蔣旭東，鄔建飛，劉 宇，胡雙閣，馬 瑤，龔三你，盧建遠(yuǎn)，字向東

（西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

轉(zhuǎn)錄激活因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)又稱為環(huán)磷腺苷反應(yīng)元素-黏蛋白，基因位于人的第22 號(hào)染色體的細(xì)胞發(fā)生帶22q13.1 上，mRNA在多種組織中廣泛表達(dá)[1].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic retic-ulum，ER)作為蛋白質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯、修飾和折疊發(fā)揮重要作用. 當(dāng)外源或內(nèi)源刺激導(dǎo)致ER 發(fā)生應(yīng)激時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)以緩解ER 中積累的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白造成的應(yīng)激，而ATF4 作為一種對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)中表達(dá)量提高[1-2].當(dāng)氨基酸缺失、氧化應(yīng)激和氧缺失等應(yīng)激因素也可使ATF4 的表達(dá)量升高.ATF4 作為PERK 信號(hào)通路下游關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一，ATF4 的激活能增加C/EBP 同源蛋白基因表達(dá). ATF4 在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，也能調(diào)控脂質(zhì)合成，通過增大ER 體積，恢復(fù)和維持線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方式恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài)[3-4].目前，有些研究表明ATF4 在動(dòng)物生殖調(diào)控中也發(fā)揮重要作用，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的應(yīng)激條件下ATF4表達(dá)增高會(huì)抑制卵巢卵泡的激活[5]，多囊卵巢綜合癥(PCOS)婦女卵泡顆粒細(xì)胞中ATF4 的表達(dá)量低于正常婦女；ATF4 基因敲除的動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)擴(kuò)張、胞外間質(zhì)(ECM)重構(gòu)和孕酮合成相關(guān)的一些重要轉(zhuǎn)錄本下調(diào)，說明ATF4 的異常表達(dá)可能限制動(dòng)物卵泡正常發(fā)育和排卵[6]. 未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)信號(hào)通路激活誘導(dǎo)的ATF4 等基因的表達(dá)對(duì)維持黃體功能和早期黃體退化起主導(dǎo)作用[7].山羊卵泡閉鎖過程中ATF4 mRNA 的表達(dá)量顯著增加[8].

牦牛(Bos grunniens)生活寒冷、低氧、高紫外線輻射的青藏高原，為青藏高原不可替代的重要畜種[9].但是，牦牛ATF4 基因方面的研究尚未見報(bào)道，因此，本研究是以成年母牦牛為研究對(duì)象，克隆ATF4 基因的整個(gè)CDS 區(qū)，分析和預(yù)測(cè)所編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能，檢測(cè)ATF4 基因母牦牛不同組織及主要生殖器官的表達(dá)特性.

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在四川省成都青白江區(qū)屠宰場(chǎng)采集5 頭健康空懷母牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、子宮、卵巢、輸卵管組織和5 頭健康妊娠母牦牛(子宮角有胎兒)的子宮、卵巢和輸卵管，分別放入冷凍管后放入液氮罐中保存，并送至實(shí)驗(yàn)室.

1.2 主要試劑及儀器

DNA Marker DL2000 購(gòu)自 GenStAR 公司；瓊脂糖和 Trizol Reagent 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2 × Taq PCR Master mix 和 PowerUpTMSYBRTMGreen 購(gòu)自 Thermo Scientific 公司；克隆載體pMD19-T 和氨芐青霉素均購(gòu)自寶生生物工程(大連)有限公司；ATF4 多克隆抗體(DF6008)購(gòu)自Affinity公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天漠科技開發(fā)有限公司；膠回收試劑盒和E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司.

瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)購(gòu)自Invitrogen公司；PCR 儀(ETC811)購(gòu)自蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；熒光定量PCR 儀(CFX96)購(gòu)自美國(guó) Bio Rad 公司；激光共聚焦顯微鏡(LSM880)購(gòu)自ZEISS公司.

1.3 總RNA 的提取

采用Trizol 法對(duì)牦牛組織(心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、子宮、卵巢和輸卵管)進(jìn)行總RNA 提取，利用分光光度計(jì)對(duì)RNA D260 nm/D280 nm 值和濃度進(jìn)行檢測(cè)，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其放入-20 ℃冰箱進(jìn)行保存?zhèn)溆?

