徐彥召，宋會(huì)帥，王子龍，趙肖肖，王建威，李政良，胡建和，王 青

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

副豬嗜血桿菌?。℉aemophilus parasuisdisease）也稱格拉澤氏?。℅lasser's disease）。副豬嗜血桿菌病的病原為副豬嗜血桿菌（Hacmophius parasuis，HPS），屬巴斯德氏桿菌科嗜血桿菌屬，為革蘭氏陰性細(xì)菌，顯微鏡下形態(tài)呈小短桿至長絲狀。2020 年，經(jīng)過詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育分析，副豬嗜血桿菌被重新命名為Glaesserella parasuis[1-2]。臨床上該菌可感染仔豬和青年豬。發(fā)病豬表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎或腦膜炎等臨床癥狀，成年豬多表現(xiàn)為隱性感染[3-4]。HPS對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。目前，養(yǎng)殖企業(yè)依靠抗菌藥物治療該病。但因抗生素的不合理使用，HPS對臨床中常用的抗生素的耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重，抗生素殘留也是動(dòng)物性食品安全方面的重要隱患。自2020年7月1日起，我國已全面禁止在飼料中添加抗生素，力求養(yǎng)殖過程中減少使用抗生素，為社會(huì)提供安全、健康的動(dòng)物性食品[7-8]。因此，亟須研究新的預(yù)防與治療方法應(yīng)對副豬嗜血桿菌病。

本研究從豬場送檢的病料中分離得到1株HPS菌株，按照參考文獻(xiàn)[1]中報(bào)道的血清型鑒定方法對分離株進(jìn)行血清型鑒定，該菌株屬于血清7型HPS，為進(jìn)一步研究HPS致病機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料采自河南省南陽市某規(guī)模化豬場疑似感染HPS的病豬肺臟、胸腔積液。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）保存于河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：煙酰胺腺嘌呤二苷酸（NAD）、2×Taq PCR Master Mix、膠回收試劑盒、DNA Marker，均購自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆液體培養(yǎng)基（TSB）等相關(guān)的細(xì)菌培養(yǎng)基，均購自青島高科技園區(qū)海博生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：Trobot PCR 儀（Biometra 公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）、Quanta 200 掃描電子顯微鏡（FEI 公司）、SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、TG16-WS 離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、HITACHI-1010 離子濺射儀（日立公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的分離、純化培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

送檢的病豬肺臟、胸腔積液等病料經(jīng)表面消毒，于超凈工作臺中采用無菌操作，分別接種于含5%胎牛血清與1% NAD 的TSA 培養(yǎng)基（以下簡稱TSA 培養(yǎng)基），5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察分離細(xì)菌的菌落形態(tài)，挑取針尖大小、透明光滑的露珠狀可疑的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

將疑似HPS菌落的純培養(yǎng)物采用無菌PBS稀釋，分別接種于常見的細(xì)菌分離培養(yǎng)基（麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行初步分離鑒定，觀察分離細(xì)菌的生長狀況。

于TSA培養(yǎng)基挑取可疑菌落進(jìn)行細(xì)菌涂片、革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并將純化后的細(xì)菌命名為NY2020株。

1.3.2 分離細(xì)菌的衛(wèi)星試驗(yàn)

將上述分離菌株于TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，次日挑取單克隆于TSB液體培養(yǎng)基（含5%胎牛血清與1%NAD）中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

無菌條件下，蘸取對數(shù)生長期的NY2020 株菌液水平劃線于綿羊鮮血瓊脂平板上；將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌（ATCC25923）于分離株NY2020 垂直方向劃線，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h，觀察分離株NY2020與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)是否出現(xiàn)衛(wèi)星生長的現(xiàn)象。

1.3.3 分離細(xì)菌的生化試驗(yàn)

于超凈工作臺中，采用接種環(huán)取少量上述分離的細(xì)菌菌液接種于生化管中，向生化管中加入5 μL的NAD因子，采用液體石蠟密封細(xì)菌生化培養(yǎng)管，37 ℃恒溫培養(yǎng)

