吳國萍,胡辰辰,陸騰,吳元釗

(1.江蘇警官學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)系,南京 210031;2.江蘇省食品藥品與環(huán)境犯罪檢驗技術(shù)工程實驗室,南京 210031;3.中國科學(xué)院 計算機網(wǎng)絡(luò)信息中心高性能計算技術(shù)與應(yīng)用發(fā)展部,北京 100049;4.浙江警官學(xué)院 刑事技術(shù)系,浙江省毒品防控技術(shù)研究重點實驗室,杭州 310051)

可待因(C18H21NO3)屬于中樞性鎮(zhèn)咳劑,鎮(zhèn)咳效果顯著,長期使用會形成藥物耐受性,使人上癮,國家藥品監(jiān)督管理局明確禁止18歲以下青少年兒童使用可待因藥物。福爾可定(C23H30N2O4)屬于依賴性鎮(zhèn)咳劑,別名嗎啉嗎啡、?？啥?由嗎啡堿與氯化乙基嗎啡啉合成而來,具有成癮性和麻醉作用,雖國內(nèi)還沒有頒布相關(guān)的法律法規(guī),一些西方國家已經(jīng)禁止2歲以下兒童服用福爾可定鎮(zhèn)咳劑。一些不法分子利欲熏心,私自在非依賴性鎮(zhèn)咳劑中添加可待因和福爾可定以提高鎮(zhèn)咳劑的功效。因此,加強鎮(zhèn)咳劑中可待因和福爾可定的監(jiān)測具有重要意義。

可待因、福爾可定的測定以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1]、高效液相色譜法(HPLC)[2-4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[5]等實驗室檢測手段為主,快檢方法還有酶聯(lián)免疫法[6];近些年,拉曼光譜及表面增強拉曼光譜的研究方法發(fā)展迅速[7-26],但未見可待因、福爾可定的拉曼光譜及表面增強拉曼光譜相關(guān)研究報道。本工作首先通過密度泛函理論(DFT)方法對可待因、福爾可定進行幾何構(gòu)型優(yōu)化,為標準品粉末的拉曼譜圖及低濃度水平標準溶液的表面增強拉曼譜圖的振動模式的指認和歸屬提供理論依據(jù),并建立了這兩種管制藥品的表面增強拉曼檢測方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SSR-3010型便攜式拉曼光譜分析儀;RMX 型手持式拉曼光譜儀;85-2 型磁力攪拌器;Vortex 3000型渦旋振蕩器;HG202A-2 型電熱鼓風(fēng)干燥箱;Milli-Q Intergral 5型純水機;Ymnl-P10H 型超聲波清洗器;ME104E 型電子分析天平(感量0.1 mg)。

標準儲備溶液:1.000 g·L－1,分別將適量的可待因標準品、福爾可定標準品用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.000 g·L－1的標準儲備溶液,于－18 ℃保存。使用時用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

可待因標準品的純度96.9%,福爾可定標準品的純度96.9%;檸檬酸鈉、氯金酸、鹽酸、硝酸、甲醇、氫氧化鈉均為分析純;試驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器工作條件

1)SSR-3010型便攜式拉曼光譜儀 激光波長785 nm,功率275 m W,掃描范圍為175～3 200 cm－1,分辨率為4.5 cm－1;激光器的激光發(fā)射功率500 m W,分辨率6 cm－1,積分時間10 s,積分2次,平滑度為1。

2)RMX 型手持式拉曼光譜儀 激光波長785 nm,功率350 m W。

1.3 試驗方法

1.3.1 DFT 理論計算模擬

采用B3LYP/6-31G(d,p)混合基組對可待因、福爾可定體系進行幾何構(gòu)型優(yōu)化,計算了體系的結(jié)構(gòu)參數(shù)和拉曼光譜。使用VEDA4軟件對拉曼譜圖中特征峰的振動模式進行分析,將拉曼光譜的數(shù)據(jù)與VEDA4軟件分析的簡振模式數(shù)據(jù)結(jié)合,歸屬不同拉曼峰對應(yīng)的振動模式,找出不同拉曼峰的產(chǎn)生原因。上述所有計算運用Gaussian09軟件包完成。

