鄭平 陳偉 鄭艷

[摘要] 目的 探討三甲胺-N-氧化物（TMAO）與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）炎癥中的關(guān)系及作用機(jī)制。方法 ELISA檢測來自2020年9—12月福州市中醫(yī)院心血管內(nèi)科的動脈粥樣硬化（AS）患者（n=36）與正常人（n=25）血漿中TMAO、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）的表達(dá)情況;采用不同梯度的TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥;通過CCK-8法檢測HUVECs細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)分析HUVECs細(xì)胞遷移;血管形成實(shí)驗(yàn)分析內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙;通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測各組HUVECs細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）水平;通過WB實(shí)驗(yàn)檢測RAS系統(tǒng)中血管緊張素原（AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、AngⅡ及血管緊張素受體（ATR）的表達(dá)。結(jié)果 相比于正常人，AS患者血漿中TMAO與AngⅡ高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;成功建立了不同梯度濃度的TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞的炎癥模型;TMAO干預(yù)后抑制細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性;TMAO能夠抑制HUVECs細(xì)胞的遷移能力;TMAO干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞血管成環(huán)數(shù)減少，環(huán)變小，抑制血管形成;TMAO干預(yù)后促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)，抑制eNOS的表達(dá);在TMAO干預(yù)下RAS系統(tǒng)中的AGT、ACE、ANGⅡ及ATR的表達(dá)水平均顯著升高。結(jié)論 TMAO能夠調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)誘導(dǎo)HUVECs炎癥。

[關(guān)鍵詞] 三甲胺-N-氧化物;RAS系統(tǒng);HUVECs炎癥;血管緊張素Ⅱ

[中圖分類號] R965? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0028-05

[Abstract] Objective To explore the relationship and mechanism of trimethylamine-N-oxide（TMAO） and renin-angiotensin system （RAS） in the inflammation of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods The expression of the plasma levels of TMAO and Angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in the atherosclerosis （AS） patients （n=36） and the healthy people （n=25） from the Department of Cardiovascular Medicine， Fuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital from September to December 2020 were detected by ELISA; different gradients of TMAO was used to interfere with HUVECs to induce inflammation; HUVECs proliferation was detected by CCK-8 method; Scratch test was used to analyze HUVECs migration; the dysfunction of endothelial cells was analyzed by angiogenesis assay; the levels of inflammatory factors， such as interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-18 （IL-18） and endothelial nitric oxide synthase （eNOS）， in each group of HUVECs were detected by ELISA; the expression of angiotensinogen （AGT）， angiotensin converting enzyme （ACE）， AngⅡ and angiotensin receptor （ATR） in the RAS system was detected by WB assay. Results Compared with the healthy people， TMAO and AngⅡ were highly expressed in the plasma of AS patients， and there were significant differences（P<0.05）; different gradient concentrations of TMAO were successfully established to interfere with the inflammation model of HUVECs; after TMAO intervention， cell proliferation was inhibited in a dose-dependent manner; TMAO was able to inhibit the migration ability of HUVECs; after the intervention of TMAO， the number of endothelial cell vascular loops was decreased and the loops became smaller， which inhibited the formation of blood vessels; after TMAO intervention， the expression of inflammatory factors IL-1β and IL-18 was promoted， and the expression of eNOS was inhibited; under the intervention of TMAO， the expression levels of AGT， ACE， ANGⅡ and ATR in the RAS system were significantly increased. Conclusion TMAO can regulate the RAS system to induce the inflammation of HUVECs.

[Key words] Trimethylamine-N-oxide ; RAS system; HUVECs inflammation; Angiotensin Ⅱ

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。既往研究已證實(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是促進(jìn)AS的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物三甲胺-N-氧化物（trimetrylamine oxide，TMAO）是促進(jìn)AS發(fā)生的一個(gè)新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)，TMAO通過膽汁酸途徑影響脂質(zhì)代謝[3];通過上調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成[4]，促進(jìn)AS斑塊發(fā)生。TMAO通過激活ROS-TXNIP-NLRP3炎性小體，抑制eNOS/NO合成[5]，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、遷移和粘附，導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥和功能障礙，促進(jìn)AS的早期病理過程[6]。此外，循環(huán)TMAO升高，會誘導(dǎo)HUVECs異常增殖和遷移受損，導(dǎo)致血管功能障礙和重構(gòu)，加速血管衰老[7]。AS患者中TMAO 水平升高，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥，增加AS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。