12～16 h，觀察細(xì)菌生化反應(yīng)管中的顏色變化。

1.3.4 分離細(xì)菌的PCR鑒定

將1.3.1 中分離純化得到的分離株NY2020 接種于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃250 r/min培養(yǎng)過夜；取少量接種于TSA固體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)過夜；挑取透明、露珠狀的單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃250 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以培養(yǎng)菌菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。

1.3.5 分離細(xì)菌的電鏡觀察

將1.3.1 中分離純化得到的分離株NY2020 接種于TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃250 r/min 培養(yǎng)過夜，3 000 r/min 離心收集菌體；菌體經(jīng)2.5%戊二醛固定、不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水（無水乙醇脫水2次）、叔丁醇再次干燥菌體、離子濺射儀噴金，于環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察分離株NY2020細(xì)菌的形態(tài)。

1.3.6 分離細(xì)菌血清型鑒定及其系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立

根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]報(bào)道的HPS血清型多重PCR鑒定方法，設(shè)計(jì)應(yīng)用于鑒定HPS 16S rRNA 的特異性鑒定引物HPS-UP或HPS-DP，結(jié)合目前國內(nèi)流行的HPS血清型，設(shè)計(jì)應(yīng)用于鑒定分離株血清型的一系列鑒定引物。

以純化的NY2020 株菌液為模板，采用HPS-UP 或HPS-DP 和HPS 血清型鑒定引物分別擴(kuò)增分離菌的16S rRNA 和funQ 基因，將得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，初步鑒定為陽性的樣品送往生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將所測得的分離株的funQ基因序列與NCBI中已登錄的其他HPS參考株的序列進(jìn)行同源比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的分離純化與形態(tài)觀察（見圖1）

由圖1（a）可知，將疑似HPS感染的豬病料樣品接種于TSA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h 后，可見半透明、針尖狀、露珠樣菌落。由圖1（b）可知，將分離菌進(jìn)行革蘭氏染色后，于普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察，菌體呈紅色，可初步判斷分離細(xì)菌為革蘭氏陰性菌；細(xì)菌呈短桿狀分散排列。

將分離菌接種于常見的細(xì)菌分離培養(yǎng)基（麥康凱培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基）中，細(xì)菌無法生長。初步判定該分離菌的形態(tài)及革蘭氏染色與HPS相符，將純化后的細(xì)菌命名為NY2020株。

圖1 分離株的菌落形態(tài)和染色鑒定Fig.1 Colony morphology and staining identification of isolated bacteria

2.2 分離株NY2020的衛(wèi)星試驗(yàn)鑒定結(jié)果（見圖2）

由圖2 可知，與金黃色葡萄球菌接近的分離株NY2020 的菌落較大，離金黃色葡萄球菌較遠(yuǎn)的分離株NY2020 的菌落較小，說明金黃色葡萄球菌在生長過程中可為分離株NY2020 提供必需的生長因子，符合HPS 細(xì)菌的生長特性。

圖2 分離株NY2020的衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Satellite growth phenomenon result of isolated strain NY2020

2.3 分離株NY2020的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果（見表1）

將分離菌株接種于含NAD 因子的生化微量鑒定管，5%CO237 ℃條件下培養(yǎng)24 h。生化特性表明，該分離菌無法分解硫化氫、乳糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、甘油醇、葡萄糖。

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中HPS的生長特性，該菌生化鑒定結(jié)果基本符合HPS菌的生化培養(yǎng)特征。

表1 分離株NY2020的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical test identification results of isolated strain NY2020

2.4 分離株NY2020的PCR及血清型鑒定（見圖3）

由圖3可知，采用HPS 通用型引物于821 bp處可以擴(kuò)增得到一條清晰的核酸條帶，采用7型HPS特異型性引物在490 bp 處可見一條清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，確定該分離株NY2020為血清7型HPS。