1.3.2 拉曼光譜檢測標準品粉末

將可待因及福爾可定標準品粉末置于潔凈載物臺上,調(diào)節(jié)測試點,用RMX 型手持式拉曼光譜儀分別掃描可待因及福爾可定標準品粉末,獲取拉曼譜圖及相關(guān)試驗數(shù)據(jù)。

1.3.3 表面增強拉曼光譜檢測低濃度水平的標準溶液

采用檸檬酸鈉加熱還原的方法[27-29]制得納米金表面增強試劑,方法如下:移取1%(質(zhì)量分數(shù))氯金酸溶液2.00 mL,置于裝有100 mL磁石和水的燒杯中,將溶液加熱至沸騰,在磁力攪拌下于100℃加入1%(質(zhì)量分數(shù))檸檬酸鈉溶液4 mL,溶液開始變黑,約1 min 變藍,之后再加熱,出現(xiàn)紅色。煮沸2～3 min,溶液呈透明的酒紅色,繼續(xù)加熱攪拌5 min左右,關(guān)閉磁力攪拌器,冷卻至室溫。將溶液放入棕色瓶中避光保存,得膠體金溶液,即為納米金表面增強試劑。

調(diào)節(jié)被測溶液與納米金表面增強試劑體積比、助劑種類(鹽酸、硝酸)與用量、混合時間等檢測條件,用SSR-3010型便攜式拉曼光譜儀檢測,確定最佳表面增強拉曼光譜檢測條件:被測溶液100μL、納米金表面增強試劑200μL、助劑16.7%(體積分數(shù))硝酸溶液(即硝酸與水的體積比為1∶5)20μL、均勻混合10 s。

1.3.4 表面增強拉曼光譜定量檢測方法摸索

以100 mg·L－1可待因、福爾可定標準溶液為母液,配制質(zhì)量濃度均為10,20,30,40,50,60,70,80,90,100 mg·L－1的可待因、福爾可定標準溶液系列,按1.3.3節(jié)中確定的最佳條件進行系列表面增強拉曼光譜檢測,以探討其定量分析的可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子的幾何構(gòu)型

可待因、福爾可定的結(jié)構(gòu)如圖1 所示。應(yīng)用B3LYP/6-31G(d,p)混合基組對可待因、福爾可定進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計算,優(yōu)化后的分子構(gòu)型如圖2所示,在結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)虛頻的存在,說明優(yōu)化得到的分子結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的。為了能詳細表達分子的振動頻率,對分子中每個原子前面加數(shù)字編號,如1C表示1號碳原子,8H 表示8號氫原子。

圖1 可待因和福爾可定的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of codeine and pholcodine

圖2 優(yōu)化后的分子構(gòu)型Fig.2 Optimized molecular configurations

2.2 可待因與福爾可定拉曼譜圖解析

由圖1和圖2可知,可待因和福爾可定的結(jié)構(gòu)大體相似,均為嗎啡類似物,都具有左旋光性,福爾可定比可待因多一個1,4-氧氮六環(huán)(嗎啡啉)。圖3(a)從上而下分別是可待因DFT 理論計算模擬拉曼光譜圖(簡稱DFT)、標準品粉末實測所得拉曼光譜圖(簡稱EXP)及低濃度水平標準溶液的表面增強拉曼光譜圖(簡稱SERS);圖3(b)從上而下分別是福爾可定的DFT、EXP和SERS圖。

由圖3(a)和圖3(b)中DFT 圖可知:可待因DFT理論模擬主要特征峰位于288.00,376.00,424.00,496.00,624.00,656.00,688.00,888.00,1 072.00,1 136.00,1 192.00,1 240.00,1 280.00,1 304.00,1 360.00,1 400.00,1 496.00,1 536.00,1 632.00,1 664.00,1 688.00 cm－1等處;福爾可定比可待因多了1,4-氧氮六環(huán)(嗎啡啉)結(jié)構(gòu),但可待因分子結(jié)構(gòu)中也包含C－O、C－C 和C－N 等表征1,4-氧氮六環(huán)(嗎啡啉)結(jié)構(gòu)的主要鍵,因此福爾可定DFT 理論模擬拉曼光譜主要特征峰與可待因基本一致,主要特征峰位于280.00,322.00,344.00,432.00,632.00,784.00,864.00,952.00,1 032.00,1 080.00,1 120.00,1 168.00,1 184.00,1 232.00,1 248.00,1 304.00,1 336.00,1 376.00,1 488.00,1 520.00,1 632.00,1 672.00,1 688.00,1 696.00 cm－1等處,福爾可定在784.00,1 032.00 cm－1處的特征峰比可待因明顯。

