)增中起關(guān) 鍵 作 用[23]， 值 得 注意 的是 Hu/CHN/2019/GIV.1/HY-7 與其它GIV.1 型SV 的RdRp 區(qū)域相比，有9 個(gè)獨(dú)特的核苷酸突變，其中有1 個(gè)核苷酸突變?yōu)橛辛x突變，使得435 位氨基酸由N 變?yōu)門(mén)，此獨(dú)特變異是否與青藏高原地區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境有關(guān)以及對(duì)功能的影響有待進(jìn)一步研究.

NoV 是全球流行的急性胃腸炎病因之一[24]. 本實(shí)驗(yàn)12 份樣本中檢出了一份陽(yáng)性，并成功獲得了NoV 基因組序列，為 GII.4 型 Sydney-2012 簇成員.遺傳進(jìn)化分析Hu/HY-1/19/CHN 聚為獨(dú)立一支，顯示出獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì). GII.4 型Sydney-2012 株于2013年由澳大利亞學(xué)者首次報(bào)道[25]，此后在世界范圍內(nèi)流行[26-27]；2013 年國(guó)內(nèi)也證實(shí)了該型毒株的存在，此后在廣東、江蘇、四川、北京、安徽等地陸續(xù)報(bào)道，也成為了我國(guó)的流行毒株[28-30].抗原變異是導(dǎo)致新型NoV出現(xiàn)的重要因素之一[31]，Sydney-2012 的VP1 蛋白中的368、373 和376 位點(diǎn)的適應(yīng)性變化由GII.4-2009產(chǎn)生抗原變異而出現(xiàn)，與其它型的基因簇相比，Sydney-2012 能夠結(jié)合更廣譜的 HBGAs，因此導(dǎo)致其廣泛的流行[32]. 本研究中的Hu/HY-1/19/CHN 與其它GII.4 型 Sydney-2012 毒株的 VP1 區(qū)域相比，其 P2 結(jié)構(gòu)域F 抗原表位中有1 個(gè)獨(dú)特突變(D357G)，而表位F 是目前已知的唯一保守的GII.4 封鎖表位，在1974～2015 年GII.4 株中均為保守的，F(xiàn) 表位的氨基酸突變，可能會(huì)導(dǎo)致免疫逃逸變異[33]，因此，有必要進(jìn)一步監(jiān)測(cè)Hu/HY-1/19/CHN 毒株的流行性情況.

NoV 的RdRp 對(duì)病毒的復(fù)制十分重要，大流行性GII.4 型人源諾如病毒RdRp 的低保真度有助于其成為優(yōu)勢(shì)毒株全球流行[33]. 與其它 GII.4 型 Sydney-2012 毒株的 RdRp 區(qū)域相比，Hu/HY-1/19/CHN 有 2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(I274V、E424G)，分別位于RdRp 手掌和手指結(jié)構(gòu)域，是與病毒的復(fù)制與合成密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[34]，因此氨基酸的突變對(duì)RdRp 功能的影響值得進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

本研究首次在紅原縣兒童腹瀉樣本中證實(shí)AstV、SV、NoV、AiV、CAV、AdV 6 種病毒的存在，AstV 的檢出率最高，存在病毒混合感染的情況. 成功獲得了AstV-1b 型、GII.4 型 NoV 和 GIV.1 型 SV 毒株的基因組.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紅原縣兒童腹瀉的病原學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了參考，豐富了青藏高原兒童腹瀉病毒的分子特征和遺傳進(jìn)化資料.