1.4 引物的設(shè)計(jì)及合成

在GenBank 中登錄的黃牛(Bos taurus)的ATF4基因序列(NM_001034342.2)，根據(jù)NCBI 中黃牛的GAPDH基因序列(NM_001034034.2)，通過 Primer-Premier5 設(shè)計(jì)ATF4 基因的克隆引物以及定量引物和內(nèi)參基因GAPDH熒光定量引物(表1)，所有引物都由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

1.5 牦牛ATF4 基因克隆與測(cè)序

牦牛卵巢組織cDNA 為模板，利用RT-PCR 技術(shù)克隆ATF4 基因.RT-PCR 反應(yīng)體系為 25 μL:2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA (200 ～500 μg/L)1 μL，上游和下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 9.5 μL.RTPCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性 30 s，退火 30 s(表1)，72 ℃延伸1 min，共37 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存.PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按照膠回收試劑盒說明書將膠回收并對(duì)其進(jìn)行純化處理，將純化后的產(chǎn)物與pMD19 載體連接，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，其次再均勻涂到含Amp 抗生素的LB 板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑白色的單菌落，接種于含Amp 抗生素的LB 液態(tài)培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6 h，菌液進(jìn)行PCR 鑒定[10]，將陽(yáng)性菌液交由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

表1 PCR 和熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR and real-time quantitative PCR (RT-qPCR)

1.6 牦牛ATF4 基因生物學(xué)信息分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過DNAMAN6.0 拼接及物種間氨基酸 序 列 比 對(duì)， 利 用 ORF Finder ( https:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov/orffinder/)確定 CDS 區(qū)并翻譯成氨基酸序列，采用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 利 用 Blast ( https:/ /blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi/)對(duì)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用ExPASy-ProtParam ( https:/ /web. expasy. org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，采用SOPMA(https:/ /npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page =npsa_sopma. html/)和SWISS-MODEL(https:/ /swissmodel. expasy. org/interactive/)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TMHMM 和ExPASy-ProtScale(https:/ /web. expasy. org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)和親/疏水性，采用 Signal P 5.0 Serve(http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/Signal P/)和PSORTII(https:/ /psort. hgc. jp/form2. html/)分析信號(hào)肽和預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，利用STRING(https:/ /string-db. org/)分析蛋白質(zhì)相互作用，采用SMART(http:/ /smart. embiheidelberg. de)分析結(jié)構(gòu)域.

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以母牦牛各個(gè)組織(心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、卵巢、輸卵管和子宮)以及妊娠期牦牛卵巢、輸卵管和子宮的cDNA 為模板，采用RT-qPCR 測(cè)定ATF4 的表達(dá)量，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù).TR-qPCR 反應(yīng)體系為15 μL:cDNA1 μL， PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 5.5 μL.反應(yīng)條件:UDG 酶激活 50 ℃；95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火 15 s，40 個(gè)循環(huán)；最后讀取溶解曲線.

1.8 免疫組化分析

利用免疫組化(immunohistochemistry，IHC)染色法檢測(cè)ATF4 蛋白的表達(dá). 將牦牛卵巢、子宮和輸卵管組織從4%的多聚甲醛固定液中取出，制成石蠟切片.脫水后置0.88 mol/L H2O2中封閉，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次；5%胎牛血清封閉，滴加一抗(多克隆兔抗ATF4，BSA 100 倍稀釋)4 ℃孵育過夜；PBS 沖洗3 次后滴加二抗(多聚化山羊抗兔HRP，武漢賽維爾)37 ℃孵育2 h；PBS 沖洗后加入DAB 顯色，經(jīng)過蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，利用共聚焦顯微鏡，進(jìn)行拍照.

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔct法對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR 得到3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，利用Graphpad prism 8.02 軟件繪制表達(dá)差異圖，利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 牦牛ATF4 基因克隆

以卵巢的 cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了與預(yù)期目的產(chǎn)物大小相符的片段(圖1)，表明本試驗(yàn)成功的擴(kuò)增了牦牛ATF4 基因.測(cè)序得到ATF4 基因長(zhǎng)度為1 280 bp，其中CDS 長(zhǎng)度為1 047 bp，共編碼348 個(gè)氨基酸. 序列提交至NCBI，獲得登錄號(hào):OL770369.