圖3 分離株NY2020的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of isolated strain NY2020

2.5 分離株NY2020的掃描電鏡觀察結(jié)果（見圖4）

由圖4可知，分離株NY2020經(jīng)固定、脫水、干燥、噴金處理，在掃描電子顯微鏡觀察下觀察細(xì)菌形態(tài)，菌體呈短桿、長桿狀。

圖4 分離株NY2020的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope observation results of isolated strain NY2020

2.6 分離株NY2020 16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析（見圖5）

由圖5 可知，分離株NY2020 16S rRNA 與GenBank 中HPS（登錄號：AY126705.1）序列的同源性為100%，與血清7型HPS AY126705.1株為同一分支，進(jìn)一步證實(shí)了該分離株NY2020為血清7型HPS。

圖5 分離株NY2020的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of isolated strain NY2020

3 討論

感染HPS 可導(dǎo)致感染豬出現(xiàn)食欲減退、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、鼻腔有分泌物排出、流產(chǎn)以及共濟(jì)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡；仔豬感染后可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)病，病死率高；急性發(fā)病康復(fù)后的仔豬有可能出現(xiàn)慢性關(guān)節(jié)炎等癥狀，嚴(yán)重影響豬后期的生長速度，延長豬的育肥周期，降低飼料轉(zhuǎn)化率，影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。HPS對營養(yǎng)要求相對較高，臨床中分離該菌相對較為困難。本研究對送檢樣品進(jìn)行初步的流行病學(xué)分析，并針對性地采用含有NAD 因子和胎牛血清的TSA培養(yǎng)基進(jìn)行HPS的分離，成功從送檢病料中分離得到1 株HPS。與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法相比，該分離方法降低了因HPS 生長緩慢而容易被其他雜菌競爭性抑制而造成分離失敗的風(fēng)險(xiǎn)，提高了HPS的分離效率。

HPS 具有多種血清型。傳統(tǒng)的HPS 血清型鑒定方法需要實(shí)驗(yàn)室中儲備各種血清型的標(biāo)準(zhǔn)樣品，加大了臨床中該菌的血清型鑒定難度，延長了鑒定時(shí)間[9-10]。本試驗(yàn)依據(jù)已報(bào)道的HPS PCR 鑒定方法[11]，參考當(dāng)前國內(nèi)流行的HPS 血清型，采用HPS 通用鑒定引物，確定所分離的細(xì)菌為HPS；采用血清型特異的鑒定引物進(jìn)行多重PCR，確定分離細(xì)菌的血清型。通過上述操作可快速鑒定所分離HPS的血清型，操作方法簡單且不易受外界條件的干擾。

HPS 主要有15 種血清型，其中以4、5、13 型HPS 最為常見。HPS不同血清型之間細(xì)菌的毒力不盡相同，3、6、7、9和11型為無毒力菌株，感染豬群后不會(huì)導(dǎo)致豬群產(chǎn)生臨床癥狀[12]。Ruiz等[13]研究發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌毒力與膜蛋白有關(guān)。抗生素是預(yù)防和治療HPS 感染以及各種細(xì)菌性疾病的常用手段，但因耐藥性和藥物殘留等問題，選擇適合的敏感藥物替代抗生素將成為主要策略。

疫苗預(yù)防仍然是預(yù)防傳染病最經(jīng)濟(jì)有效的手段，但目前主要研究的多為4型、5型、12型和13型滅活疫苗[14]。副豬嗜血桿菌血清型多且不同菌株毒力存在差異，尚無1種滅活菌苗同時(shí)可對所有的致病菌株產(chǎn)生交叉保護(hù)力。因此，研制具有交叉保護(hù)意義的HPS疫苗是預(yù)防和控制副豬嗜血桿菌病必然要求。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功分離并鑒定了一株血清7 型HPS，進(jìn)一步豐富了HPS的菌株資源，為研發(fā)具有交叉保護(hù)作用的HPS疫苗提供了素材。