劉靖濤, 王 倩, 趙 瑞, 王歡歡, 高 潔, 董 輝,張永軍, 叢 斌,*， 谷少華,*

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽 110866; 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系, 北京 100193; 3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室, 北京 100193)

蚜蟲自身可以分泌產(chǎn)生兩大類信息素，報警信息素和性信息素。蚜蟲報警信息素最早報道于1972年，其主要有效成分為(E)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene, EβF]。已經(jīng)測定的59種蚜蟲中， 41個種的報警信息素是EβF (Bowersetal., 1972; Xiangyuetal., 2002)。蚜蟲可以通過報警信息素進(jìn)行種群間個體的交流，進(jìn)而能夠有效躲避環(huán)境中的有害因子如天敵的捕食(Bowersetal., 1972; Pickett and Griffiths, 1980; Pickettetal., 1992; Yuetal., 2012)。在越來越多的田間和行為學(xué)實驗研究中，EβF被應(yīng)用到了蚜蟲綠色防控中(Pickett and Griffiths, 1980; Yuetal., 2012)。研究蚜蟲識別報警信息素、性信息素和寄主植物揮發(fā)物的分子和行為機(jī)制，可以為開發(fā)基于嗅覺行為調(diào)控的蚜蟲防控策略提供理論基礎(chǔ)。昆蟲的化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)是一種與化學(xué)感受相關(guān)的可溶性蛋白，其與疏水性化合物結(jié)合并將其運(yùn)輸?shù)教囟ㄎ恢?，在嗅覺識別中發(fā)揮作用，在昆蟲抗藥的過程中發(fā)揮作用(Liuetal., 2014)，參與昆蟲生理節(jié)律的調(diào)節(jié)及變化(Guoetal., 2011)，調(diào)控昆蟲的發(fā)育(Stathopoulosetal., 2002)等。

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，屬蚜科(Aphididae)無網(wǎng)管蚜屬Acyrthosiphon，可為害豌豆Pisumsativum和苜蓿Medicagosativa等多種豆科植物(Ogawa and Miura, 2014; 張麗和袁明龍, 2017)。豌豆蚜通過孤雌生殖方式在生長季快速大量繁殖，在越冬時期采取有性生殖方式抵御低溫環(huán)境。因此，通過識別性信息素來尋找配偶交配，對于豌豆蚜完成生活史來說是十分重要的。性信息素主要成分為(+)-(4aS,7S,7aR)-荊芥內(nèi)酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荊芥醇，于1987年在巢菜修尾蚜Megouraviciae中首次被鑒定出來(Dawsonetal., 1987)。不同于報警信息素從腹管中分泌，蚜蟲的性信息素是從雌蟲的后腿脛節(jié)的腺體上分泌的(Marsh, 1972; Pickett and Glinwood, 2007)。

目前關(guān)于蚜蟲CSPs在參與蚜蟲報警信息素和性信息素通訊中的作用還未見報道。本研究通過豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組測序、RPKM值分析、半定量RT-PCR組織表達(dá)譜分析、體外表達(dá)和熒光競爭結(jié)合實驗，測定了在豌豆蚜觸角中高表達(dá)的3個CSPs同蚜蟲報警信息素和性信息素以及植物揮發(fā)物的結(jié)合能力，為蚜蟲CSP蛋白參與蚜蟲報警信息素和性信息素通訊過程提供了證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

豌豆蚜采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊科研中試基地的豌豆植株上，室內(nèi)在人工氣候箱中用養(yǎng)蟲籠(40 cm×40 cm×40 cm)飼養(yǎng)于蠶豆Viciafabae苗上。飼養(yǎng)條件：溫度26±1℃、相對濕度70%±5%、光周期16L∶8D。

蚜蟲報警信息素主要組分EβF，微量組分(-)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和(+)-檸檬烯以及8種植物揮發(fā)物購自Sigma-Aldrich(Sigma Co.,德國)，純度>90%；蚜蟲性信息素組分(+)-(4aS,7S,7aR)-荊芥內(nèi)酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荊芥醇純度>95%，均由英國洛桑研究所周警疆教授提供。上述所有配體信息見表2。