過去，將TMAO、RAS組分血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）單獨(dú)作為AS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，TMAO誘導(dǎo)AS血管炎癥反應(yīng)的機(jī)制是否與RAS系統(tǒng)有關(guān)，尚未見到報(bào)道。因此，本文將在HUVECs中探討TMAO與RAS的關(guān)系及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

36例AS患者與25例正常人血漿樣本來自2020年9—12月福州市中醫(yī)院心血管內(nèi)科;本研究經(jīng)福州市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)（批件號：2019-09-05-01）。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司;TMAO購自阿拉丁;Lipofectamine3000、LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent購自Invitrigen;DMEM-H培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin（10，000 U/mL）、Trypsin-EDTA （0.25%）、phenol red、L-Glutamine 200 mM（100×）、0.25%Trypsin-EDTA（1×）購自Gibco;優(yōu)質(zhì)胎牛血清FBS購自PAN biotech;PBS購自Hyclone;Qpcr Mix購自PROMEGA;彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量購自碧云天;BCA 蛋白濃度測定試劑盒（50T）、5×蛋白上樣緩沖液、Human eNOS ELISA KIT購自北京索萊寶科技有限公司;ECL發(fā)光試劑購自Thermo;NucleoZol購自基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司;Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購自Dojindo;Human IL-18 ELISA Kit、Human IL-1 beta ELISA Kit購自博士德生物;Corning matrigel basement membrane matrix購自Corning;Human Angiotensin Ⅱ（AngⅡ）ELISA kit購自SAB;人三甲基胺氧化物（TMAO）酶聯(lián)免疫分析購自上海酶免;GAPDH Monoclonal antibody、Angiotensinogen Polyclonal Antibody、ACE Polyclonal Antibody、ATR Polyclonal Antibody、Angiopoietin 2 Polyclonal Antibody購自Proteintech。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測AngⅡ濃度? 準(zhǔn)備好稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、空白和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，空白孔1孔。分別在相應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、空白和樣品稀度各50 μl。然后立即在每孔中加入50 μl的檢測試劑A。輕輕搖板，用封板器蓋住。37℃孵育1 h。各孔取1×洗滌液300 μl，靜置1～2 min。將孔板輕拍在吸水紙上，將所有孔中的剩余液體完全除去，共洗3次。在最后一次清洗后，將孔板倒置，用吸水紙吸干。每孔加檢測試劑B工作液100 μl。蓋上封板膜，37℃孵育1 h，清洗5次，甩孔中液體。每孔加90 μl底物溶液。用新的封板器蓋住。37°C孵育15～25 min（不超過30 min）。避光。隨著底物溶液的加入，液體會變藍(lán)。每孔加50 μl終止液，加入終止液后，液體會變黃。通過輕拍孔板的側(cè)面混合液體。擦拭孔板底部的水滴和指紋，確認(rèn)液體表面沒有氣泡，酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值。

1.2.2 ELISA法檢測TMAO濃度? 根據(jù)說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品 10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。將試劑盒中的洗滌液稀釋至1×后使用。板溫育后，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μl，空白孔除外，37℃溫育30 min，洗5次板。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min，每孔再加入50 μl終止液，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.3不同濃度TMAO干預(yù)HUVECs誘導(dǎo)炎癥

將培養(yǎng)至對數(shù)生長的HUVECs細(xì)胞消化后，接種于6孔板中，保持每孔中的細(xì)胞數(shù)量差不多，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待每孔細(xì)胞密度達(dá)到60%，每孔中分別加入0、100、200、300、400、600 mM的TMAO進(jìn)行干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將上述不同濃度TMAO干預(yù)的HUVECs細(xì)胞分別接種于不同的96孔板中，保持每孔中的細(xì)胞數(shù)量差不多，待每孔細(xì)胞密度為50%～70%時(shí)，分別在0、24、48、72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)向每孔細(xì)胞中加入10 μl 10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD450 nm處檢測各孔的吸光值。

