肖 連，郭 琪，黃 堅，楊曉農(nóng)，李 妍

（1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川醫(yī)療器械生物材料和制品檢驗中心有限公司，四川 成都 610000）

貓腹瀉性疾病在臨床上較為多發(fā)，尤其是傳染性病原引起的臨床危害最為突出，其中以貓泛白細胞減少癥病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)為代表的腸道病毒是引起幼年貓發(fā)病死亡的主要原因[1-2].因此，對FPV的臨床關(guān)注要高于其他已知的貓腸道病毒.病毒宏基因組學(xué)研究的結(jié)果表明，貓糞便樣本中存在FPV 與貓星狀病毒(Feline astrovirus，F(xiàn)AstV)、貓腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECoV)以及其他多種腸道病毒混合感染的情況[3]. 臨床上FPV 與FECoV可引發(fā)不同程度的嘔吐和(或)腹瀉等消化道癥狀.FECoV 感染貓康復(fù)后可隱性帶毒，導(dǎo)致該病原對周圍環(huán)境的持續(xù)污染[4].雖暫無致病性試驗證實FAstV 與貓腹瀉直接相關(guān)，但通過電子顯微鏡可從腹瀉貓的糞便樣本中鑒定出FAstV[5]，且FAstV 在不同國家和地區(qū)貓群的糞便樣品中呈現(xiàn)一定的檢出率(7.0% ～36.2%)[6-8].目前對于這三種病原直接臨床診斷較為困難，且依然缺乏同步的病原鑒別診斷方法，因此需要建立多重PCR 方法以實現(xiàn)準(zhǔn)確的同步檢測.

FPV 為雙股DNA 病毒，其結(jié)構(gòu)蛋白VP2 為主要的抗原衣殼蛋白，且不同來源毒株的VP2 基因同源性大于99%[9]，因此常作為特異性的分子檢測靶點.FAstV 為單股正鏈 RNA 病毒，包括3 個重疊的 ORF片段，其中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的 ORF1b 片段更為保守[10]，作為靶標(biāo)已成功用于FAstV 的分子檢測[8].FECoV 為單股正鏈RNA 病毒，包括11 個 ORF 片段，而針對膜蛋白N 基因設(shè)計的RT-PCR 檢測方法可以獲得最高的陽性檢出率[11]，因此是穩(wěn)定的檢測靶標(biāo).研究團隊在過往研究中分析了成都市區(qū)貓群中FPV、FAstV 和FECoV 的感染情況[8]，發(fā)現(xiàn)多病原混合感染情況較為普遍，但均采用單一PCR 方法進行檢測，故診斷效率不高. 目前國內(nèi)尚未有同時檢測 FPV/FAstV/FECoV 的分子檢測方法，因此本研究擬建立能在同一反應(yīng)體系中快速檢測上述病原的三重PCR 方法，并對臨床樣本進行檢測分析，了解當(dāng)下成都市區(qū)這三種病毒的流行現(xiàn)狀，豐富流行病學(xué)資料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

貓星狀病毒(FAstV)、貓細小病毒(FPV)、貓腸道冠狀病毒(FECoV)、貓諾如病毒(Feline Norovirus，F(xiàn)NoV)、貓鼻氣管炎病毒(Feline rhinotracheitis virus，F(xiàn)RV)、貓嵌杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)、犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)和犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)的陽性樣本均由本西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室鑒定保存. 207 份貓糞便樣本(66 份臨床健康樣本，141 份腹瀉樣本)采集自于成都市區(qū)5 家寵物醫(yī)院(2019 年 11 月 ～2020 年11 月).

1.1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞和 DNA Marker Ⅱ、2 × Taq PCR Mastermix 購自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus、pMD19-T 載體、Prime ScriptTMRT 購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；E. Z. N. A?Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒和E. Z. N. A.?PlasmidDNA Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA Bio-Tek 公司.

1.1.3 引物設(shè)計和合成

根據(jù)GenBank 中FECoV(KY566208.1)N 基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5 軟件設(shè)計檢測引物，F(xiàn)AstV ORF1b[8]和FPV VP2[12]的引物序列引自參考文獻，由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)合成，引物信息見表1.