圖1 牦牛ATF4 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果M:DL2000 DNA Maker；1、2 和 3:ATF4 引物 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification result of yak ATF4 geneM:DL2000 DNA Maker；1、2 and 3:PCR amplification products of ATF4 primers

2.2 牦牛ATF4 基因核苷酸序列分析

利用DNAMAN 6.0 軟件，將牦牛ATF4 基因測(cè)序結(jié)果中CDS 和黃牛ATF4 基因的CDS 做比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)堿基突變，導(dǎo)致4 個(gè)氨基酸發(fā)生改變(表2).牦牛與黃牛的ATF4 基因CDS 同源性為99.52%.

表2 牦牛與黃牛ATF4 基因編碼區(qū)序列差異Table 2 Coding sequence difference of ATF4 gene between yak and cattle

2.3 ATF4 基因氨基酸序列同源性分析

使用 DNAMAN 6.0 軟件對(duì)牦牛、黃牛(NM_001034342.2)、綿羊(NP_001135990.1)、豬(NP_001116550.1)、和人(CR456384.1)的 ATF4 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示牦牛與黃牛、綿羊、豬、和人的 ATF4 氨基酸序列對(duì)比度分別為97.45%、90.08%、83.85%和83.29%，說明ATF4 基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性(圖2).

圖2 牦牛和其他物種間ATF4 的氨基酸序列比對(duì)黑色:同源性=100%；粉色:同源性＞75%；藍(lán)色:同源性＞50%；白色:同源性＜50%.Fig.2 Alignment of amino acid sequence of ATF4 between yak and other speciesBlack:Homology=100%；Pink:Homology ＞75%；Gray:Homology ＞50%；White:Homology ＜50%.

2.4 牦牛ATF4 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam 在線工具對(duì)牦牛的ATF4蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白分子式為C1680H2657N439O552S13，分子質(zhì)量為38 253.97；ATF4 蛋白的氨基酸由20 種組成(表 3)，其中亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)所占比例較高，分別為 10.6%、10.3%、9.8% 和 9.8%；帶正電荷的(Arg+Lys)氨基酸總數(shù)為 42，帶負(fù)電荷的(Asp +Glu)的氨基酸總數(shù)為64，說明牦牛ATF4 蛋白帶負(fù)電荷；理論等電點(diǎn)為4.72，表明ATF4 蛋白屬于酸性蛋白；脂肪族系數(shù)為70.92；平均親水系數(shù)為-0.639，不穩(wěn)定系數(shù)為55.95，表明ATF4 蛋白屬于親水不穩(wěn)定蛋白. 根據(jù)TMHMM2.0 在線工具分析，ATF4 蛋白跨膜螺旋中氨基酸的期望值0.000 21，所以ATF4 蛋白不是跨膜蛋白. 使用 PSORTII 在線工具分析，發(fā)現(xiàn)ATF4 蛋白主要存在于細(xì)胞核(78.3%)，也存在于線粒體(8.7%)、細(xì)胞骨架(8.7%)和細(xì)胞質(zhì)(4.3%).使用Signal P 5.0 預(yù)測(cè)，結(jié)果表明ATF4 蛋白不含信號(hào)肽.利用SMART 在線軟件分析牦牛ATF4 蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其273 ～337 位氨基酸位置有1 個(gè)BRLZ 結(jié)構(gòu)域，另外在 23 ～ 34 位、160 ～ 172 和 242 ～53 位氨基酸有3 個(gè)低密度區(qū)域.

表3 牦牛ATF4 蛋白質(zhì)氨基酸組成Table 3 The amino acids composition of yak ATF4 protein

2.5 ATF4 蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA 在線工具對(duì)牦牛ATF4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示:α-螺旋占比為44.25%、延伸鏈占比為4.60%、β-轉(zhuǎn)角占比為1.44%和無規(guī)則卷曲占比為49.71%(圖3). 采用 SWISS-MODEL 在線工具對(duì)牦牛ATF4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致.

圖3 牦牛ATF4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)h:α-螺旋；e:延伸鏈；t:β-轉(zhuǎn)角；c:無規(guī)卷曲Fig.3 Secondary structure prediction of yak ATF4 proteinh:α-helix；e:Extended chain；t:β-turn；c:Random coil

2.6 蛋白相互作用分析

根據(jù)STRING11.5 在線工具分析，發(fā)現(xiàn)ATF4 蛋白與 DDIT3、PPP1R15A、CREBBP、EIF2AK3、EIF2S1、TRIB3、EP300、XBP1、ATF6 和 NFE2L2 等蛋白有相互作用(圖4)，他們之間的相關(guān)性系數(shù)分別是0.993、0.972、 0.946、 0.938、 0.938、 0.937、 0.929、 0.927、0.926 和0.925.