圖3 典型拉曼光譜圖Fig.3 Typical Raman spectra

由圖3(a)和圖3(b)中EXP 圖可知:可待因和福爾可定標準品粉末實際檢測的拉曼光譜圖特征峰也是基本一致,但福爾可定特征峰的拉曼強度整體上大于可待因;可待因在911.10 cm－1處的特征峰拉曼強度明顯高于福爾可定,福爾可定在775.78 cm－1和1 042.88 cm－1處的特征峰拉曼強度明顯不同于可待因,這可能是由于它們具體化學(xué)環(huán)境不同產(chǎn)生的。

由圖3(a)和圖3(b)中SERS圖可知:可待因和福爾可定直接進行拉曼檢測時,拉曼效應(yīng)非常弱,加入納米金表面增強試劑后,400～1 800 cm－1附近分子整體的各種振動強度增強數(shù)個數(shù)量級,這可以理解為物理增強占主導(dǎo)的表面增強試劑對基底附近分子有增強的表現(xiàn)?？纱蛟?55.50,530.13,596.00,814.00,936.67,1 263.02,1 435.18,1 595.26 cm－1等處的特征峰拉曼增強效果明顯;福爾可定在355.50,530.13,628.58,816.60,1 251.41,1 444.02,1 601.59 cm－1等處的特征峰拉曼增強效果明顯。

根據(jù)圖3對可待因和福爾可定分子的拉曼光譜圖進行振動模式與振動峰歸屬分析,結(jié)果見表1。

表1 可待因、福爾可定理論計算與實測拉曼光譜的特征峰波數(shù)與歸屬Tab.1 Theoretical and experimental wavenumbers of characteristic peaks and their assignments of codeine and pholcodine

由表1可知,實測的拉曼光譜吸收峰和表面增強拉曼光譜吸收峰主要集中在300～2 000 cm－1內(nèi),而2 000 cm－1之后的理論計算值中出現(xiàn)的峰都被較大的削弱了,如O－H、N－H 極性鍵在3 000 cm－1以上的特征峰幾乎均消失。由圖3和表1可知,大部分特征峰(如苯環(huán)的振動等)拉曼位移理論計算值、標準品實測值、表面增強實測值三者基本是一致的,但會有一定程度的藍移和紅移;可待因標準品粉末直接拉曼檢測在1630.06,1 451.67,1 349.39,1 065.11,976.69 cm－1等處產(chǎn)生的特征吸收峰,在表面增強拉曼檢測時藍移至1 595.26,1 435.18,1 327.28,1 026.35,936.67 cm－1等處;福爾可定標準品粉末直接拉曼檢測在1 624.10,1 469.52,1 341.07,1 042.88,944.17 cm－1等處產(chǎn)生的特征吸收峰,在表面增強拉曼檢測時藍移至1 601.59,1 444.02,1 327.28,1 026.35,936.67 cm－1等處。

2.3 表面增強拉曼檢測條件優(yōu)化及測定下限

調(diào)節(jié)被測溶液與納米金表面增強試劑體積比、助劑種類(鹽酸、硝酸)與用量、混合時間等檢測條件,用SSR-3010型便攜式拉曼光譜儀檢測,確定最佳表面增強拉曼光譜檢測條件,如1.3.3節(jié)中所示。在此條件下,對質(zhì)量濃度在1～100 mg·L－1內(nèi)的可待因、福爾可定標準溶液系列進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),質(zhì)量濃度低于10 mg·L－1時,可待因、福爾可定的特征峰拉曼強度減弱或消失比較明顯。圖4為質(zhì)量濃度為10,100 mg·L－1的可待因、福爾可定標準溶液的表面增強拉曼比對譜圖。

圖4 10,100 mg·L－1的可待因和福爾可定標準溶液的表面增強拉曼光譜圖Fig.4 SERS spectra of 10,100 mg·L－1 codeine and pholcodine standard solutions