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及核酸的提取及cDNA 制備

將采集到的糞便樣本用1% ～2%雙抗+PBS，分裝EP 管，于-80 ℃反復(fù)凍融 3 次，5 000 r/min，離心8 min后，取上清液.按照試劑盒說明書操作步驟提取DNA 或RNA.按照Prime ScriptTMRT 說明書的方法配置反應(yīng)體系，將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA.反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，含 5 × PrimeScript Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、Random 6 mers 2 μL、RNA 4 μL、RNAase Free dH2O 9 μL. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃，15 min；85 ℃，15 s；16 ℃，10 min，將 cDNA 置于-20 ℃冰箱保存.

1.2.2 PCR 擴增及電泳檢測

利用表 1 合成的 FAstV、FPV 和 FECoV 的 3 對引物分別對cDNA 進行PCR 擴增，不同引物退火溫度設(shè)置不同.反應(yīng)程序為:95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；52 ℃ /49 ℃ /56 ℃，30 s，72 ℃，30 s， 35 個循環(huán)；72 ℃，10 min，反應(yīng)體系為 20 μL(2 ×Tap Master Mix 10 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL). PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將陽性PCR 產(chǎn)物按照E. Z. N. A. ? Gel Extraction Kit 試劑盒說明書操作步驟進行膠回收，并連接于pMD19-T 載 體， 分 別 構(gòu) 建 得 到 pMD19-T-FAstV ORF1b、pMD19-T-FPV VP2 和 pMD19-T-FECoV N 三種重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆并由生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定.將測序正確的陽性菌分別接種于含Amp(50 μg/mL)的2 ×YT 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，按照 E. Z. N. A.?PlassmidDNA Mini Kit 試劑盒說明書操作步驟進行質(zhì)粒的提取，使用Nanodrop 分光光度計測定質(zhì)粒濃度.

1.2.4 FAstV、FPV 和 FECoV 三重 PCR 的建立及條件優(yōu)化

將提取的 FPV、FAstV 和FECoV 質(zhì)粒稀釋到相同的數(shù)量級后，分別取20 μL 混勻，作為三重PCR 的檢測模板，用以優(yōu)化反應(yīng)體系的引物終濃度和退火溫度. 引物濃度優(yōu)化的 PCR 總反應(yīng)體系為 25 μL:FAstV、FPV 和 FECoV 檢測模板 DNA 1.5 μL:2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，將表 1 合成的 FAstV、FPV和FECoV 三對引物按不同添加量加入反應(yīng)體系中見表2，引物的初始濃度均為10 μM，其余體積用ddH2O補足. 擴增程序為:95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 個循環(huán)，最后 72 ℃ 延伸10 min.擴增結(jié)束后，取8 μLPCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以能同時擴增出清晰的三條目的條帶做為判定標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳引物濃度.退火溫度優(yōu)化的總反應(yīng)體系為 25 μL:FAstV、FPV 和 FECoV 混合模板DNA 1.5 μL；2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL；以優(yōu)化后的引物濃度條件添加入三對引物，其余反應(yīng)體系由ddH2O 補足.擴增程序中退火溫度分別設(shè)置為48 ℃、50 ℃、52 ℃ 、54 ℃、56 ℃和 58 ℃共 6 個不同的梯度，并設(shè)置陰性對照.PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以能同時擴增出清晰的三條目的條帶做為判定標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳退火溫度.

表2 三重PCR 的引物濃度正交篩選Table 2 Orthogonal Screening of final concentration of primers for triple PCR

1.2.5 三重PCR 方法的檢驗

1.2.5.1 特異性試驗

為評價優(yōu)化的三重 PCR 的特異性，分別對FAstV/FPV/FECoV 的混合模板和FAstV、FPV 和 FECoV 單一模板以及貓諾如病毒(FNoV)、貓輪狀病毒(FRV)、貓杯狀病毒(FCV)、犬細小病毒(CPV)和犬冠狀病毒(CCoV)的陽性核酸模板進行檢測.

1.2.5.2 敏感性試驗

為評價優(yōu)化的三重PCR 的敏感性，將獲得的三種質(zhì)粒模板分別進行10 倍梯度稀釋，共計8 個梯度，分別為 1 × 100、1 × 101、1 × 102、1 × 103、1 × 104、1 ×105、1 ×106、1 ×107；各個稀釋梯度分別取 0.5 μL 質(zhì)?；靹颍鳛槟０暹M行擴增.