圖4 ATF4 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析圖Fig.4 ATF4 protein network interaction analysis

2.7 牦牛ATF4 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從 NCBI 下載黃牛(NM_001034342.2)、獼猴(NM_001266632.2)、綿羊(NM_001142518.1)、人(NM_001675.4)、小鼠(NM_009716.3)、豬(NM_001123078.1)、大猩猩(XM_019018301.2)、羊駝(XM_006207100.3)和山羊(XM_018048794.1)9 個(gè)物種的ATF4 基因序列.利用Mega 7.0 構(gòu)建基因進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛首先聚為一類，其次與綿羊聚為一類，進(jìn)化比較保守，且符合物種進(jìn)化規(guī)律(圖5).

圖5 ATF4 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ATF4 gene

2.8 牦牛ATF4 基因表達(dá)差異分析

以GDPDH為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)空懷母牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、肺臟、卵巢、子宮和輸卵管中ATF4 基因mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果見圖6.以心臟中ATF4 基因的相對(duì)表達(dá)量為參考，結(jié)果顯示，ATF4 基因在牦牛各個(gè)組織中廣泛的表達(dá)，其中以子宮和卵巢的表達(dá)量最高，顯著高于其它組織(P＜0.05).

圖6 ATF4 基因在空懷母牦牛不同組織的相對(duì)表達(dá)水平圖中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示差異顯著(P ＜0.05)，字母相同表示差異不顯著.下同F(xiàn)ig.6 Expression level of ATF4 gene in different tissues of non-pregnant female yakThe error line in the figure refers to the standard deviation.The different lowercase letters indicate that the difference is significant (P ＜0.05).The same as below

以母牦?？諔哑谳斅压蹵TF4 基因的相對(duì)表達(dá)量作為參照，利用RT-qPCR 檢測(cè)牦?？諔哑谂c妊娠期的卵巢、子宮和輸卵管3 個(gè)組織中ATF4 基因mRNA的表達(dá)水平.結(jié)果顯示ATF4 在妊娠期卵巢(圖7A)、輸卵管(圖7B)和子宮(圖7C)的表達(dá)量顯著高于空懷期(P＜0.05).

圖7 ATF4 基因在牦牛生殖器官的相對(duì)表達(dá)水平A:卵巢；B:輸卵管；C:子宮Fig.7 Relative expression level of ATF4 gene in reproductive organs of yakA:Ovary；B:Oviduct；C:Uterus

2.9 母牦牛生殖器官中的ATF4 的定位及表達(dá)

IHC 分析結(jié)果顯示，ATF4 蛋白在母牦牛不同生殖器官組織切片中均有陽(yáng)性表達(dá)，主要在卵巢和子宮表達(dá)，其中，卵泡顆粒層和卵泡液(圖8A)，輸卵管黏膜上皮細(xì)胞(圖8D)，子宮內(nèi)膜和子宮基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量較高(圖8E).

圖8 ATF4 蛋白在母牦牛生殖器官中的定位A、C、E:ATF4 組；B、D、F:陰性對(duì)照 .A、B:卵巢；C、D:輸卵管；E、F:子宮 .a:顆粒細(xì)胞；b:基底膜；d:卵泡液；e:黏膜上皮；f:子宮內(nèi)膜；g:腺上皮；h:基質(zhì)細(xì)胞Fig.8 Location of ATF4 protein in reproductive organs of female yakA、C、E:ATF4 group；B、D、F:Negative control.A、B:Ovary；C、D:Oviduct；E、F:Uterus.a:Granulosa cells；b:Basement membrane；d:Follicular fluid；e:Mucosl epithelium；f:Endometrium；g:Glandular epithelium；h:Stromal cells