1.2 豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組測序和CSP基因鑒定

利用Trizol法提取豌豆蚜無翅成蚜(約1 000頭)觸角RNA。采用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit(NEB Co., 美國)試劑盒構(gòu)建豌豆蚜觸角cDNA文庫，通過Illumina Hiseq2500測序儀進(jìn)行豌豆蚜蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序。測序完成后，去除低質(zhì)量的raw reads, 得到clean reads。 采用Trinity軟件對獲得的clean reads進(jìn)行拼接(Grabherretal., 2011)，拼接之后將每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載所有已知半翅目昆蟲的CSP基因序列，構(gòu)建本地化數(shù)據(jù)庫，利用tBLASTn篩選豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組中CSP基因序列。將篩選到的CSP基因序列人工校正其正確性。

1.3 觸角轉(zhuǎn)錄組中ApisCSP基因表達(dá)量差異分析

采用每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)(Mortazavietal., 2008)比較1.2節(jié)鑒定的ApisCSP基因在觸角轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量差異。

1.4 ApisCSP基因組織表達(dá)譜分析

Trizol法提取豌豆蚜成蚜不同組織(觸角、口針、去除觸角和口針的頭、胸、腹、足和翅)的RNA。用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA第1鏈，3個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)采集約1 000頭成蚜。各cDNA模板均定量為150 ng/μL。采用半定量RT-PCR檢測1.2節(jié)鑒定到的ApisCSP基因的組織表達(dá)譜?；?.2節(jié)鑒定到的ApisCSP基因序列，用Primer Premier 5設(shè)計RT-PCR引物(表1)。豌豆蚜的β-actin(GenBank 登錄號: NP_001136108)為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系(50 μL): ddH2O 35.75 μL,ExTaqBuffer 5 μL, dNTPs 4 μL, cDNA第1鏈 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各2 μL,ExTaqDNA Polymerase 0.25 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 2 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。每組織3個生物學(xué)重復(fù)，每樣品至少重復(fù)測定6次。

表1 引物信息

1.5 豌豆蚜CSP序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載目前已知的所有蚜蟲的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因和CSP基因序列。OBP和CSP蛋白信號肽預(yù)測使用SignalIP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Petersenetal., 2011)。利用軟件ClustalX 2.1(Larkinetal., 2007)進(jìn)行序列比對，參數(shù)設(shè)置如下：Gap opening=10，Extension=0.2。比對完后用GeneDoc 2.7.0進(jìn)行編輯。每對CSP之間序列相似比通過Vector NTI 11.5(Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA)來計算。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載獲得16種蚜蟲(不限于觸角)的OBP基因85個，CSP基因41個，構(gòu)建進(jìn)化樹。

由于用于構(gòu)建進(jìn)化樹的OBP和CSP的氨基酸序列一致性非常低(分別為10.5%和21.6%)，所以序列比對采用PRANK比對軟件(L?ytynoja and Goldman, 2010; Wangetal., 2019)，進(jìn)化樹構(gòu)建采用RaxML version 8中的最大似然法(Stamatakis, 2014)。通過ProtTest 3(Darribaetal., 2011)預(yù)測建樹的最佳模型為LG替換矩陣，重復(fù)構(gòu)建1 000次。

1.6 ApisCSP2/4/5蛋白的表達(dá)和純化

根據(jù)ApisCSP2/4/5蛋白編碼區(qū)(CDS)序列，設(shè)計特異性引物(表1)，并在正反向引物中分別設(shè)計了NdeI/EcoR I酶切位點(diǎn)(以下劃線表示)。以豌豆蚜觸角cDNA為模板，用Easy A High-fidelity PCR高保真酶(Stratagene, La Jolla, CA, 美國)擴(kuò)增ApisCSP2/4/5的CDS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到pGEM-T Easy載體上(Promega， Madison, WI, 美國)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。序列驗證正確后，將重組質(zhì)粒pGEM/ApisCSP2/4/5與表達(dá)載體PET-30a(+)(Novagen, Madison, WI, 美國)連接，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過IPTG(1 mmol/L) 28℃搖床中誘導(dǎo)8 h后，8 000×g離心10 min收集菌體，然后用裂解液(80 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 4%甘油, 0.5 mmol/L PMSF, pH 7.2)裂解細(xì)胞沉淀，經(jīng)超聲波處理和高速離心后，分別收集上清和沉淀中的包涵體。用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris Buffer (pH 6.8)對不溶的包涵體沖洗，然后溶解在6 mol/L的鹽酸胍中，包涵體的復(fù)性和重折疊采用氧化還原法(Prestwich, 1993)。