1.5 Western-blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

收集細(xì)胞加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上靜置20 min，4℃，12 000 rpm離心20 min，取上清蛋白液于EP管中。BCA蛋白測定法檢測樣品總蛋白濃度，沸水變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%BSA，40 rpm搖床上室溫封閉2 h。封閉完后將NC膜放入裝有一抗的抗體雜交盒中，搖床4°C孵育過夜。第2天用TBST洗滌孵育好的NC膜，洗3次，每次10 min。清洗完畢后，將NC膜放入1∶5000稀釋的鼠二抗雜交盒中，水平搖床上室溫孵育2 h;如果室溫高同樣可適當(dāng)縮短時(shí)間。結(jié)束后，同樣用TBST洗3次，每次10 min。將NC膜平置于透明膜上，Thermo ECL試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面，暗處靜置3 min后去除膜上發(fā)光液，置于透明膜上。采用凝膠成像系統(tǒng)Versa DocTM imaging system發(fā)光檢測，收集條帶圖像。用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達(dá)的相對含量。

1.6內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)前1d提前把Matrigel基底膠4℃冰箱解凍，槍頭、96孔板預(yù)冷;吸取50 μl/孔Matrigel至96孔板中，整個(gè)操作盡量保持低溫環(huán)境（冰上進(jìn)行），不可以產(chǎn)生氣泡;37℃培養(yǎng)箱放置至少30 min，使試劑充分凝固，凝膠過程中進(jìn)行細(xì)胞消化處理;細(xì)胞以3×104/孔加入鋪有Matrigel的96孔板中，每孔100 μl的完全培養(yǎng)基，同樣注意別產(chǎn)生氣泡，槍頭不可觸碰到膠;37℃培養(yǎng)8 h（每隔一段時(shí)間觀察），選取最佳成管時(shí)間;在倒置顯微鏡下，以100×放大倍數(shù)觀察內(nèi)皮管形成效果，并隨機(jī)選取視野拍照保存。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力

將處于對數(shù)生長期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整懸液濃度為 3×105 cells/ml，24 h后，細(xì)胞能剛剛長滿單個(gè)小孔。在 ibidi 細(xì)胞插件的每孔中加入70 μl的細(xì)胞懸液，注意不要大力晃動培養(yǎng)皿，以防止細(xì)胞不均勻;當(dāng)所有細(xì)胞均貼壁且剛長滿時(shí)，用鑷子將傷口愈合插件提出，加入無血清培養(yǎng)基，0、24 h觀察傷口愈合情況。

1.8 ELISA法檢測HUVECS細(xì)胞干預(yù)后炎癥因子IL-1β、 IL-18、eNOS表達(dá)水平

收集細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液（用于ELISA）裂解細(xì)胞，離心取上清，-80℃保存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測炎癥因子IL-1β、IL-18、eNOS水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中高表達(dá)

TMAO與AngⅡ在AS患者和正常人血漿中的表達(dá)情況分別如圖1A、圖1B所示。AS患者血漿中的TMAO與AngⅡ的濃度均明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 TMAO能夠抑制HUVECs細(xì)胞的增殖

為了進(jìn)一步證明TMAO是否能影響AS的發(fā)生，建立了6個(gè)不同梯度濃度下的TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞的炎癥模型，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖情況。TMAO對HUVECs細(xì)胞的增殖影響情況見圖2。當(dāng)TMAO對HUVECs細(xì)胞的干預(yù)濃度為100 mM時(shí)，隨著干預(yù)時(shí)間的增加，HUVECs細(xì)胞的活性始終比TMAO的干預(yù)濃度為0 mM時(shí)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且TMAO的干預(yù)濃度越高，HUVECs細(xì)胞的活性越低，不同濃度下HUVECs細(xì)胞的活性均有顯著差異。

2.3 TMAO能夠抑制HUVECs細(xì)胞的遷移能力

不同TMAO干預(yù)濃度下HUVECs細(xì)胞的遷移情況見圖3。圖3A為細(xì)胞劃痕圖，在4種TMAO干預(yù)濃度下，HUVECs細(xì)胞生長24 h后，劃痕愈合面積最多的是無TMAO干預(yù)的細(xì)胞，其次是TMAO干預(yù)濃度為200 mM的細(xì)胞，而濃度為400 mM與600 mM時(shí)，劃痕愈合面積明顯較少。圖3B為劃痕愈合面積的量化圖。由此可知，當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為200 mM、400 mM、600 mM時(shí)劃痕愈合面積顯著小于TMAO干預(yù)濃度為0 mM時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01，P<0.01），且TMAO干預(yù)濃度越高細(xì)胞越難愈合。