3 討論

ATF4 是一種典型具有亮氨酸拉鏈作為二聚體的轉(zhuǎn)錄因子之一，通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的C/EBPATF 反應(yīng)元件結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，是應(yīng)激反應(yīng)的主調(diào)控因子和發(fā)育調(diào)控因子[1，11].ATF4 mRNA 在多種組織中廣泛表達(dá)，會(huì)影響著一系列的生長(zhǎng)發(fā)育及生理活動(dòng)[1].熊燊源[12]研究發(fā)現(xiàn)ATF4 過表達(dá)可以抑制綿羊的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化進(jìn)程，在干擾ATF4 中能促進(jìn)妊娠期綿羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化進(jìn)程，ATF4 在體外受精胚胎中也有著重要的作用.ATF4 在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在自然流產(chǎn)組絨毛膜絨毛組織中ATF4 mRNA 和蛋白水平明顯低于人為終止妊娠，這可能是在正常的妊娠早期，胚胎和滋養(yǎng)層絨毛暴露在缺氧環(huán)境中，PERK-eIF2a-ATF4CHOP 通路被觸發(fā)，導(dǎo)致 CHOP 上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致ERS；而適度表達(dá)ATF4 可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖在胎盤形成和妊娠維持中起著重要作用.這保證了體內(nèi)平衡和滋養(yǎng)細(xì)胞的分化，并有助于胚胎的生長(zhǎng)和發(fā)育；相反，在自然流產(chǎn)過程中ATF4 的表達(dá)降低，抑制細(xì)胞凋亡的能力有所下降，從而影響細(xì)胞的正常增殖，進(jìn)而絨毛細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，最終導(dǎo)致流產(chǎn)[13].這些研究都說明了ATF4 基因在繁殖性能方面有著重要的作用.

ATF4 基因功能的研究在牦牛上尚未報(bào)道，為了探究牦牛ATF4 基因與繁殖相關(guān)性以及與黃牛的ATF4 基因的差異，本研究利用牦牛的卵巢cDNA 成功克隆出來ATF4 基因的CDS 全長(zhǎng)1 047 bp 序列，編碼348 個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量為38 253.97，含有42 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，平均親水系數(shù)為-0.639，推測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為55.95，屬于不穩(wěn)定蛋白，ATF4 蛋白主要存在于細(xì)胞核，這與前人在其它物種的研究相同[1].利用SMART在線軟件分析牦牛ATF4 蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在其273 ～337 位氨基酸位置有 1 個(gè) BRLZ 結(jié)構(gòu)域，BRLZ是啟動(dòng)子中與ERS 反應(yīng)元件(ERSE)基序結(jié)合的特異位點(diǎn)[14]. 本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛ATF4 基因的編碼區(qū)與黃牛相比較有5 個(gè)堿基突變位點(diǎn)，其中4 個(gè)導(dǎo)致氨基酸改變，這種差異能否影響到牦牛ATF4 蛋白的功能，進(jìn)而影響到牦牛的繁殖性能需要進(jìn)一步的研究.氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果牦牛ATF4 與各物種間的同源性比較高，說明ATF4 進(jìn)化比較保守，且符合物種進(jìn)化規(guī)律.

通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示，ATF4 蛋白與DDIT3、PPP1R15A、TRIB3、EP300 和 5XBP1 等蛋白有相互作用.DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本3(DDIT3)在ERS 反應(yīng)中的多功能轉(zhuǎn)錄因子，在多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并在ERS 反應(yīng)中誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，和ATF4 協(xié)同促進(jìn)天冬酰胺合成酶(ASNS)合成.DDIT3 基因在牦牛卵巢和子宮中表達(dá)較高，可能在維持牦牛卵巢機(jī)能和妊娠機(jī)能以及卵泡發(fā)育成熟中起到重要的調(diào)控作用[10].蛋白磷酸酶1 調(diào)節(jié)亞單位15A(PPP1R15A)招募絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1 去磷酸化翻譯起始因子eIF-2A/EIF2S1，從而逆轉(zhuǎn)由應(yīng)激誘導(dǎo)激酶啟動(dòng)的蛋白質(zhì)合成關(guān)閉，促進(jìn)細(xì)胞從應(yīng)激中恢復(fù).PPP1R15A 的選擇性抑制原則上可以改善廣泛的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病[15]. 假性蛋白激酶3(TRIB3)是一種以肝臟中心的表達(dá)模式的細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)基因，它與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)和代謝控制有關(guān)，可以與ATF4 結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄激活活性. ATF4 和 C/EBP 同源蛋白(CHOP)可以與TRB3 啟動(dòng)子中特定的位點(diǎn)結(jié)合，激活TRB3 基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)ERS 相關(guān)的細(xì)胞凋亡等[16]. E1A 結(jié)合蛋白p300(Ep300)介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的賴氨酸巴豆?；揎?Kcr)修飾，上調(diào)卵丘細(xì)胞(CCs)的EGFR 及p-EGFR的表達(dá)，激活 EGFR 通路促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟[17].沉默X 盒結(jié)合蛋白1(XBP1)在ERS 期間，通過調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用.胚胎發(fā)育期間心臟肌生成和肝臟生成以及分泌組織(如外分泌胰腺和唾液腺)的發(fā)育所需，XBP1 缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠，肝臟發(fā)育不全和心肌細(xì)胞壞死，以及胚胎致死和乳腺發(fā)育不良[18]. 從蛋白質(zhì)互作網(wǎng)的結(jié)果分析來看，與ATF4 蛋白存在相互作用的蛋白主要參與ERS，而ERS 與卵泡發(fā)育、卵泡生長(zhǎng)、排卵和早期胚胎附及發(fā)育有關(guān)，進(jìn)而推測(cè)ATF4 基因與繁殖相關(guān)性狀具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性.