利用HiTrap Q HP Columns，Mini Q 4.6/50 Anion Exchange Column，HiTrap Desalting Columns和Superdex 75 10/300 GL Column (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, 瑞典)對重折疊好的蛋白進(jìn)行離子交換、分子篩、濃縮、脫鹽等步驟純化。SDS-PAGE鑒定純化的ApisCSP2/4/5蛋白的純度及分子量大小。以牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法(Bradford, 1976)對純化并濃縮好的ApisCSP2/4/5蛋白進(jìn)行濃度測定。

1.7 熒光競爭結(jié)合實驗

將純化后的ApisCSP2/4/5用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)稀釋到1 mg/mL；配體化合物(表2)及熒光探針1-NPN(Sigma Co., 德國) 分別溶于甲醇溶液中，配成1 mmol/L 的母液備用。使用F-380分光光度計(天津港東，天津)測定目的蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線: 向50 mmol/L Tris-HCl中加入終濃度為2 μmol/L目的蛋白，然后依次加入熒光探針1-NPN至終濃度分別為2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L，充分混勻并反應(yīng)30 s后測定和記錄其熒光強(qiáng)度并計算蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)Ki。然后測定目的蛋白與配體的結(jié)合常數(shù): 加入2 μmol/L蛋白溶液和2 μmol/L熒光探針1-NPN，在相同條件下記錄初始熒光值，再將被測配體分別按終濃度2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L的梯度加入到1-NPN和目的蛋白的混合液中，每次混勻后反應(yīng)30 s，記錄熒光值。每樣品實驗重復(fù)3次。假設(shè)ApisCSP蛋白的活性為100%，且在飽和狀態(tài)下目的蛋白與配體分子以1∶1的比例相結(jié)合，根據(jù)IC50值(ApisCSP/1-NPN復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值下降一半時配體氣味分子的濃度)，計算ApisCSPs和配體分子的結(jié)合常數(shù)Ki。計算公式：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN的濃度，K1-NPN為ApisCSP/1-NPN復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。當(dāng)CSP蛋白同配體的結(jié)合常數(shù)Ki<5 μmol/L時，認(rèn)為CSP同該配體結(jié)合能力很強(qiáng)；當(dāng)5 μmol/L10 μmol/L時，結(jié)合能力較弱(Wangetal., 2021)。

表2 重組蛋白ApisCSP2/4/5與配體的結(jié)合能力

2 結(jié)果

2.1 豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組中CSP基因鑒定

豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組測序共得到134 439 894條raw reads，清除帶接頭和低質(zhì)量的序列后得到131 215 742條clean reads，測序通量為13.12 G，測序深度28.28倍，Q20值為98.12%。序列進(jìn)行組裝后產(chǎn)生32 796條unigenes，長201～20 423 bp，平均長921 bp，N50值和N90值分別為1 634和344 bp。

通過CSP Motif“C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4”分析和本地化tBLASTn比對，在豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到10個CSP基因，其開放閱讀框長369～681 bp。所有的CSP基因序列都通過克隆和測序得到了驗證。我們將豌豆蚜CSP基因與已報道的棉蚜Aphisgossypii(Guetal., 2013)、麥長管蚜Sitobionavenae(Xueetal., 2016)和桃蚜Myzuspersicae(Wangetal., 2019) CSP 序列進(jìn)行了同源比對，根據(jù)其同源性命名為ApisCSP1-10(GenBank登錄號: OK392085-OK392094)。相對于桃蚜和棉蚜，豌豆蚜蟲多了一個CSP3基因。ApisCSP1無信號肽，其余ApisCSPs在其N端都有信號肽。所鑒定的ApisCSPs序列特征均符合昆蟲CSP序列模式“C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4”。