結(jié)果表明:100 mg·L－1的可待因拉曼譜圖各特征峰(355.50,530.13,596.00,631.29,698.37,814.00,936.67,1 263.02,1 327.38,1 435.18,1 513.97,1 595.26 cm－1)明顯;當可待因質(zhì)量濃度降低至 10 mg·L－1時,698.37,814.00,1 327.38 cm－1等處的特征峰消失;繼續(xù)降低可待因質(zhì)量濃度,特征峰消失的更為明顯。同理,100 mg·L－1的福爾可定拉曼譜圖各特征峰(355.50,527.36,598.72,628.58,798.42,816.60,936.67,1 251.41,1 327.38,1 441.82,1 601.59 cm－1)明顯;當福爾可定質(zhì)量濃度降低至10 mg·L－1時,雖然特征峰都能完整顯現(xiàn)出來,但是拉曼強度大大降低;繼續(xù)降低福爾可定的質(zhì)量濃度,福爾可定的拉曼光譜圖特征峰不再明顯,甚至消失。因此,在此檢測條件下,可待因、福爾可定的測定下限為10 mg·L－1。

2.4 可待因及福爾可定定量檢測可行性探析

2.4.1 標準曲線

拉曼表面增強過程實際影響因素相當復(fù)雜,由于各基團所處化學(xué)環(huán)境不同,表面增強過程中各特征峰值強度隨各濃度點變化情況各不相同,往往某一波數(shù)處的特征峰值強度與該濃度點線性關(guān)系不明顯,因此本工作在系列數(shù)據(jù)定量分析處理過程中,尋找相對合適的兩波數(shù)(波數(shù)1和波數(shù)2),以波數(shù)1與波數(shù)2 強度比作為相對強度,進行線性分析可行性探討。按1.3.3節(jié)中確定的最佳表面增強拉曼光譜檢測條件,對可待因、福爾可定標準溶液系列進行檢測?？纱?、福爾可定標準溶液系列的表面增強拉曼圖譜如圖5所示。

圖5 可待因和福爾可定標準溶液系列的表面增強拉曼光譜圖Fig.5 SERS spectra of codeine and pholcodine standard solution series

經(jīng)大量數(shù)據(jù)對比,確定可待因的波數(shù)1為631.29 cm－1,波數(shù)2為1 595.26 cm－1;福爾可定的波數(shù)1為628.58 cm－1,波數(shù)2為1 251.41 cm－1。以可待因、福爾可定的質(zhì)量濃度為橫坐標,特征峰強度比值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:可待因、福爾可定標準曲線的線性范圍均為40～100 mg·L－1,其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)Tab.2 Linearity parameters

2.4.2 精密度和回收試驗

以體積比為1∶1的甲醇-水混合液作為空白基質(zhì),在空白基質(zhì)中添加可待因、福爾可定標準儲備溶液,配制成加標量為50 mg·L－1的樣品溶液,再進行回收試驗。每個樣品按1.3.3節(jié)中確定的最佳表面增強拉曼光譜檢測條件平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明,可待因和福爾可定的回收率分別為99.0%～105%,102%～104%,RSD分別為5.3%,5.9%,說明所建立的方法精密度、準確度可滿足拉曼快速檢測需求。

由于表面增強拉曼光譜在增強過程中具有一定的偶然性,整體的可待因和福爾可定的線性關(guān)系不是很明顯,因此本工作只是對可待因及福爾可定在一定的范圍內(nèi)進行線性關(guān)系可行性探討,如果要深入探究可待因及福爾可定的定量檢測可行性還需進一步研究。

本工作探析了可待因及福爾可定標準品粉末拉曼光譜特征峰的形成原因,并在最佳條件下,對樣品測定下限進行摸索,同時研究了可待因和福爾可定低濃度水平系列標準溶液的表面增強拉曼檢測效果。試驗數(shù)據(jù)表明,可待因、福爾可定的測定下限為10 mg·L－1;可待因在631.29 cm－1和1 595.26 cm－1波數(shù)處、福爾可定在628.58 cm－1和1 251.41 cm－1波數(shù)處的特征峰強度比值,與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度(40～100 mg·L－1)有相對較好的線性關(guān)系。當質(zhì)量濃度低于40 mg·L－1時,線性關(guān)系不再明顯,同時當可待因及福爾可定濃度高于100 mg·L－1時,濃度達到飽和,也不再具有良好的線性關(guān)系?？纱蚝透柨啥ǖ谋砻嬖鰪娎鼫y定方法的建立,為這兩種管制藥品提供了拉曼檢測的理論依據(jù)和快檢支持。