1.2.5.3 重復(fù)性試驗

為評價該三重 PCR 的穩(wěn)定性，對 FAstV/FPV/FECoV 混合核酸樣本進行4 個批次的重復(fù)試驗.

1.2.6 臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的 FAstV、FPV 和 FECoV 三重 PCR 對207 份貓糞便樣本(66 份臨床健康樣本和141 份腹瀉樣本) 進行檢測，同時用針對三種病原的單一PCR[9，12]進行驗證.

2 結(jié)果

2.1 FAstV/FPV/FECoV 三重PCR 條件優(yōu)化及反應(yīng)建立

2.1.1 引物濃度的優(yōu)化結(jié)果

三對引物均能擴增出相應(yīng)的病毒靶基因，電泳結(jié)果和測序結(jié)果均與參考基因相符. 在三重PCR 的反應(yīng)體系中改變?nèi)龑σ锏奶砑恿窟M行正交試驗，引物添加量為0.4 ～0.7 μL，對應(yīng)的引物終濃度為0.16 ～0.28 μM.結(jié)果如圖 1 顯示，泳道 13、15、16、31 能清晰擴增出三條目的條帶(FPV 為468 bp，F(xiàn)AstV 為320 bp，F(xiàn)ECoV 為664 bp).而泳道31 與其它三個泳道相比沒有產(chǎn)生明顯的引物二聚體，且引物濃度合理，因此最終確定三重 PCR 的25 μL 反應(yīng)體系中 FAstV、FPV 和 FECoV 的引物添加量分別為 0.4 μL、0.4 μL和0.4 μL，即引物濃度均為0.16 μM.

圖1 三種病毒引物濃度的正交試驗M:DNA Marker II；1-36:樣本；N:陰性對照.Fig.1 Orthogonal tests of three virus primer concentrations

2.1.2 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

設(shè)定6 個不同的退火溫度進行三重PCR 擴增，結(jié)果見圖2.以能同時擴增出三條目的條帶且亮度理想為標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇適宜的退火溫度為54 ℃.

圖2 三重PCR 退火溫度的優(yōu)化M:DNA Marker II；1-6:48 ℃、50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃；N:陰性對照Fig.2 Optimized annealing temperature of the triple PCR

2.2 FPV/FAstV/FECoV 三重 PCR 的檢驗結(jié)果

2.2.1 特異性

用已建立的三重PCR 對8 種犬貓病原的陽性模板進行檢測，除FPV、FAstV 和FECoV 外，另外五種病原均不能擴增出相應(yīng)條帶(圖3). 結(jié)果表明，本研究建立的三重PCR 特異性良好.

圖3 三重PCR 的特異性試驗M:DNA Marker II；1-3:FPV、FAstV 和 FECoV；4:FPV、FAstV 和 FECoV 的混合質(zhì)粒；5-9:FRV、FCV、FNoV、CPV 和 CCoV；N:陰性對照Fig.3 Triple PCR specificity test

2.2.2 敏感性

分光光度計測定FPV、FAstV 和FECoV 的質(zhì)粒濃度分別為 24.1ng/μL、71.2ng/μL 和 51.0 ng/μL. 使用建立的三重PCR 方法對梯度稀釋的質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)PV、FAstV 和 FECoV 的最低限分別為2.4 pg/μL、7.1 pg/μL 和5.1 pg/μL(圖4)，即拷貝數(shù)分別為 4.7 × 106copy/μL、2 ×107copy/μL 和 7 × 106copy/μL.

圖4 三重PCR 敏感性試驗M:DNA MarkerII；1-8:100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀釋；N:陰性對照Fig.4 Triple PCR sensitivity test

2.2.3 重復(fù)性

用建立的三重 PCR 對 FPV、FAstV 和 FECoV 的模板進行了4 個批次的重復(fù)檢測，均穩(wěn)定獲得一致的試驗結(jié)果，表明該方法的重復(fù)性良好.