2.2 豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組中CSP序列和進(jìn)化樹

經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜10個CSPs的氨基酸序列同桃蚜CSPs的序列一致性非常高，為66%～90%。進(jìn)化樹表明，蚜蟲OBPs和CSPs兩類氣味結(jié)合蛋白位于兩個明顯不同的分支，表明蚜蟲OBPs和CSPs在進(jìn)化起源上的不同。蚜蟲CSPs可以明顯分成9個亞家族，每個亞家族的CSPs在不同的蚜蟲之間顯示出非常高的同源性(圖1)。

圖1 最大似然法構(gòu)建的基于氨基酸序列的蚜蟲OBPs和CSPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

2.3 豌豆蚜觸角轉(zhuǎn)錄組中ApisCSP基因的RPKM值和組織表達(dá)譜

RPKM值表明，本研究鑒定得到豌豆蚜10個觸角ApisCSP基因中，ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5在觸角中的表達(dá)量最高，RPKM值分別是1 274, 315和443。其余7個CSP基因的RPKM值較低，在20～159之間(圖2)。

半定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這10個ApisCSP基因在豌豆蚜成蚜不同的組織中均有表達(dá)，但是只有ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5同時在觸角、口針、足和翅中高表達(dá)(圖2)。

圖2 基于RPKM值分析的ApisCSP1-10在豌豆蚜成蚜觸角中的表達(dá)量和半定量RT-PCR分析的其在成蚜不同組織中的表達(dá)量

2.4 豌豆蚜ApisCSP2/4/5的重組表達(dá)

基于觸角轉(zhuǎn)錄組RPKM值分析和半定量RT-PCR結(jié)果，我們選定3個表達(dá)量最高的ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5進(jìn)行體外原核表達(dá)和純化。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明3個CSP重組蛋白與大多數(shù)昆蟲OBPs和CSPs一樣，都集中在包涵體中表達(dá)，最終得到高純度的ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5重組蛋白(圖3)，用于進(jìn)行后續(xù)的功能測定。

圖3 ApisCSP2/4/5重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.5 重組蛋白ApisCSP2/4/5的配體結(jié)合特性

通過Scatchard方程得出，豌豆蚜ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5與熒光探針1-NPN的結(jié)合常數(shù)Ki分別為5.87±0.81, 1.87±0.62和2.32±0.49 μmol/L(圖4)。

圖4 重組蛋白ApisCSP2/4/5與1-NPN的結(jié)合曲線(A)和斯卡查德圖(B)

熒光競爭結(jié)合實驗結(jié)果表明，ApisCSP4與報警信息素主要組分(E)-β-法尼烯和微量組分(-)-α-蒎烯結(jié)合能力強(qiáng)，最大競爭結(jié)合力分別是21.2%±1.9%和45.5%±3.1%，Ki值分別為2.2±0.8和4.9±0.7 μmol/L，與另外2種微量組分(-)-β-蒎烯、(+)-檸檬烯結(jié)合能力較弱，最大競爭結(jié)合力>50%，Ki>10 μmol/L；而ApisCSP2和ApisCSP5同4種報警信息素組分結(jié)合能力都比較弱，最大競爭結(jié)合力>50%，Ki>10 μmol/L(圖5; 表2)。ApisCSP2和ApisCSP4與性信息素組分(+)-(4aS,7S,7aR)-荊芥內(nèi)酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荊芥醇都不結(jié)合，IC50值均大于50 μmol/L。ApisCSP5與(+)-(4aS,7S,7aR)-荊芥內(nèi)酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荊芥醇顯示出強(qiáng)結(jié)合能力，最大競爭結(jié)合力分別是39.4%±3.2%和32.9%±3.3%，Ki值分別為4.8±0.9和2.6±0.6 μmol/L(圖5； 表2)。