2.4 TMAO的干預(yù)抑制了血管的形成

為了驗(yàn)證TMAO是否對血管形成產(chǎn)生影響，利用內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)觀察4種TMAO干預(yù)濃度下血管的形成情況（封三圖3）。當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為0 mM時(shí)，HUVECs細(xì)胞成環(huán)數(shù)較多，環(huán)較大，成環(huán)情況較好;當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為200 mM時(shí)，細(xì)胞成環(huán)數(shù)較少且環(huán)較小;當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為400 mM和600 mM時(shí)成環(huán)數(shù)明顯少于前兩組，且成環(huán)情況較差，TMAO的濃度越高越難形成血管。

2.5 TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞后促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），白細(xì)胞介素-18（IL-18）的表達(dá)，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達(dá)

利用ELISA法檢測不同TMAO干預(yù)濃度下HUVECs細(xì)胞中IL-1β、IL-18及eNOS濃度的表達(dá)情況見圖4。當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為400 mM和600 mM時(shí)，與無TMAO干預(yù)相比，HUVECs細(xì)胞中IL-1β濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;當(dāng)TMAO干預(yù)濃度為200 mM、400 mM和600 mM時(shí)，與無TMAO干預(yù)相比，HUVECs細(xì)胞中IL-18濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.001）;當(dāng)TMAO的干預(yù)濃度為200 mM、400 mM和600 mM時(shí)，與無TMAO干預(yù)相比，HUVECs細(xì)胞中eNOS濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.001）。

2.6 TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞后促進(jìn)RAS系統(tǒng)血管緊張素原（AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、AngⅡ和血管緊張素受體（ATR）的表達(dá)

為了探討TMAO與RAS系統(tǒng)的關(guān)系，利用WB實(shí)驗(yàn)檢測了TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞后RAS系統(tǒng)中AGT、ACE、AngⅡ和ATR的蛋白表達(dá)量。封三圖4為不同TMAO干預(yù)濃度下HUVECs細(xì)胞中AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白的表達(dá)情況。封三圖4A為WB結(jié)果圖，AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白印跡隨著TMAO干預(yù)濃度的增加而加深;封三圖4B為封三圖4A的量化圖，AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白的表達(dá)量隨著TMAO干預(yù)濃度的增加皆顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。

3 討論

AS是心血管疾病中主要的致死原因，其對人體的健康造成極大的威脅。AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由多種危險(xiǎn)因素共同作用引起，已有多項(xiàng)研究表明，代謝紊亂、免疫反應(yīng)、炎癥及內(nèi)皮功能障礙均能導(dǎo)致AS的發(fā)生，其中血管壁的慢性炎癥反應(yīng)是AS發(fā)生發(fā)展的主要因素[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，TMAO可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及促進(jìn)血管炎癥，從而引發(fā)AS的發(fā)生發(fā)展[10]，RAS系統(tǒng)是血壓調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的AngⅡ作為主要效應(yīng)分子參與AS的發(fā)展，但TMAO與RAS系統(tǒng)在AS中是否能夠相互影響還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中均高表達(dá)，說明TMAO與RAS系統(tǒng)可能共同影響AS的發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后會引發(fā)炎癥[11]、功能衰退，誘導(dǎo)白細(xì)胞向血管炎癥部位聚集[12]，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，是AS發(fā)病的重要因素之一[13]，因此本研究利用HUVECs細(xì)胞探討TMAO對內(nèi)皮功能障礙的影響。本研究構(gòu)建TMAO干預(yù)后的HUVECs細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)TMAO能夠抑制HUVECs細(xì)胞增殖、遷移及血管形成，且呈劑量依賴性抑制，說明TMAO能夠?qū)е卵軆?nèi)皮功能障礙，從而誘發(fā)AS，與Ma等[6]的研究結(jié)果一致。Sun等[5]首次證明TMAO可激活ROS-TXNIP-NLRP3炎癥小體從而誘導(dǎo)炎癥和內(nèi)皮功能障礙，炎癥小體的激活促進(jìn)了炎癥因子IL-1β與IL-18的表達(dá)，且抑制了內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的TMAO干預(yù)下的HUVECs細(xì)胞中的IL-1β與IL-18呈劑量性依賴顯著增加，eNOS的濃度則顯著下降，與上述研究者的研究結(jié)果一致，說明TMAO能夠誘導(dǎo)血管炎癥，且進(jìn)一步證明HUVECs細(xì)胞炎癥模型的成功構(gòu)建。因此在此基礎(chǔ)上本文利用該模型探討TMAO與RAS系統(tǒng)的關(guān)系。本研究通過WB檢測不同濃度TMAO干預(yù)后HUVECs細(xì)胞中AGT、ACE、AngⅡ和ATR的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示TMAO干預(yù)HUVECs細(xì)胞后促進(jìn)了RAS系統(tǒng)AGT、ACE、AngⅡ和ATR的表達(dá)，且有呈TMAO劑量依賴性增加的趨勢。有研究表明，AngⅡ作為RAS系統(tǒng)的末端活性產(chǎn)物也可促進(jìn)血管壁的炎癥反應(yīng)，而ACE的抑制劑能夠阻斷該系統(tǒng)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能得到改善，緩解了AS的發(fā)生[14];與TMAO一樣，RAS系統(tǒng)的激活也同樣會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[15]。結(jié)合本研究的結(jié)果可以說明TMAO能夠調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生炎癥。

