于 花 晉海軍 張 嘉 朱 姍

（1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學中藥民族藥資源研究院，貴州 貴陽 550025）

川續(xù)斷（Dipsacus asperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai）為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬藥用植物，其干燥根具有補肝腎、強筋骨及續(xù)折傷的功效[1]。隨著續(xù)斷藥材市場需求的日益增加，導致其供不應求局面逐漸形成[2]。在貴州、湖北和云南等省出現(xiàn)了川續(xù)斷人工種植基地，但基地種源混雜、品種混亂，導致川續(xù)斷的種質退化問題日趨嚴重[3]。目前，選育品質優(yōu)良的川續(xù)斷種苗是解決其種質退化的關鍵，而植物組織培養(yǎng)技術則是解決育種過程中種苗快繁的有效途徑之一[4]。植物組織培養(yǎng)外植體的預處理是此類實驗成功的關鍵因素之一[5]，本研究擬通過對川續(xù)斷組織培養(yǎng)外植體消毒技術研究，獲得川續(xù)斷外植體消毒的最佳方式，為今后建立高效的川續(xù)斷組織培養(yǎng)體系提供技術資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究所用川續(xù)斷外植體（一年生葉）采自貴州中醫(yī)藥大學中草藥種質資源圃。

1.2 實驗方法 植物組培過程中，外植體預處理一般包括流水沖洗、75%酒精消毒和0.1%升汞消毒，而后切分外植體轉入培養(yǎng)基。

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 流水沖洗 將野外采集的川續(xù)斷葉片轉入網兜，分別用流水沖洗0.5 h、1 h、2 h、3 h 和4 h，而后用濾紙吸干葉片表面水分。用75%酒精浸泡10 s，再轉到0.1 %升汞中，15 min，然后用無菌蒸餾水沖洗4 次，轉入墊有濾紙的平皿（已消毒）將外植體切分成1.5 cm×1.5 cm 小塊，接入MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L的MS 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度（25± 1）℃，光照時間8 h/d，光照強度1500 Lux，濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱。40 d后統(tǒng)計愈傷誘導率（愈傷誘導率=愈傷外植體數(shù)/ 接種外植體總數(shù)×100%）。

1.2.1.2 75%酒精消毒 將流水沖洗2 h 的葉片用75%的酒精分別處理5 s、10 s、15 s、20 s、25 s，雙蒸水沖洗3 遍，轉入0.1%升汞消毒15 min。按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉入愈傷相應培養(yǎng)基誘導，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。

1.2.1.3 0.1%升汞消毒 將流水沖洗2 h，75%的酒精處理10 s 的葉片用雙蒸水沖洗3 遍，轉入裝有0.1%升汞的玻璃瓶，分別處理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min。雙蒸水沖洗3 遍，按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉入愈傷相應培養(yǎng)基誘導，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。

1.2.2 響應面試驗 以流水沖洗時間、75%酒精和0.1%升汞處理時間為因素，在單因素試驗的基礎上，每個因素設計3 個水平，以愈傷組織誘導率為響應值（見表1），用Design Expert V 8.0.6 軟件的Box-Behnken 實驗方案（見表2）進行響應面優(yōu)化。按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉入愈傷誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。40 d 后統(tǒng)計愈傷誘導率。

表1 不同預處理方式的Box-Behnken 試驗因素水平

表2 不同預處理方式的Box-Behnken 試驗

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 本實驗運用Design Expert V 8.0.6軟件的Box-Behnken 試驗設計模塊對川續(xù)斷愈傷組織誘導前的預處理方式進行優(yōu)化。

2 結果

2.1 單因素試驗結果 植物愈傷組織誘導過程中，實驗的預處理對降低外植體污染率，提高愈傷誘導率具有重要作用。在川續(xù)斷組培實驗預處理過程中，流水沖洗最佳時間為1 h，75%酒精最佳處理時間為10 s，0.1%升汞最佳處理時間為15 min。見圖1。

圖1 單因素試驗結果

2.2 響應面試驗結果 以流水沖洗時間（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞（C）消毒時間為因素，愈傷誘導率為響應值，構建二次回歸方程：愈傷誘導率=（95.11+4.57）×（A+3.00×B）+（1.69×C）-（1.41×A×B）-（9.67×A×C）-（1.99×B×C）-（34.17×A2）-（16.23×B2）-（3.80×C2）。

通過對回歸方程的顯著性分析（見表3），流水沖洗時間（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞消毒（C）時間對愈傷組織誘導的線性效應極顯著（P ＜0.01），不同因素對愈傷誘導的影響順序為：A＞B＞C，AB對愈傷誘導率的交互影響顯著，AC 及BC 對愈傷誘導率的交互影響極顯著。方程的預測模型顯著性水平P ＜0.000 1，說明方程模型極顯著；R2=0.998 8，失擬項（P ＝0.2606 ＞0.05）不顯著，表明模型具有較高可信度及擬合度，可用此方程替代實驗真實點，對愈傷誘導的預處理過程進行預測和分析。

表3 愈傷組織誘導的回歸方程顯著性檢驗及方差分析

依據(jù)不同預處理方式對愈傷誘導率的響應面分析，得到川續(xù)斷愈傷誘導的最佳預處理方式為：流水沖洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，預測得到愈傷誘導率為：98.6%。為驗證預測結果可靠性，在最佳預處理方式下，愈傷組織誘導率為95.32%，此誘導率與預測值的相對誤差為3.44%，說明此響應面優(yōu)化法得到的不同預處理方式真實可靠。見圖2。

圖2 不同預處理方式對愈傷誘導的響應面分析

3 討論

植物組培過程中預處理是影響整個組培過程的關鍵因素[6]，常用的外植體預處理方式流水沖洗、酒精消毒、肥皂水清洗、升汞消毒及青霉素鈉浸泡等方式[7]。宋微等[8]報道，鐵線蓮組培時，外植體流水沖洗1 h 效果較好。特有瀕危藥用植物羌活離體培養(yǎng)時，葉片的最佳滅菌方法就包含75%酒精處理10 s[9]。陳燦[10]對白芨進行組培研究時，發(fā)現(xiàn)0.1%升汞對外植體預處理15 min，消毒效果較好。本研究采用響應面優(yōu)化法，獲得川續(xù)斷葉片預處理最佳方式為：流水沖洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，本研究結果與上述文獻報道結果基本一致。

本研究篩選的川續(xù)斷組培最佳預處理方式，可為今后建立高效的川續(xù)斷快繁體系提供基礎資料。