2.3 臨床應(yīng)用

同時使用已建立的三重PCR 和單一PCR 對207份貓肛拭子樣本進行病毒分子檢測. 三重PCR 檢測結(jié)果顯示FAstV 檢出率為24.2%(50/207)，其中腹瀉貓的檢出率為24.8%(35/141)略高于臨床健康貓22.7%(15/66)；FPV 的檢出率為 37.2%(77/207)，其中腹瀉貓的檢出率為48.9%(69/141)顯著高于臨床健康貓 12.1% (8/66)；FECoV 檢出率為 15.5%(32/207)，其中腹瀉貓的檢出率為12.7%(20/141)低于臨床健康貓18.2%(12/66).部分臨床樣本擴增結(jié)果見圖5.其中，F(xiàn)PV/FAstV、FPV/FECoV 和 FAstV/FECoV 的混合感染率分別為9.2%(19/207)、6.3%(13/207)和 6.3% (13/207)，F(xiàn)PV/FAstV/FECoV 的三重混合感染較少見(2.4%，5/207). 檢測結(jié)果與單一PCR 結(jié)果符合度為100%，表明該三重PCR 能夠快速的檢測這三種病原.

圖5 部分樣本三重 PCR 擴增結(jié)果M:DNA Marker II；1-22:部分臨床樣本；N:陰性對照；P:混合質(zhì)粒模板.Fig.5 Triple PCR amplification results of partial samples

3 討論

FPV 仍然是貓病毒性腹瀉的主要多發(fā)病原，因而臨床上對其進行診斷的方法也較為成熟[13]，而FAstV和FECoV 引起的明顯或亞臨床發(fā)病的情況并未得到足夠重視，且多病原混合感染對疾病的進程和治療轉(zhuǎn)歸的影響也缺乏有效評估[8，14-15]，其中的原因之一便是缺少針對這些病原的高效檢測方法. 因此，本研究通過條件優(yōu)化獲得了特異性、敏感性和穩(wěn)定性良好的FPV/FAstV/FECoV 三重PCR 檢測方法. 考慮到DNA和RNA 病毒在核酸提取及擴增效率上的差異，對引物濃度、酶濃度和退火溫度等條件的正交篩選及優(yōu)化可以極大程度上兼顧反應(yīng)體系中不同病毒的擴增效率.優(yōu)化建立的三重PCR 方法對模板梯度稀釋后得到的最低檢測限為 2.4 ～7.1 pg/μL(4.7 ×106copy/μL ～2 ×107copy/μL)，與報道的各病原單一 PCR 方法的檢測限相當(dāng)[8，16-17]，且三重PCR 與單一PCR 對臨床樣本的檢測符合率為100%，表明成功為這三種病原的同步臨床檢測提供了一種快速準(zhǔn)確的方法.

對現(xiàn)有207 份貓糞便樣本的檢測結(jié)果顯示，腹瀉貓只的FPV 與FAstV 或FECoV 的混合感染率仍顯著高于健康貓，提示這些病原的復(fù)制可能在宿主機體發(fā)生免疫抑制時變得活躍[14-15，18]，而健康貓只攜帶的相關(guān)病原也存在觸發(fā)疾病和在貓群內(nèi)持續(xù)流行的風(fēng)險.根據(jù) Zhang 等人報道，2016 ～2017 年中國東北5 個城市的 FPV 和 FAstV 檢出率分別為 37.06% 和23.35%，其中 FPV 與 FAstV 的混合感染率為8.63%[16].在過往研究中，作者對2017 ～2018 年成都市區(qū)315 只家養(yǎng)貓糞便中的FPV、FAstV 和FECoV進行了檢測，陽性檢出率分別為 38.4% (健康:40.2%；腹瀉:36.6%)、23.2%(健康:17.7%；腹瀉:27.2%)和19.5%(健康:24.5%；腹瀉:19.3%)，其中多病原混合感染的檢出率為18.3%[8]. 相比之下，2019 ～2020 年成都市區(qū)貓只中的FPV(總陽性檢出率:37.2%；健康:12.2%；腹瀉48.94%)、FAstV(總陽性率:24.2%；健康:17.65%；腹瀉:27.23%) 和FECoV(總陽性率:15.5%； 健康:18.2%； 腹瀉:14.2%)的感染率仍居高不下，而多重病原的混合感染(24.1%)相對升高，提示本地區(qū)貓群中三種病原的攜帶感染情況未得到明顯改觀，其防控形勢依然嚴(yán)峻，需要引起持續(xù)關(guān)注.

4 結(jié)論

本研究建立的三重PCR 檢測方法能同時快速檢測三種貓腹瀉相關(guān)病原FPV、FAstV 及FECoV，特異性、敏感性、穩(wěn)定性較好，為臨床貓腹瀉性疾病的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠手段.