RT-PCR 結(jié)果顯示，ATF4 在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，這與人[19]、豬[20]和綿羊[21]中發(fā)現(xiàn)ATF4 在組織中普遍表達(dá)基本一致，說明ATF4 具有廣泛的生物學(xué)功能.ATF4 在牦牛子宮表達(dá)量最高，其次在卵巢中，脾臟表達(dá)最低，這與綿羊的結(jié)果相近[22]. 在婦女生理期，孕酮促進(jìn)子宮內(nèi)膜上調(diào)ERS，通過激活PERK/elF2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜凋亡，維持子宮內(nèi)膜在生理期的周期性變化[23]. 在IHC 結(jié)果顯示，ATF4 蛋白在牦牛子宮上表量較高，且主要分布在子宮內(nèi)膜上和子宮基質(zhì)細(xì)胞，也證明ATF4 參與到子宮的生理功能.環(huán)氧化酶-2(COX2)和前列腺素E2(PGE2)是評(píng)價(jià)排卵功能的標(biāo)志，而ATF4 可以結(jié)合到COX2 啟動(dòng)子上，進(jìn)而衍生的PGE2 在調(diào)節(jié)排卵中起著關(guān)鍵作用[24-25].有研究證明人絨毛膜促性腺激素(hCG)可以激活顆粒細(xì)胞(hGC)中的PI3K/AKT 信號(hào)通路，進(jìn)而刺激ATF4 的表達(dá)，增加的ATF4 轉(zhuǎn)錄本直接與COX2 的啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)了COX2 的轉(zhuǎn)錄和PGE2 的合成，從而促進(jìn)COC 的擴(kuò)張和排卵[6]. 本實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)ATF4 在牦牛卵巢上表達(dá)量較高，在IHC 結(jié)果顯示ATF4 蛋白主要分布在卵泡的顆粒細(xì)胞層上，說明ATF4 可能在牦牛促進(jìn)卵丘卵母細(xì)胞的擴(kuò)張和排卵.

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，牦牛妊娠期ATF4 基因在卵巢、輸卵管和子宮比空懷期表達(dá)量都有顯著增加，其中子宮表達(dá)量和增長(zhǎng)量都是最高的，這與在綿羊的研究結(jié)果一致[18]. 一些研究表明ATF4 誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞損傷，抑制卵巢卵泡活化[14，23]，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)妊娠期卵巢中ATF4 的相對(duì)表達(dá)量顯著空懷期，這說明妊娠刺激卵巢中ATF4 的高表達(dá)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞損失，進(jìn)而抑制妊娠期卵泡的發(fā)育.

4 結(jié)論

本研究克隆得到牦牛ATF4 基因CDS 區(qū)全長(zhǎng)1 047 bp，編碼348 個(gè)氨基酸.ATF4 基因在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，在卵巢、子宮和輸卵管中表達(dá)量高，且妊娠期顯著高于空懷期. ATF4 蛋白主要定位在卵巢的卵泡顆粒層和卵泡液，輸卵管上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜和子宮基質(zhì)細(xì)胞.提示ATF4 基因可能在牦牛繁殖調(diào)控機(jī)能中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用.