圖5 重組蛋白ApisCSP2/4/5與蚜蟲報警信息素和性信息素的結(jié)合曲線

3個CSP蛋白與8種植物揮發(fā)物結(jié)合力檢測結(jié)果顯示，ApisCSP2的結(jié)合譜最窄，只與順-3-己烯醇和乙酸葉醇酯有弱結(jié)合能力，Ki值分別為15.1±1.5和28.5±2.7 μmol/L，與另外6種揮發(fā)物不結(jié)合，IC50值均大于50 μmol/L；ApisCSP4結(jié)合譜中等，能夠強(qiáng)結(jié)合己酸己酯和香葉醇，Ki值分別為4.8±1.1和4.2±0.7 μmol/L，中等結(jié)合橙花叔醇，Ki值為5.8±0.8 μmol/L，與另外5種植物揮發(fā)物不結(jié)合，IC50值均大于50 μmol/L；ApisCSP5的結(jié)合譜最廣，與反-2-己烯醛、己酸己酯、香茅醇、順-3-己烯醇、香葉醇都能夠強(qiáng)結(jié)合，Ki值均小于5 μmol/L，與橙花叔醇結(jié)合力中等，Ki值為7.9±1.7 μmol/L，ApisCSP5不結(jié)合乙酸葉醇酯和芳樟醇，IC50大于50 μmol/L(圖6； 表2)。

圖6 重組蛋白ApisCSP2/4/5與植物揮發(fā)物的結(jié)合曲線

3 討論

本研究中，在轉(zhuǎn)錄組水平鑒定了10個豌豆蚜觸角CSP基因，通過半定量RT-PCR檢測和轉(zhuǎn)錄組RPKM值分析的方法進(jìn)行了基因表達(dá)量分析，對豌豆蚜觸角中高表達(dá)的3個CSP基因ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5進(jìn)行了體外表達(dá)和純化(圖3)，體外結(jié)合實驗表明，ApisCSP4與蚜蟲報警信息素主要組分EβF結(jié)合能力最強(qiáng)，Ki值為2.2±0.8 μmol/L(圖5; 表2)，另外ApisCSP4與蚜蟲報警信息素微量組分(-)-α-蒎烯也有著強(qiáng)結(jié)合能力，Ki值為4.9±0.7 μmol/L(圖5; 表2)，表明ApisCSP4可能是豌豆蚜識別報警信息素的主要蛋白，基于蚜蟲CSP4亞家族在不同蚜蟲之間的高度同源性(圖1)，推測在其他蚜蟲中CSP4蛋白也參與報警信息素的識別，在蚜蟲報警信息素通訊過程中起著同OBP3/7/9類似的運(yùn)輸功能(Wangetal., 2021)。而豌豆蚜的ApisCSP2和ApisCSP5沒有表現(xiàn)出與蚜蟲報警信息素主要組分EβF或微量組分強(qiáng)結(jié)合能力，ApisCSP2的結(jié)合譜非常窄，和測試的8種植物揮發(fā)物結(jié)合能力非常弱，表明其主要功能不是嗅覺功能，可能參與其他生理功能。

蚜蟲的性信息素從成熟雌性后足的脛節(jié)中釋放(Marsh, 1972; Pickett and Glinwood, 2007)，包括兩種組分(+)-(4aS,7S,7aR)-荊芥內(nèi)酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荊芥醇(Pickettetal., 1992; Dewhirstetal., 2008)，不同物種間這兩種組分的比例各不相同，在桃蚜中二者的比例為1∶1.5(Dawsonetal., 1990)。之前我們系統(tǒng)研究了蚜蟲的OBPs的體外功能，發(fā)現(xiàn)均不能夠結(jié)合上述兩種性信息素分子(Wangetal., 2021)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)豌豆蚜CSP5能夠與上述兩種性信息素組分強(qiáng)結(jié)合，Ki值分別為4.8±0.9和2.6±0.6 μmol/L(圖5；表2)，暗示ApisCSP5可能參與秋季有性生殖豌豆蚜性信息素釋放和識別的過程。同時，ApisCSP5在3個測定的CSPs中表現(xiàn)出最廣的結(jié)合譜，其也能夠同植物揮發(fā)物反-2-己烯醛、己酸己酯、香茅醇、順-3-己烯醇、香葉醇強(qiáng)結(jié)合，Ki值均小于5 μmol/L。表明ApisCSP5也同時參與蚜蟲的寄主識別或轉(zhuǎn)移過程。然而上述結(jié)果僅僅是基于體外功能測定，后續(xù)還需要通過活體功能測定如RNAi或基因編輯實驗確定ApisCSP4和ApisCSP5在蚜蟲報警信息素和性信息素通訊中的生物學(xué)功能。