綜上所述，TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中高表達(dá)預(yù)示著TMAO與RAS系統(tǒng)可能共同影響AS的發(fā)生發(fā)展，通過利用TMAO干預(yù)建立HUVECs細(xì)胞炎癥模型，驗(yàn)證了TMAO能夠抑制HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移以及血管的形成導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，且TMAO能夠促進(jìn)IL-1β與IL-18的表達(dá)，抑制eNOS的表達(dá)，說明TMAO能夠誘導(dǎo)血管炎癥。該模型中RAS系統(tǒng)AGT、ACE、AngⅡ和ATR蛋白表達(dá)量呈TMAO劑量依賴性增加，說明TMAO能夠調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生炎癥。而這兩者之間相互作用的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。聯(lián)合檢測TMAO和RAS可能更有助于AS的臨床評估，同時(shí)針對TMAO和RAS的治療策略或許是AS治療的一個(gè)新方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?徐銀川，陳曉鋒，Daugherty A，等. 腎素血管緊張素系統(tǒng)與動脈粥樣硬化[J].中華高血壓雜志，2017，25（6）： 511-512.

[2]? ?蔣小燕，段家懷.三甲胺-N-氧化物致動脈粥樣硬化機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華老年多器官疾病雜志，2019，18（2）：157-160.

[3]? ?王猛，鄧潔琳，孟冠南，等.腸道微生物與心血管疾病的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018， 24（18）：13-17，23.

[4]? ?何花花，連新福，唐智群.三甲胺-N-氧化物在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，42（8）：986-990.

[5]? ?Sun X，Jiao X，Ma Y，et al.Trimethylamine N-oxide induces inflammation and endothelial dysfunction in human umbilical vein endothelial cells via activating ROS-TXNIP-NLRP3 inflammasome[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，481（1-2）：63-70.

[6]? ?Ma G，Pan B，Chen Y， et al.Trimethylamine N-oxide in atherogenesis： Impairing endothelial self-repair capacity and enhancing monocyte adhesion[J].Biosci Rep，2017， 37 （2）：BSR2016 0244.

[7]? ?Ke Y，Li D，Zhao M，et al.Gut flora-dependent metabolite trimethylamine-N-oxide accelerates endothelial cell senescence and vascular aging through oxidative stress[J].Free Radic Biol Med，2018，116：88-100.

[8]? ?Senthong V，Li XS，Hudec T，et al.Plasma trimethylamine- N-oxide，A gut microbe-generated phosphatidylcholine metabolite，is associated with atherosclerotic burden[J].J Am Coll Cardiol，2016，67（22）：2620-2628.

[9]? ?何花花，連新福，唐智群.三甲胺-N-氧化物在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，42（8）：986-990.

[10]? Seldin MM，Meng Y，Qi H， et al.Trimethylamine N-oxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-κB[J].J Am Heart Assoc，2016，5（2）：e002 767.

[11]? Ross R.Atherosclerosis-An inflammatory disease[J].N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.

[12]? Mestas J，Ley K.Monocyte-endothelial cell interactions in the development of atherosclerosis[J].Trends Cardiovasc Med，2008，18（6）：228-232.

[13]? Antohe F.Endothelial cells and macrophages，partners in atherosclerotic plaque progression[J].Arch Physiol Bioc- hem，2006，112（4-5）：245-253.

[14]? 楊亞培.腎素過表達(dá)及聯(lián)合用藥對動脈粥樣硬化及斑塊炎癥影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

[15]? 梁俊清，孫士然，吳以嶺，等.疲勞應(yīng)激致血管內(nèi)皮功能障礙與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)變化的關(guān)系及通絡(luò)方藥的干預(yù)[J].中國病理生理雜志，2009，25（6）：1064-1069.

（收稿日期：2021-06-08）